專利名稱：最佳酶制劑應(yīng)用體系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于飼料添加劑領(lǐng)域。特別涉及飼用復(fù)合酶制劑的定量和個(gè)性化應(yīng)用。
背景技術(shù)：
酶制劑在飼料中添加和應(yīng)用是生物技術(shù)在飼料工業(yè)中應(yīng)用最受關(guān)注的領(lǐng)域。從20 世紀(jì)50年代酶制劑開始在飼料中添加，到90年代飼用酶制劑的普遍應(yīng)用，酶制劑在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中的作用日益突出。同時(shí)，調(diào)查顯示全球所有單胃動物飼料中只有10%添加了酶制劑， 并且豬料中酶制劑的使用量遠(yuǎn)低于禽料中酶制劑的添加量。現(xiàn)有的研究資料顯示，影響飼用酶快速發(fā)展的原因主要有兩個(gè)一是單項(xiàng)酶制劑評估體系的標(biāo)準(zhǔn)化；二是復(fù)合酶制劑應(yīng)用體系的建立。目前，關(guān)于飼用酶的研究報(bào)道很多，但大多集中在飼用酶作用機(jī)理和動物飼養(yǎng)效果的研究上，很少涉及飼用酶的活性評估，僅有的報(bào)道也是著重于不同測定方法對飼用酶活性的影響，而對于影響其催化活性和穩(wěn)定性(有效酶活，Effective Activity)的研究資料很少。陸文清和李德發(fā)000 認(rèn)為飼用酶的品質(zhì)評定和選擇涉及很多因素，遠(yuǎn)比普通工業(yè)用酶復(fù)雜。對于飼用酶，由于飼料原料、飼料加工和動物消化道PH值的多樣性，使得酶制劑的評估和選擇成為一個(gè)復(fù)雜的工程。Sh印py (2004)認(rèn)為飼用酶發(fā)展緩慢的原因是因?yàn)轱曈妹冈谑褂眠^程中受到如下薄弱環(huán)節(jié)的制約——標(biāo)準(zhǔn)化、公開有效的質(zhì)量控制體系、良好的熱穩(wěn)定性、更加準(zhǔn)確的液體應(yīng)用系統(tǒng)，較為明確的技術(shù)信息公示，以及使生產(chǎn)性能反應(yīng)更加一致的產(chǎn)品。歐盟最先頒布了飼料中禁止使用某些抗生素作為促生長劑的規(guī)定，這個(gè)決定迫使飼料生產(chǎn)企業(yè)不得不開始尋找抗生素的替代品，而在飼料中添加酶制劑成為各飼料企業(yè)的首選。但事實(shí)并未象人們所期望的那樣，酶制劑在單胃動物飼料特別是在豬飼料中的使用并不廣泛。主要原因可能是在添加酶制劑以后，原來的飼料數(shù)據(jù)庫和動物營養(yǎng)需要參數(shù)并不適合實(shí)際情況(馮定遠(yuǎn)和沈水寶，2005)，從而導(dǎo)致酶制劑添加效果不明顯或添加成本過高。他們認(rèn)為飼料在添加酶制劑后，現(xiàn)有的飼料原料數(shù)據(jù)庫甚至飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)可能不完全適合使用酶制劑的日糧配方設(shè)計(jì)。因而如何確定添加特定酶制劑后飼料原料的有效營養(yǎng)值 (Effective Nutrient Value)成為解決酶制劑有效利用的限制步驟。

發(fā)明內(nèi)容
一種最佳酶制劑應(yīng)用體系(OEATM)，其特征在于，包括兩方面的內(nèi)容有效酶活評估和有效營養(yǎng)值評估。有效酶活評估包括6個(gè)指標(biāo)標(biāo)示酶活、pH閾值、過胃酸測定、過蛋白酶測定、耐高溫測定、三個(gè)月酶活存留率；有效營養(yǎng)值評估包括4個(gè)指標(biāo)飼料粘度測定、飼料能值測定、 飼料蛋白質(zhì)消化率測定、動物生長表現(xiàn)。標(biāo)示酶活的測定方法為取一定量酶樣品溶液，用pH 5.5的0. lmol/L的 NaAc-HAc緩沖溶液溶解后定容至IOOmL,然后根據(jù)酶活將樣品溶液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，使稀釋好的待測酶液中酶活力控制在0. 04-0. 08U/mL之間；再將稀釋好的酶液和配制好的底物溶液在37°C水浴30min后，加DNS試劑終止酶的反應(yīng)，沸水浴5min，冷卻定容；標(biāo)準(zhǔn)空白調(diào)零， 用分光光度計(jì)在MOnm下測定吸光值，最后根據(jù)吸光值計(jì)算酶活。pH閾值測定方法為將單酶用不同PH值緩沖液溶解，測定其活性，測定酶活結(jié)果與原始酶活相比，得到其在不同PH值條件下的酶活表現(xiàn)(％ )；不同PH值緩沖液梯度設(shè)置為2. 0,2. 5,3. 0,3. 5,4. 0,4. 5,5. 0,5. 5,6. 0,6. 5,7. 0 ；也可根據(jù)不同動物消化道不同消化位點(diǎn)的消化液PH值而設(shè)定。過胃酸測定方法為將單酶用不同PH值緩沖液在37°C條件下處理1.紐或池后測定其活性，測定酶活結(jié)果與標(biāo)示酶活相比，得到其酶活性存留率(％)；不同PH值緩沖液梯度設(shè)置為2. 0,2. 5,3. 0,3. 5 ；以此可得到胃中酸性環(huán)境對酶樣品活性的破壞程度(％ )。過蛋白酶測定方法為配制單酶樣品溶液，取等量的酶液和胃蛋白酶液及胰酶溶液在37°c條件下水浴2_4h，之后將經(jīng)過蛋白酶處理的單酶樣品溶液按照單項(xiàng)酶制劑酶活測定方法測定其酶活，測定酶活結(jié)果與標(biāo)示酶活相比，得到其酶活性存留率(％ )，以此確定外源酶制劑對蛋白酶的耐受性。耐高溫測定方法為測定酶樣品的水分含量，根據(jù)酶樣品中水分含量通過加蒸餾水調(diào)節(jié)待測酶樣品中的水分至16%，然后在烘箱中放置一定時(shí)間后取出冷卻備用，烘箱溫度設(shè)置為65°C、75°C、85°C、9(TC、95°C等5個(gè)溫度梯度；通過單酶酶活測定方法測定酶活力，測定不同溫度處理后酶樣品活性與標(biāo)示酶活相比，得到其酶活存留率(％ )，以此可評估酶樣品的耐高溫性(％)。三個(gè)月酶活存留率測定方法為酶制劑從生產(chǎn)之日起開始計(jì)算，常溫貯存三個(gè)月后再取樣，按照酶制劑酶活測定方法測定酶活，結(jié)果與標(biāo)示酶活相比，得到其三個(gè)月常溫貯存后的酶活存留率(％)。飼料粘度測定和飼料能值測定方法為準(zhǔn)確稱取1. 25g粉碎飼料樣品于三角瓶中，所述粉碎飼料過Imm篩，分別加入不同梯度外源酶制劑后，再加入lmg/mL新鮮胃蛋白酶鹽酸溶液，所述胃蛋白酶鹽酸溶液為0. IN并且pH = 2. 0，在40°C恒溫水浴鍋中振蕩，消化時(shí)間為池；胃消化階段結(jié)束后，向溶液中加入ImL新鮮胰酶溶液，所述胰酶溶液為5mg/mL， 調(diào)節(jié)溶液PH值為6. 5 (1M NaOH溶液)，于40°C恒溫水浴中振蕩，消化時(shí)間為4h ；同時(shí)以未加酶飼料為對照組，進(jìn)行同樣的消化程序；體外消化結(jié)束后，將試管取出于3000g離心15min， 取上清液測定其粘度；消化殘?jiān)诤嫦渲泻嬷梁阒兀瑴y定其能量；飼料粘度變化(％ )=加酶組食糜粘度/對照組食糜粘度*100 ；飼料能值變化(％ )=加酶組消化能/對照組消化能 *100?；陲曈妹钢苿┰u估和應(yīng)用中的問題，我們提出了最佳酶制劑應(yīng)用體系(0ΕΑ ) 的概念。該體系的核心有兩點(diǎn)通過對有效酶活和加酶飼糧有效營養(yǎng)值的評估，達(dá)到酶制劑合理配比和定量添加的目的。0ΕΑ 體系綜合評估全球單酶的有效酶活，針對飼料配方、飼料加工過程和動物消化生理特點(diǎn)進(jìn)行有效營養(yǎng)值的評估，提供定量的個(gè)性化復(fù)合酶制劑方案。0ΕΑ 體系可以解構(gòu)為六大方面1. 0ΕΑ 是“最佳酶制劑應(yīng)用體系”的英文縮寫，即Optimum Enzyme Application, 是飼用復(fù)合酶定量的、個(gè)性化、動態(tài)方案；
2. 0ΕΑ 是根據(jù)目標(biāo)動物消化生理特點(diǎn)、飼料加工工藝和飼料中NSP種類與含量制定的定量的、個(gè)性化、動態(tài)方案；3. 0ΕΑ 是在四個(gè)數(shù)據(jù)庫基礎(chǔ)上制定的定量的、個(gè)性化、動態(tài)方案四個(gè)數(shù)據(jù)庫分別是有效酶活數(shù)據(jù)庫、抗?fàn)I養(yǎng)因子數(shù)據(jù)庫、產(chǎn)品試驗(yàn)數(shù)據(jù)庫、同類產(chǎn)品數(shù)據(jù)庫；4. 0ΕΑ 包括兩方面的內(nèi)容有效酶活評估和有效營養(yǎng)值評估；5.有效酶活評估包括6個(gè)指標(biāo)標(biāo)示酶活、pH閾值、過胃酸測定、過蛋白酶測定、耐高溫測定、三個(gè)月酶活存留；有效營養(yǎng)值評估包括4個(gè)指標(biāo)飼料粘度測定、飼料能值測定、飼料蛋白質(zhì)消化率測定、動物生長表現(xiàn)；6. 0ΕΑ 是為解決復(fù)合酶應(yīng)用中出現(xiàn)的六大問題而制定的定量的個(gè)性化方案，即 有效酶活評估不清晰、有效營養(yǎng)值模糊、針對性不強(qiáng)、添加不定量、效果不明顯、成本不經(jīng)濟(jì)。


圖1為pH值對木聚糖酶活性的影響；圖2為飼料調(diào)質(zhì)模擬條件對木聚糖酶的影響；圖3為胃蛋白酶/胰酶對木聚糖酶活性的影響；圖4為木聚糖酶對小麥和豆粕粘度的影響。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明主要有兩個(gè)內(nèi)容有效酶活評估、有效營養(yǎng)值評估。1.有效酶活評估(1)酶制劑標(biāo)示酶活測定取一定量酶樣品溶液，用pH 5. 5的0. lmol/L的NaAc-HAc緩沖溶液溶解后定容至 lOOmL，然后根據(jù)酶活將樣品溶液稀釋適當(dāng)倍數(shù)(最好使稀釋好的待測酶液中酶活力能控制在0. 04-0. 08U/mL之間)。再將稀釋好的酶液和配制好的底物溶液在37°C水浴30min后， 加DNS試劑終止酶的反應(yīng)，沸水浴5min，冷卻定容。標(biāo)準(zhǔn)空白調(diào)零，用分光光度計(jì)在540nm 下測定吸光值，最后根據(jù)吸光值計(jì)算酶活。(2)酶制劑pH閾值測定將單酶用不同pH值緩沖液溶解，測定其活性，測定酶活結(jié)果與原始酶活相比，得到其在不同PH值條件下的酶活表現(xiàn)(％ )。一般情況下不同pH值緩沖液梯度設(shè)置為2. 0、 2. 5,3. 0,3. 5,4. 0,4. 5,5. 0,5. 5,6. 0,6. 5,7. 0 ；同時(shí)也可根據(jù)不同動物消化道不同消化位點(diǎn)的消化液PH值而設(shè)定。(3)酶制劑耐酸性測定(過胃酸測定)將單酶用不同pH值緩沖液在37°C條件下處理1. 5h或池后測定其活性，測定酶活結(jié)果與標(biāo)示酶活相比，得到其酶活性存留率(％)。一般情況下不同PH值緩沖液梯度設(shè)置為2.0、2.5、3.0、3.5。以此可得到胃中酸性環(huán)境對酶樣品活性的破壞程度(％)。(4)酶制劑對胃蛋白酶/胰酶的耐受性(過蛋白酶測定)
配制單酶樣品溶液，取等量的酶液和胃蛋白酶液及胰酶溶液在37°C條件下水浴 2_4h。之后將經(jīng)過蛋白酶處理的單酶樣品溶液按照單項(xiàng)酶制劑酶活測定方法測定其酶活， 測定酶活結(jié)果與標(biāo)示酶活相比，得到其酶活性存留率(％)。以此確定外源酶制劑對蛋白酶的耐受性。(5)飼料調(diào)質(zhì)過程對酶制劑活性的影響(耐高溫測定)測定酶樣品的水分含量，根據(jù)酶樣品中水分含量通過加蒸餾水調(diào)節(jié)待測酶樣品中的水分至16% (實(shí)際調(diào)質(zhì)和制粒時(shí)配合飼料通入蒸汽后的濕度)，然后在烘箱中(溫度一般設(shè)置為651、751、851、901、951等5個(gè)溫度梯度)放置一定時(shí)間后取出冷卻備用。通過單酶酶活測定方法測定酶活力，測定不同溫度處理后酶樣品活性與標(biāo)示酶活相比，得到其酶活存留率(％ )。以此可評估酶樣品的耐高溫性(％ )。(6)三個(gè)月酶活存留率測定酶制劑從生產(chǎn)之日起開始計(jì)算，常溫貯存三個(gè)月后再取樣，按照酶制劑酶活測定方法測定酶活，結(jié)果與標(biāo)示酶活相比，得到其三個(gè)月常溫貯存后的酶活存留率(％ )。2.有效營養(yǎng)值評估操作方法根據(jù)Bedford和Classen (1993)的方法稍作修改。具體操作如下準(zhǔn)確稱取1.25g粉碎(過Imm篩)飼料樣品于三角瓶中，分別加入不同梯度外源酶制劑后，再加入lmg/mL新鮮胃蛋白酶鹽酸溶液(0. IN, pH = 2. 0)，在40°C恒溫水浴鍋中振蕩，消化時(shí)間為池。胃消化階段結(jié)束后，向溶液中加入ImL新鮮胰酶溶液(5mg/mL)，調(diào)節(jié)溶液pH值為 6. 5(1M NaOH溶液)，于40°C恒溫水浴中振蕩，消化時(shí)間為4h。同時(shí)以未加酶飼料為對照組， 進(jìn)行同樣的消化程序。體外消化結(jié)束后，將試管取出于3000g離心15min，取上清液測定其粘度。消化殘?jiān)诤嫦渲泻嬷梁阒兀瑴y定其能量。粘度變化(％ )=加酶組食糜粘度/對照組食糜粘度*100 (飼料粘度測定)能量變化(％ )=加酶組消化能/對照組消化能*100 (飼料能值測定)例證下面以酶活相同的兩種木聚糖酶(A 2. 40X 105U/g，B :2. 37X 105U/g)為例，闡釋 0ΕΑ 體系中“有效酶活”評估的必要性和重要性，以此說明0ΕΑ 體系的優(yōu)點(diǎn)。1.酶活單位定義酶活單位定義采用國際標(biāo)準(zhǔn)，即在pH5. 5和37°C條件下，每分鐘內(nèi)從燕麥木聚糖底物溶液(SigmaX0627，1. 0% )中降解釋放1 μ mol還原產(chǎn)物所需要的酶量，定義為一個(gè)酶活單位。酶活測定按照陸文清等000 提供的方法進(jìn)行。2.酶制劑耐酸性試驗(yàn)從圖1可以看出，在所有測定的PH值條件下，兩種木聚糖酶活性存留率均保持在 50%以上，但木聚糖酶B活性存留率高于木聚糖酶A。木聚糖酶A在pH 5. 5時(shí)有一個(gè)高峰值，高于和低于此PH值，酶活均降低。而木聚糖酶B在不同pH值條件下，活性變化較為緩和，酶活存留率均在80%以上。3.飼料調(diào)質(zhì)模擬試驗(yàn)從圖2中可以看出，木聚糖酶A和B的活性隨著調(diào)質(zhì)溫度升高而降低，特別是調(diào)質(zhì)溫度高于85°C時(shí)，二者活性均迅速降低到50%以下；但溫度低于85°C時(shí)，木聚糖酶活性存留率均較高，且木聚糖酶B的活性存留率在所有測定溫度下均高于木聚糖酶A。4.胃蛋白酶/胰酶耐受性試驗(yàn)本試驗(yàn)中木聚糖酶B活性不受消化道中胃蛋白酶/胰酶的影響，而木聚糖酶A在胃蛋白酶/胰酶作用下活性降低了 20% (圖幻。由此可見，二者對于內(nèi)源蛋白酶的耐受性有較大差異，以相同量添加于飼料中，木聚糖酶B的作用效果會更顯著。5.木聚糖酶對飼料粘度的影響飼料配方中高含量的阿拉伯木聚糖最顯著的特點(diǎn)就是提高了食糜的粘滯性，而木聚糖酶則可以將木糖聚合物分解成短鏈，降低食糜粘度并釋放被其包裹的營養(yǎng)物質(zhì)。試驗(yàn)中分別測定了兩種木聚糖酶對小麥和豆粕粘度的影響，發(fā)現(xiàn)木聚糖酶B對小麥和豆粕粘度的降低程度要優(yōu)于木聚糖酶A (圖4)，其中飼料中添加木聚糖酶A，小麥和豆粕粘度分別降低了 3. 77%和3. 57% ；而飼料中添加木聚糖酶B，小麥和豆粕的粘度則分別降低了 9. 18% 和 5. 00%。從以上試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，木聚糖分子結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性決定了在選擇木聚糖酶時(shí)， 僅僅通過酶制劑標(biāo)示活性這一單一指標(biāo)是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，以模擬調(diào)質(zhì)過程和體外模擬消化技術(shù)為手段，綜合考察酶制劑高溫穩(wěn)定性、耐酸穩(wěn)定性、對內(nèi)源蛋白酶降解作用的耐受性以及對飼料的降解程度，才能更準(zhǔn)確的選擇和合理利用酶制劑。發(fā)明特點(diǎn)0ΕΑ 體系的建立與提出最大程度上解決了現(xiàn)在飼用復(fù)合酶應(yīng)用過程中出現(xiàn)的六大問題，從復(fù)合酶原料選擇、配方優(yōu)化和加工工藝三個(gè)關(guān)鍵控制點(diǎn)提出相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)，初步改變了飼用酶制劑應(yīng)用效果不明顯的弊端。0ΕΑ 體系首次在實(shí)驗(yàn)室條件下通過體外模擬消化技術(shù)評估復(fù)合酶效果并將評估結(jié)果用于指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)，開創(chuàng)出一條復(fù)合酶應(yīng)用研發(fā)的新思路。根據(jù)大量的試驗(yàn)例證，歸結(jié)出0ΕΑ 體系的特點(diǎn)定量、個(gè)性化、動態(tài)性。0ΕΑ 復(fù)合酶針對性強(qiáng)量身訂做。針對各企業(yè)飼料配方、飼料加工工藝和飼料產(chǎn)品適用動物及其生理階段，改變了現(xiàn)存市場酶制劑產(chǎn)品“泛泛而談”的現(xiàn)狀；0ΕΑ 復(fù)合酶適用性好動態(tài)化調(diào)整。隨著飼料配方調(diào)整而調(diào)整復(fù)合酶配方，保證復(fù)合酶作用效果的一致性，改變了現(xiàn)存市場酶制劑產(chǎn)品“僵化”的現(xiàn)狀；0ΕΑ 復(fù)合酶性能顯著效果可重復(fù)。通過實(shí)驗(yàn)室評估試驗(yàn)，可以預(yù)測酶制劑作用效果(能量、粘度及蛋白質(zhì)消化利用率等)，為飼料配方的調(diào)整與飼料配方成本下降提供科學(xué)依據(jù)，改變了現(xiàn)存市場酶制劑產(chǎn)品“純粹經(jīng)驗(yàn)化”的現(xiàn)狀；0ΕΑ 復(fù)合酶性價(jià)比高成本經(jīng)濟(jì)。0ΕΑ 單酶性能優(yōu)良，復(fù)合酶酶譜全面、科學(xué)、經(jīng)濟(jì)，有效降低復(fù)合酶添加成本，改變市場酶制劑產(chǎn)品“投入產(chǎn)出較差”的現(xiàn)狀。具體應(yīng)用下面結(jié)合應(yīng)用實(shí)例詳細(xì)介紹本發(fā)明，所述的實(shí)例用來理解而并非限制本發(fā)明。目前飼用酶制劑應(yīng)用過程中存在以下六方面的問題(1)有效酶活不清晰；(2)有效營養(yǎng)值模糊；C3)針對性不強(qiáng)；(4)添加不定量；(5)效果不明顯；(6)成本不經(jīng)濟(jì)。針對以上六大問題，本發(fā)明通過“有效酶活”和“有效營養(yǎng)值”的評估手段，提供的復(fù)合酶方案可完全解決上述問題。“有效酶活”評估包括六個(gè)方面⑴標(biāo)示酶活測定；(2)耐高溫性測定；⑶常溫貯存酶活損失測定；閾值測定；( 耐酸性測定；(6)耐蛋白酶測定?！坝行I養(yǎng)值”評估包括四個(gè)方面⑴粘度改善測定；(2)能值變化測定；(3)蛋白質(zhì)消化率變化測定；(4)動物生產(chǎn)性能改善評估。通過以上流程和方法制作的0ΕΑ 復(fù)合酶方案已經(jīng)與市場常見復(fù)合酶產(chǎn)品做過多次動物飼養(yǎng)對比試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明與對照產(chǎn)品相比，0ΕΑ 復(fù)合酶針對性強(qiáng)，效果穩(wěn)定， 一般飼料效率可改善0. 05-0. 1，極大提高養(yǎng)殖戶效益。通過0ΕΑ 這一評估體系制作的飼用復(fù)合酶不僅可有效改善動物生產(chǎn)性能，同時(shí)還可降低糧食作物在飼料中的使用量，提高非常規(guī)原料在飼料中的應(yīng)用，改善人畜爭糧的緊張局面。畜禽飼料中添加0ΕΑ 復(fù)合酶后一般可提高動物飼料能值1. 0-3. 0%，以畜禽飼料平均能值為^OOKcal/kg計(jì)算，則添加0ΕΑ 復(fù)合酶后可提高飼料能值^-84Kcal/kg，提高的能量如果全部用來替換玉米(玉米代謝能按照3300Kcal/kg計(jì)算)，則每噸飼料可降低玉米用量8. 5-25. 5kgo中國年產(chǎn)飼料總量按照1. 5億噸，其中加酶飼料0. 45億噸計(jì)算，每年可降低飼料中玉米用量36萬-112. 5萬噸。這可極大緩解目前糧食產(chǎn)量降低而需求量日益增加的緊張局面，也有助于扭轉(zhuǎn)糧食進(jìn)口的貿(mào)易逆差。本發(fā)明以新的思路和方法解決了飼用酶制劑應(yīng)用過程中出現(xiàn)的問題。經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，0ΕΑ 復(fù)合酶針對性更強(qiáng)、成本更經(jīng)濟(jì)。
權(quán)利要求
1.一種最佳酶制劑應(yīng)用體系(0ΕΑ )，其特征在于，包括兩方面的內(nèi)容有效酶活評估和有效營養(yǎng)值評估。
2.如權(quán)利要求1所述的酶制劑應(yīng)用體系，其特征在于，有效酶活評估包括6個(gè)指標(biāo)標(biāo)示酶活、PH閾值、過胃酸測定、過蛋白酶測定、耐高溫測定、三個(gè)月酶活存留率；有效營養(yǎng)值評估包括4個(gè)指標(biāo)飼料粘度測定、飼料能值測定、飼料蛋白質(zhì)消化率測定、動物生長表現(xiàn)。
3.如權(quán)利要求2所述的酶制劑應(yīng)用體系，其特征在于，標(biāo)示酶活的測定方法為取一定量酶樣品溶液，用PH 5. 5的0. lmol/L的NaAc-HAc緩沖溶液溶解后定容至IOOmL,然后根據(jù)酶活將樣品溶液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，使稀釋好的待測酶液中酶活力控制在0. 04-0. 08U/mL之間；再將稀釋好的酶液和配制好的底物溶液在37°C水浴30min后，加DNS試劑終止酶的反應(yīng)，沸水浴5min，冷卻定容；標(biāo)準(zhǔn)空白調(diào)零，用分光光度計(jì)在540nm下測定吸光值，最后根據(jù)吸光值計(jì)算酶活。
4.如權(quán)利要求2所述的酶制劑應(yīng)用體系，其特征在于，pH閾值測定方法為將單酶用不同PH值緩沖液溶解，測定其活性，測定酶活結(jié)果與原始酶活相比，得到其在不同pH值條件下的酶活表現(xiàn)(％ )；不同PH值緩沖液梯度設(shè)置為2. 0、2. 5、3. 0、3. 5、4. 0、4. 5、5. 0、5. 5、 6. 0,6. 5,7. 0 ；也可根據(jù)不同動物消化道不同消化位點(diǎn)的消化液pH值而設(shè)定。
5.如權(quán)利要求2所述的酶制劑應(yīng)用體系，其特征在于，過胃酸測定方法為將單酶用不同PH值緩沖液在37°C條件下處理1. 5h或池后測定其活性，測定酶活結(jié)果與標(biāo)示酶活相比，得到其酶活性存留率(％ )；不同PH值緩沖液梯度設(shè)置為2. 0,2. 5,3. 0,3. 5 ；以此可得到胃中酸性環(huán)境對酶樣品活性的破壞程度(％ )。
6.如權(quán)利要求2所述的酶制劑應(yīng)用體系，其特征在于，過蛋白酶測定方法為配制單酶樣品溶液，取等量的酶液和胃蛋白酶液及胰酶溶液在37°C條件下水浴2-4h，之后將經(jīng)過蛋白酶處理的單酶樣品溶液按照單項(xiàng)酶制劑酶活測定方法測定其酶活，測定酶活結(jié)果與標(biāo)示酶活相比，得到其酶活性存留率(％)，以此確定外源酶制劑對蛋白酶的耐受性。
7.如權(quán)利要求2所述的酶制劑應(yīng)用體系，其特征在于，耐高溫測定方法為測定酶樣品的水分含量，根據(jù)酶樣品中水分含量通過加蒸餾水調(diào)節(jié)待測酶樣品中的水分至16 %，然后在烘箱中放置一定時(shí)間后取出冷卻備用，烘箱溫度設(shè)置為65°C、75°C、85°C、90°C、95°C等5 個(gè)溫度梯度；通過單酶酶活測定方法測定酶活力，測定不同溫度處理后酶樣品活性與標(biāo)示酶活相比，得到其酶活存留率(％ )，以此可評估酶樣品的耐高溫性(％ )。
8.如權(quán)利要求2所述的酶制劑應(yīng)用體系，其特征在于，三個(gè)月酶活存留率測定方法為 酶制劑從生產(chǎn)之日起開始計(jì)算，常溫貯存三個(gè)月后再取樣，按照酶制劑酶活測定方法測定酶活，結(jié)果與標(biāo)示酶活相比，得到其三個(gè)月常溫貯存后的酶活存留率(％ )。
9.如權(quán)利要求2所述的酶制劑應(yīng)用體系，其特征在于，飼料粘度測定和飼料能值測定方法為準(zhǔn)確稱取1. 25g粉碎飼料樣品于三角瓶中，所述粉碎飼料過Imm篩，分別加入不同梯度外源酶制劑后，再加入lmg/mL新鮮胃蛋白酶鹽酸溶液，所述胃蛋白酶鹽酸溶液為0. IN 并且pH = 2. 0，在40°C恒溫水浴鍋中振蕩，消化時(shí)間為池；胃消化階段結(jié)束后，向溶液中加入ImL新鮮胰酶溶液，所述胰酶溶液為5mg/mL，調(diào)節(jié)溶液pH值為6. 5 (1M NaOH溶液)，于 40°C恒溫水浴中振蕩，消化時(shí)間為4h ；同時(shí)以未加酶飼料為對照組，進(jìn)行同樣的消化程序； 體外消化結(jié)束后，將試管取出于3000g離心15min，取上清液測定其粘度；消化殘?jiān)诤嫦渲泻嬷梁阒兀瑴y定其能量；飼料粘度變化(％ )=加酶組食糜粘度/對照組食糜粘度*100 ；飼料能值變化(％ )=加酶組消化能/對照組消化能*100。
全文摘要
一種最佳酶制劑應(yīng)用體系(OEATM)，包括兩方面的內(nèi)容有效酶活評估和有效營養(yǎng)值評估。有效酶活評估包括6個(gè)指標(biāo)標(biāo)示酶活、pH閾值、過胃酸測定、過蛋白酶測定、耐高溫測定、三個(gè)月酶活存留率；有效營養(yǎng)值評估包括4個(gè)指標(biāo)飼料粘度測定、飼料能值測定、飼料蛋白質(zhì)消化率測定、動物生長表現(xiàn)。本發(fā)明以新的思路和方法解決了飼用酶制劑應(yīng)用過程中出現(xiàn)的問題。經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，OEATM復(fù)合酶針對性更強(qiáng)、成本更經(jīng)濟(jì)。
文檔編號C12Q1/00GK102242180SQ20111009922
公開日2011年11月16日 申請日期2011年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月22日
發(fā)明者唐茂妍, 孫鳴, 徐玲, 王海彥, 王紀(jì)亭, 陳旭東 申請人:北京華美源生物科技有限公司