專利名稱：水稻基因OsbZIP46在調(diào)控耐熱性和耐冷性中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水稻基因工程領(lǐng)域。具體涉及(I)通過分離、克隆和功能驗證得到一種能夠提高對高溫和低溫耐受能力的水稻0sbZIP46基因，(2)該基因在水稻抗熱性和抗冷性遺傳改良中的應(yīng)用。本發(fā)明采用候選基因篩選方法，克隆到控制水稻抗熱性和抗冷性的基因0sbZIP46，超量表達(dá)0sbZIP46基因增強(qiáng)了對ABA信號的傳導(dǎo)能力，提高了轉(zhuǎn)基因水稻抗熱和抗冷的能力，證實了該基因的功能及應(yīng)用途徑。
背景技術(shù)：
非生物脅迫如干旱、高鹽、極端溫度(熱、冷)等會嚴(yán)重危害植物的生長發(fā)育，會導(dǎo)致農(nóng)作物的大規(guī)模減產(chǎn)，制約農(nóng)業(yè)發(fā)展。提高農(nóng)作物的抗逆能力已經(jīng)成為急需解決的關(guān)鍵 問題。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)對農(nóng)作物進(jìn)行抗逆性遺傳改良，培育耐逆性的作物品種顯得越發(fā)重要，成為農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)研究的主要目標(biāo)之一。尋找植物中可真正用于抗逆性遺傳改良的基因是其中的關(guān)鍵。植物在受到脅迫時會產(chǎn)生相應(yīng)的應(yīng)答反應(yīng)，發(fā)生一系列生理和發(fā)育上的變化，來降低或消除脅迫給植株帶來的危害。植物的這種應(yīng)答反應(yīng)是ー個涉及多基因、多信號途徑的復(fù)雜過程。許多基因被證明受逆境誘導(dǎo)并在植物的對逆境的耐性方面發(fā)揮作用(Shinozaki等，1997)。這些基因及其表達(dá)產(chǎn)物可以分為三類參與信號級聯(lián)放大系統(tǒng)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的基因及產(chǎn)物，如一些激酶和轉(zhuǎn)錄因子；直接對保護(hù)生物膜和蛋白質(zhì)起作用的基因及其表達(dá)產(chǎn)物；與水和離子的攝入和轉(zhuǎn)運相關(guān)的蛋白質(zhì)。其中轉(zhuǎn)錄因子在植物對非生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng)中起著非常重要的作用。它們在脅迫誘導(dǎo)下不斷合成，調(diào)控一系列下游基因的表達(dá)，將信號傳遞和放大，引起植物生理生化方面的改變，最終使其產(chǎn)生相應(yīng)的抗逆性。如擬南芥的DREB2A轉(zhuǎn)錄因子可能參與了對干旱、高溫和低溫的應(yīng)答(Yoh Sakuma等，2009)。通過基因工程，部分逆境應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子已經(jīng)成功應(yīng)用于水稻抗逆遺傳育種，如利用水稻NAC家族轉(zhuǎn)錄因子SNAC2培育的轉(zhuǎn)基因水稻顯著提高了抗鹽和抗冷能力(Hu等.2008);將擬南芥的CBF3在水稻內(nèi)進(jìn)行組成性超表達(dá)，顯著提高了水稻的耐旱耐鹽能力，還部分提高了水稻的耐冷性，同時沒有引起植株其他表型上的變化(Oh等，2005)。bZIP轉(zhuǎn)錄因子含有堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域，廣泛參與植物對非生物逆境的應(yīng)答，迄今已鑒定出許多與逆境相關(guān)的bZIP轉(zhuǎn)錄因子。Liao等認(rèn)為大豆中的131個bZIP基因中，有三分之一以上跟植株應(yīng)答旱、鹽、冷脅迫和ABA四種處理條件的至少ー種相關(guān)(Liaoet al.，2008)。bZIP轉(zhuǎn)錄因子參與依賴于ABA的脅迫應(yīng)答。ABA是植物非生物逆境信號傳導(dǎo)途徑重要信號分子，非生物逆境以及外源ABA能誘導(dǎo)植物體內(nèi)ABA的合成，bZIP蛋白也隨之被激活并與ABA應(yīng)答元件ABRE (ABA responsive element)結(jié)合,啟動下游基因的表達(dá)(Choi等，2000)。擬南芥中已鑒定許多參與逆境應(yīng)答的bZIP轉(zhuǎn)錄因子。Choi等用酵母One-Hybrid的方法從擬南芥中分離出4種逆境誘導(dǎo)的bZIP蛋白，分別稱做ABF1、ABF2/AREBI、ABF3/DPBF5 和 ABF4/AREB2。其中 ABF2/AREB1、ABF3/DPBF5 和 ABF4/AREB2 的表達(dá)受ΑΒΑ、干旱和高鹽的誘導(dǎo)，而ABFl的表達(dá)受冷的誘導(dǎo)，同時它們調(diào)節(jié)了大量抗逆相關(guān)基因的表達(dá)。超量表達(dá)ABF2提高了植株對葡萄糖的敏感性，并影響了植株對早、鹽和熱的耐性。ABF3和ABF4在擬南芥ABA和逆境信號傳遞中起著重要的作用，超量表達(dá)ABF3和ABF4后，提高了植株對ABA的敏感性，降低了蒸騰速率，提高了植株抗旱和抗鹽能力(Choi et al.，2000 ；Kang et al. , 2002 ；Kim et al. ,2004 ；0h et al. ,2005 ；Zhou et al. ,2006)οΑΒΙδ是另ー個擬南芥中研究的比較多的與ABA信號傳導(dǎo)相關(guān)的bZIP類轉(zhuǎn)錄因子。ABI5能被干早、鹽和ABA誘導(dǎo)，超量表達(dá)ABI5能使轉(zhuǎn)基因植株對ABA超敏感，提高其抗旱能力。水稻中也已鑒定ー些具有抗逆效果的bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因，如0sABI5，0sbZIP23 (Zou等，2008 ；Xiang等，2008)。本發(fā)明涉及的0sbZIP46基因是水稻中bZIP家族成員之一，其生物學(xué)功能尚未報道。本發(fā)明通過候選基因篩選和鑒定，驗證了 0sbZIP46基因參與水稻對ABA處理、高溫和低溫脅迫的應(yīng)答，超量表達(dá)0sbZIP46基因表現(xiàn)出增強(qiáng)對ABA信號的傳導(dǎo)，提高了轉(zhuǎn)基因水稻抗熱和抗冷的能力，因此本發(fā)明對于在極端氣候條件頻發(fā)的今天，培育對極端溫度耐受能力增強(qiáng)的水稻具有重要的意義
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的涉及ー個bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族成員0sbZIP46基因在控制水稻抗熱性和抗冷性改良中的應(yīng)用。在水稻逆境處理后上升表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子中，其中ー個基因?qū)儆赽ZIP轉(zhuǎn)錄因子家族，申請人將該基因命名為0sbZIP46 (Qryza Sativa Stress-inducedTranscription factor 46)。本發(fā)明分離和應(yīng)用一種包含0sbZIP46基因的DNA片段,該片段賦予水稻在高溫條件下抗熱性增強(qiáng)的能力，在低溫條件下增強(qiáng)抗冷性的能力。其中，所述的含有0sbZIP46基因的核苷酸序列如序列表SEQ NO : I所示，序列長度為975bp，它對應(yīng)的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示，其氨基酸序列為324個。攜帶有本發(fā)明0sbZIP46基因的表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒，植物病毒載體，直接DNA轉(zhuǎn)化,微注射，電穿孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞(Weissbach, 1998,Method forPlant Molecular Biology VIII, Academy Press, New York, pp. 411—463 ；Geiserson andCorey, 1998, Plant Molecular Biology (2nd Edition))。可使用包括本發(fā)明的0sbZIP46基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主(包括水稻在內(nèi)多種植物)，培育抗熱植物品種和抗冷植物品種。本發(fā)明基因是受高溫誘導(dǎo)表達(dá)的，因此可將本發(fā)明的基因與任何感興趣的高溫誘導(dǎo)啟動子結(jié)合后連入合適的表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化植物宿主，在高溫條件下可誘導(dǎo)表達(dá)基因，提高植物抗熱性。下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明做進(jìn)ー步說明。


序列表SEQ ID NO 1是本發(fā)明分離克隆的包含有0sbZIP46基因編碼區(qū)的核苷酸序列，序列長度為975bp，它對應(yīng)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示，氨基酸序列為324個。圖1.0sbZIP46基因在多種逆境和激素處理下的表達(dá)情況。各處理樣品為干旱(drought)處理 0d, 3d, 5d,復(fù)水 12h ;高鹽(salt)處理 Oh, 3h, 6h, 12h ;低溫(cold)處理 Oh,3h，6h，12h;高溫(heat)處理 Oh，2h，6h，12h ;氧化脅迫(H2O2)處理 0h，3h，6h，12h。激素處理茉莉酸(JA)處理0h，lh，3h，6h ;脫落酸(ΑΒΑ)，吲哚こ酸(IAA)，赤霉素(GA)，細(xì)胞分裂素(KT)，油菜素內(nèi)酷(BR)處理都為0h，3h，6h，12h。圖2. 0sbZIP46超表達(dá)載體示意圖及超表達(dá)植株的表達(dá)量檢測，CK為野生型對照。圖3. 0sbZIP46的超表達(dá)材料在ABA處理下的發(fā)芽試驗表型，ox2、oxl3、oxl5為超表達(dá)家系，ck9、ckl5為分離出來的轉(zhuǎn)基因陰性家系，ZHll為野生型。
圖4. 0sbZIP46的超表達(dá)材料在ABA處理下的發(fā)芽率統(tǒng)計，ox2、oxl3、oxl5為超表達(dá)家系，ck9、ckl5為分離出來的轉(zhuǎn)基因陰性家系，ZHll為野生型。圖5. 0sbZIP46的超表達(dá)材料在幼苗期對ABA敏感性試驗表型，0sbZIP46U-15_0X、0sbZIP46U-2-0X 為超表達(dá)家系，0sbZIP46U_15_NCK、0sbZIP46U_2_NCK 為分離出來的轉(zhuǎn)基因陰性家系。圖6. 0sbZIP46的超表達(dá)植株在幼苗期對ABA敏感性試驗的株高和根長統(tǒng)計，15-0X、2-0X為超表達(dá)家系，15-NCK.2-NCK為分離出來的轉(zhuǎn)基因陰性家系。圖7. 0sbZIP46超表達(dá)植株高溫脅迫下的表型，OX為超表達(dá)家系，CK為野生型對照。圖8. 0sbZIP46超表達(dá)植株高溫脅迫后存活率統(tǒng)計，0sbZIP46U_2，0sbZIP46U_9，0sbZIP46U-15為超表達(dá)家系，ZHll為野生型對照。圖9. 0sbZIP46超表達(dá)植株低溫脅迫下的表型，OX為超表達(dá)家系，CK為野生型對照。圖10. 0sbZIP46超表達(dá)植株高溫脅迫后存活率統(tǒng)計，0sbZIP46U_2，0sbZIP46U_9，0sbZIP46U-15為超表達(dá)家系，ZHll為野生型對照。
具體實施例方式以下實施例定義了本發(fā)明，并描述了本發(fā)明在分離、克隆包含有0sbZIP46基因完整編碼區(qū)段的DNA片段，以及驗證0sbZIP46基因功能的方法。根據(jù)以下的描述的全部或部分實施步驟，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明做出各種改變和修改，以使其適用不同的用途和條件。I、檢測水稻內(nèi)源0sbZIP46基因受逆境誘導(dǎo)水平為初步判斷0sbZIP46基因是否與抗逆相關(guān)，本發(fā)明首先檢測了水稻內(nèi)源基因0sbZIP46是否受逆境誘導(dǎo)。申請人選用粳稻品種“中花11”(簡稱ZH11，來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所)作為表達(dá)譜分析的材料。生長至4葉期幼苗進(jìn)行各種逆境和激素的處理。干旱處理是不澆水讓其自然干燥，0d，3d，5d，復(fù)水12小時后取樣；高鹽脅迫是將幼苗根部浸泡在200mM NaCl的溶液，0h，3h，6h，12h后取樣；低溫脅迫是將幼苗放入4°C人エ氣候室，0h，3h，6h，12h后取樣。高溫脅迫是將幼苗放入42で人エ氣候室，011，211，611，12h后取樣。氧化脅迫是將幼苗根部浸泡在1%11202溶液中，011，311，611，1211后取樣。激素處理是用100 μ M的脫落酸(ABA)，油菜素內(nèi)酯(BR)，吲哚こ酸(IAA)，細(xì)胞分裂素(KT)，赤霉素(GA)，茉莉酸(JA)分別均勻的噴灑水稻植株表面后并加到幼苗根部，茉莉酸(JA)按時間點0h，lh，3h，6h取樣，其它按時間點0h，3h，6h，12h取樣?？俁NA的提取采用TRIZOL試劑(購自Invitrogen公司)提取，提取方法按照TRIZOL試劑說明書，利用反轉(zhuǎn)錄酶SSIII (購自Invitrogen公司)將其反轉(zhuǎn)錄合成cDNA (方法根據(jù)Invitrogen公司反轉(zhuǎn)錄酶試劑說明書)，反應(yīng)條件為65°C 5min, 50°C 60min, 70°C IOmin0以上述反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，用引物(0sbZIP46RealT-1025F :5，-CTTGGACCAAAGGCAAAGAGA-3，和 0sbZIP46RealT_1097R 5，-ACCGGAGACTCTGGCTTCAG-3，)對0sbZIP46基因進(jìn)行特異的PCR擴(kuò)增。同時用引物(actin76F :5，-TGGCATCTCTCAGCACATTCC-3，和 actin76R :5，_TGCACAAT GGATGGGTCAGA-3，)對水稻Actinl基因(登錄號X16280)做特異擴(kuò)增(擴(kuò)增產(chǎn)物長76bp)，以作為內(nèi)對照進(jìn)行定量分析。反應(yīng)條件為95°C IOsec ；95°C 5sec，60°C 34sec，45個循環(huán)。反應(yīng)過程中進(jìn)行熒光檢測實時定量分析。結(jié)果表明，0sbZIP46基因(SEQ NO 1)在干旱，高鹽，高溫，氧化脅迫后誘導(dǎo)上升表達(dá)，0sbZIP46基因受ABA，IAA誘導(dǎo)上升表達(dá)(圖I)。2、0sbZIP46基因超量表達(dá)載體的構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化超量表達(dá)載體的構(gòu)建為了研究0sbZIP46基因的抗逆功能，申請人將其在水稻中超量表達(dá)，期望從轉(zhuǎn)基因植株的表型來研究該基因的功能。超量表達(dá)載體構(gòu)建方法如下首先通過查找在水稻基因組注釋網(wǎng)站TIGR(http://rice, plantbiology. msu.edu/)0sbZIP46 基因的注釋號L0C_0s06gl0880,與 KOME (http://cdnaOl. dna. affrc.go. jp/cDNA/) 0sbZIP46 基因的注釋號AK103188,預(yù)測 0sbZIP46 為ー個 bZIP 家族基因(該基因的完整核苷酸序列見SEQ ID NO :1所示，其編碼區(qū)核苷酸長度為975bp，核苷酸序列對應(yīng)的氨基酸序列為324個)。在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點實驗室明恢63全生育期平衡化cDNA文庫(Chu等，2003)中檢索到ー個含有0sbZIP46基因編碼區(qū)5’部分序列的cDNA克隆(克隆號BI103-013)(該文庫對外公開的網(wǎng)址http://redb. ncpgr. cn/modules/redbtools/)。從文庫中挑取該克隆，抽提質(zhì)粒，利用通用引物SP6(5’ -ATTTAGGTGACACTATA-3’)、T7(5’ -TAATACGACTCACTATAGGG-3’ )從兩端進(jìn)行了測序驗證，測序工作在ABI7500儀器上完成。然后與KOME數(shù)據(jù)庫中的0sbZIP46基因的全長cDNA進(jìn)行序列比較，確定克隆BI 103-013包含0sbZIP46基因的完整開放閱讀框(0RF， open reading frame)?？寺I103-013質(zhì)粒用KpnI和BamHI雙酶切，回收外源片段；同時，用同樣的方法酶切攜帶Ubiquitin啟動子的遺傳轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA1301U(pCAMBIA1301U是在國際上常用的植物遺傳轉(zhuǎn)化載體PCAMBIA1301基礎(chǔ)上改建的，攜帯具有組成型和超量表達(dá)特征的玉米u(yù)biquitin啟動子的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化載體)，酶切完畢，用氯仿異戊醇(體積比為24 I)抽提，純化酶切產(chǎn)物。用包含0sbZIP46基因的酶切片段和酶切的PCAMBIA1301U載體做連接反應(yīng)，其后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOii (該大腸桿菌DHlO β菌株購自Promega公司)。通過酶切篩選陽性克隆，獲得的重組質(zhì)粒載體被命名為0sbZIP46-1301U(圖 2A)。遺傳轉(zhuǎn)化步驟通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化方法(其具體步驟如下所述)將上述超表達(dá)載體0sbZIP46-1301U轉(zhuǎn)入到水稻品種“中花11”中，經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)、侵染、共培養(yǎng)、篩選具有潮霉素抗性的愈傷、分化、生根、練苗、移栽，得到轉(zhuǎn)基因植株。上述農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻(中花11)遺傳轉(zhuǎn)化方法(體系)在Hiei等人報道的方法(Hiei等,Efficient transformationof rice,Oryza sativa L ,mediated Dy Agrobacterium and sequence analysis of theboundaries of the T-DNAiPlant J，6 :271-282,1994)基礎(chǔ)上改良進(jìn)行。本實施例的具體遺傳轉(zhuǎn)化步驟如下(I)電轉(zhuǎn)化用1800v電壓，將最終超表達(dá)目標(biāo)載體0sbZIP46_1301U電轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌EHA105菌株，涂到帶有對應(yīng)抗性選擇的LA培養(yǎng)基上，篩選出陽性克隆，用于下述轉(zhuǎn)化愈傷。(2)愈傷組織誘導(dǎo)將成熟的水稻種子中花11去殼，然后依次用70%的乙醇處理I分鐘；0. 15%氯化汞(HgCl2)表面消毒15分鐘；用滅菌水洗種子4-5次；將該消過毒的種子放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(成分見后)；將接種后的誘導(dǎo)培養(yǎng)基置于黑暗處培養(yǎng)4周，溫度25±1°C。(3)愈傷繼代挑選亮黃色、緊實且相對干燥的胚性愈傷，放于繼代培養(yǎng)基(成分見后)上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度25±1°C。(4)預(yù)培養(yǎng)挑選緊實且相對干燥的胚性愈傷，放于預(yù)培養(yǎng)基(成分見后)上黑暗 下培養(yǎng)2周，溫度25±1°C。(5)農(nóng)桿菌培養(yǎng)在帶有對應(yīng)抗性選擇的LA培養(yǎng)基上(成分見后)預(yù)培養(yǎng)農(nóng)桿菌EHA105 (來源于CAMBIA，商用菌株，攜帶有本發(fā)明的超表達(dá)載體0sbZIP46_1301U)兩天，培養(yǎng)溫度28°C ;將所述的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移至懸浮培養(yǎng)基(成分見后)，28°C搖床上培養(yǎng)2-3小時。(6)農(nóng)桿菌侵染將預(yù)培養(yǎng)的愈傷轉(zhuǎn)移至滅菌好的瓶子內(nèi)；調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌的懸浮液至0D_ 0. 8-1. 0 ;將愈傷在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；然后放置在共培養(yǎng)基(成分見后)上培養(yǎng)3天，培養(yǎng)溫度19-20°C。(7)愈傷洗漆和選擇培養(yǎng)滅菌水洗漆愈傷至看不見農(nóng)桿菌；浸泡在含400ppm羧芐青霉素(CN)的滅菌水中30分鐘；轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；轉(zhuǎn)移愈傷至選擇培養(yǎng)基(成分見后)上選擇2-3次，每次2周(第一次篩選羧芐青霉素濃度為400ppm，第二次以后為250ppm,潮霉素濃度250ppm)。(8)分化將抗性愈傷轉(zhuǎn)移至預(yù)分化培養(yǎng)基(成分見后)上黑暗處培養(yǎng)5-7天；轉(zhuǎn)移預(yù)分化培養(yǎng)的愈傷至分化培養(yǎng)基上(成分見后)，光照(35001uX)下培養(yǎng)，溫度26°C。(9)生根剪掉分化時產(chǎn)生的根；然后將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中光照下培養(yǎng)2-3周，溫度26°C。(10)移栽洗掉根上的殘留培養(yǎng)基，將具有良好根系的幼苗轉(zhuǎn)入溫室，同時在最初的幾天保持水分濕潤。培養(yǎng)基組分及其配方(I)試劑和溶液縮寫本發(fā)明中培養(yǎng)基所用到的植物激素的縮寫表示如下6-BA (6-BenzyIaminoPurine, 6-節(jié)基腺嘌呤)；CN (Carbenici 11 in,羧節(jié)青霉素)；KT (Kinetin,激動素)；NAA (Napthalene acetic acid,萘乙酸)；IAA(Indole-3_aceticacid, 口引哚乙酸)；2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid, 2,4- 二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone,乙酸丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate,水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B,潮霉素)；DMS0 (Dimethyl Sulfoxide, 二甲基亞諷)；N6max (N6 大量成分溶液);N6mix (N6微量成分溶液);MSmax (MS大量成分溶液);MSmix (MS微量成分溶液)。(2)主要溶液配方1)N6培養(yǎng)基大量元素母液[10倍濃縮液(IOX)]的配制
硝酸鉀(KNO3)28.3 g
磷酸二氫鉀(KH2PO4)4.0 g
硫酸銨((NH4)2SO4)4.63 g
硫酸鎂(MgSO4 .7H20)1.85 g
氯化鈣(CaCl2 OH2O)1.66 g逐一溶解,然后室溫下定容至1000ml。2) N6培養(yǎng)基微量元素母液[100倍濃縮液(100X)]的配制
碘化鉀(KI)0.08 g
硼酸(H3BO3)0.16g
硫酸錳(MnSO4MH2O)0.44 g
硫酸鋅(ZnSO4IH2O)0.15 g室溫下溶解并定容至1000ml。3)鐵鹽(Fe2EDTA)貯存液(100X)的配制準(zhǔn)備800ml雙蒸水并加熱至70°C，加入乙二銨四乙酸二鈉(Na2EDTA 2H20) 3. 73克，充分溶解后在70°C水浴中保持2小時，定容至1000ml，4°C保存?zhèn)溆谩?)維生素貯存液(100X)配制
煙酸(Nicotinic acid)0.1 g
維生素BI (Thiamine HCl)0.1 g
維生素B6 (Pyridoxine HCl)0.1 g
甘氨酸(Glycine)0.2 g
肌醇(Inositol)IOg加水定容至1000ml，4°C保存?zhèn)溆谩?)MS培養(yǎng)基大量元素母液(IOX)的配制
硝酸銨(NH4NO3)16.5 g
硝酸鉀19.0 g
磷酸二氫鉀1.7 g
硫酸鎂3.7 g
氯化鈣4.4 g室溫下溶解并定容至1000ml。6)MS培養(yǎng)基微量元素母液(100X)的配制碘化鉀0.083 g
硼酸0.62 g
硫酸錳0.86 g
鑰酸鈉(Na2MoO4OH2O)0.025 g
硫酸銅(CuS04.5H20)0.0025 g室溫下溶解并定容至1000ml。7)2，4_D 貯存液(lmg/ml)的配制稱取2，4-D lOOmg，用Iml IN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加IOml蒸餾水溶解完全后定容至IOOml,于室溫下保存。 8)6-BA|C存液(lmg/ml)的配制稱取6-BA IOOmg,用Iml IN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加IOml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，室溫保存。9)萘乙酸(NAA)忙存液(lmg/ml)的配制稱取NAA IOOmg,用ImllN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加IOml蒸餾水溶解完全后定容至IOOml，4°C保存?zhèn)溆谩?0)吲哚乙酸(IAA)貯存液(lmg/ml)的配制稱取IAA lOOmg，用ImllN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加IOml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，4°C保存?zhèn)湓谝粋€大三角瓶中加入300ml蒸餾水和硫酸鐵(FeSO4 *7H20)2. 78g。在另一個大三角瓶中加入300ml蒸餾水用。11)葡萄糖貯存液(0. 5g/ml)的配制稱取葡萄糖125g，然后用蒸餾水溶解定容至250ml，滅菌后4°C保存?zhèn)溆谩?2) AS貯存液的配制稱取AS 0. 392g, DMSO 10ml，分裝至I. 5ml離心管內(nèi)，4°C保存?zhèn)溆谩?3) IN氫氧化鉀貯存液稱取氫氧化鉀5. 6g，并用蒸餾水溶解定容至100ml，室溫保存?zhèn)溆谩?3)用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基配方I)誘導(dǎo)培養(yǎng)基
N6max 母液(IOX)100 ml
N6mix 母液(100X)IOml
Fe2+EDTA 貯存液(100X)IOml
維生素貯存液(100X)IOml
2,4-D IC存液2.5 ml
脯氨酸(Proline)0.3 gCH0-6 g鹿糖(Sucrose) 30gPhytagel 3 g
加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 9，煮沸并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。2)繼代培養(yǎng)基
N6max 母液(IOX)IOOml
N6mix 母液(100X)IOml
Fe2+EDTA 貯存液(100X)IOml
維生素貯存液(100X)IOml
2.4-DJC存液2.0 ml 脯氨酸0.5 g CH0.6 g 蔗糖30 g Phytagel3 g加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 9，煮沸并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。3)預(yù)培養(yǎng)基
N6max 母液(IOX)12.5 ml
N6mix 母液(100X)1.25 ml
Fe2+EDTA 貯存液(100X)2.5 ml
維生素貯存液(100X)2.5 ml
2.4-D貯存液0.75 ml CH0.15 g 蔗糖5g 瓊脂粉(Agarose)1.75 g加蒸餾水至250ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 6，封口滅菌。使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5ml葡萄糖貯存液和250 u I AS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。4)共培養(yǎng)基
N6max 母液(IOX)12.5 ml
N6mix 母液(100X)1.25ml
Fe2+EDTA 貯存液(100X)2.5 ml
維生素貯存液(100X)2.5 ml
2,4-D 貯存液0.75 ml
CH0.2 g
蔗糖5g
瓊脂粉1.75 g
加蒸餾水至250ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 6，封口滅菌。使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5ml葡萄糖貯存液和250 u I AS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/每皿)。5)懸浮培養(yǎng)基
N6max 母液(IOX)5 ml
N6mix 母液(100X)0.5 ml
Fe2+EDTA 貯存液(100X)0.5 ml
維生素貯存液(100X)I ml 2.4-D貯存液0.2 ml CH0.08 g 蔗糖2g加蒸餾水至100ml，調(diào)節(jié)pH值到5. 4，分裝到兩個IOOml的三角瓶中，封口滅菌。使用前加入Iml葡萄糖貯存液和100 u I AS貯存液。6)選擇培養(yǎng)基
N6max 母液(IOX)25 ml
N6mix 母液(100X)2.5 ml
Fe2+EDTA 貯存液(100X)2.5 ml
維生素貯存液(100X)2.5 ml
2.4-D貯存液0.625 ml CH0.15 g 蔗糖7.5 g 瓊脂粉1.75 g加蒸餾水至250ml，調(diào)節(jié)pH值到6. 0，封口滅菌。使用前溶解培養(yǎng)基，加入250 U IHN和400ppm CN,分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。7)預(yù)分化培養(yǎng)基N6max 母液(IOX)25 ml
N6mix 母液(100X)2.5 ml
Fe2+EDTA 貯存液(100X)2.5 ml
維生素貯存液(100X)2.5 ml
6-BA貯存液0.5 ml
KT貯存液0.5 ml
NAA貯存液50
IAA貯存液50 |il CH0.15g
蔗糖7.5 g
瓊脂粉1.75 g加蒸餾水至250ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 9，封口滅菌。使用前溶解培養(yǎng)基，
加入250 u IHN和200ppm CN,分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/ M )。8)分化培養(yǎng)基
N6max 母液(IOX)IOOml
N6mix 母液(100X)10 ml
Fe2+EDTA 貯存液(100X)IOml
維生素貯存液(100X)IOml
6-BA貯存液2 ml
KT貯存液2 ml
NAA JC存液0.2 ml
IAA IC存液0.2 ml
CHIg
蔗糖30 g
Phytagel3 g加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到6. O。煮沸并定容至1000ml，分裝到
50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口滅菌。9)生根培養(yǎng)基
MSmax 母液(IOX)50 ml
MSmix 母液(100X)5 ml
Fe2+EDTA 貯存液(100X)5 ml
維生素貯存液(100X)5 ml
蔗糖30 g
Phytagel3 g
加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 8。煮沸并定容至1000ml，分裝到生根管中(25ml/管)，封口滅菌。3、0sbZIP46超表達(dá)植株的表達(dá)量鑒定本發(fā)明采用Northern雜交方法對上述第2步獲得的轉(zhuǎn)基因水稻植株中0sbZIP46基因的表達(dá)進(jìn)行檢測。提取葉片的總RNACTrizol試劑，Invitrogen)，將15 Ug總RNA在I. 2%瓊脂糖變性凝膠中電泳分離，轉(zhuǎn)至尼龍膜，通過紫外交聯(lián)固定，與32P標(biāo)記的靶基因探針雜交，探針的標(biāo)記、雜交、洗膜及顯影等按《分子克隆》(科學(xué)出版社，1999)有關(guān)實驗操作方法進(jìn)行。表達(dá)量檢測結(jié)果顯示，大約一半轉(zhuǎn)基因植株中0sbZIP46基因的表達(dá)量相對于野生型顯著提高(圖2B)。
4、0sbZIP46超表達(dá)植株的ABA敏感性鑒定
轉(zhuǎn)基因家系對脫落酸(ABA)發(fā)芽敏感性檢測是將將超量表達(dá)家系、轉(zhuǎn)基因陰性對照家系和野生型的種子去殼消毒，直接在含ABA濃度梯度的MS培養(yǎng)基平板上發(fā)芽，在培養(yǎng)室避光生長并統(tǒng)計其發(fā)芽率。結(jié)果顯示，在含3 ii M和6 ii MABA的MS培養(yǎng)基上，超表達(dá)家系的發(fā)芽率明顯低于對照(轉(zhuǎn)基因陰性家系和野生型)，在無ABA或I ii MABA的MS培養(yǎng)基上，兩者發(fā)芽率無顯著差異，說明超量表達(dá)0sbZIP46基因?qū)е略鰪?qiáng)轉(zhuǎn)基因植株發(fā)芽時對ABA的敏感性(圖3和圖4)。轉(zhuǎn)基因家系A(chǔ)BA苗期生長敏感性檢測是將超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因家系以及轉(zhuǎn)基因陰性對照家系的種子去殼消毒，在含有100mg/L潮霉素的MS培養(yǎng)基上發(fā)芽，挑選發(fā)芽好且長勢一致的種子轉(zhuǎn)移到含有3 u mo I/LABA的MS培養(yǎng)基在培養(yǎng)室避光生長。在生長一星期后分別觀察表型和測量植株的根長和株高。結(jié)果顯示超表達(dá)家系在ABA處理情況，根長和株高明顯比對照要短，其生長受ABA的抑制更強(qiáng)烈，說明0sbZIP46基因?qū)е罗D(zhuǎn)基因植株在苗期生長時對ABA的敏感性增強(qiáng)(圖5和圖6)。從以上兩個階段的實驗結(jié)果可以看出，0sbZIP46超表達(dá)能增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株對ABA的信號傳導(dǎo)能力。5、0sbZIP46超表達(dá)植株的高溫脅迫表型鑒定為了驗證0sbZIP46超表達(dá)植株的抗熱性，發(fā)明人對超表達(dá)植株進(jìn)行了高溫脅迫表型鑒定，將三個超表達(dá)家系(OX)和野生型家系(中花11，或稱為ZH11)發(fā)芽后，挑選一致的植株種到小圓桶中，每桶種轉(zhuǎn)基因植株和野生型對照各25株，置正常條件下生長。將生長正常的4葉期的植株移至42°C植物生長箱進(jìn)行高溫脅迫處理2天，然后恢復(fù)至正常條件生長一周，拍照并調(diào)查植株的存活率，試驗設(shè)3次重復(fù)。結(jié)果顯示，在高溫脅迫處理過程中，野生型對照的葉片很快卷曲，失綠，萎蔫，而超表達(dá)植株并未表現(xiàn)出如此強(qiáng)烈的變化。經(jīng)過高溫脅迫并恢復(fù)生長一段時間之后，野生型(對照)的葉片基本都枯萎掉，無綠葉生長，而超表達(dá)植株部分葉片仍能恢復(fù)過來，且能很快恢復(fù)生長新的綠葉。進(jìn)一步統(tǒng)計存活率發(fā)現(xiàn)野生型對照存活率低于40%，而超表達(dá)植株的存活率顯著高于對照(在60%以上)。與野生型對照相比，超表達(dá)植株對高溫脅迫表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗性，說明0sbZIP46超表達(dá)后提高了植株的抗熱性(圖7和圖8)。5、0sbZIP46超表達(dá)植株的低溫脅迫表型鑒定為了驗證0sbZIP46超表達(dá)植株的抗冷性，發(fā)明人也對超表達(dá)植株進(jìn)行了低溫脅迫表型鑒定，將三個超表達(dá)家系(OX)和野生型家系(ZHll)發(fā)芽后，挑選一致的植株種到小圓桶中，每桶種轉(zhuǎn)基因植株和野生型對照各25株，置正常條件下生長。將生長正常的4葉期的植株移至4攝氏度冷庫進(jìn)行低溫脅迫處理一周，然后恢復(fù)至正常條件生長一周，拍照并調(diào)查植株的存活率，試驗設(shè)3次重復(fù)。結(jié)果顯示，經(jīng)過低溫脅迫并恢復(fù)生長一段時間之后，超表達(dá)植株的存活率顯著高于野生型對照(超表達(dá)植株的存活率在50%以上，而野生型植株的存活率低于30% )。與野生型對照相比，超表達(dá)植株對低溫脅迫表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗性，說明0sbZIP46超表達(dá)后提高了植株的抗 冷性(圖9和圖10)。
權(quán)利要求
1.水稻0sbZIP46基因在調(diào)控耐高溫和低溫遺傳改良中的應(yīng)用，其特征在于該基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所示。
2.水稻0sbZIP46基因在調(diào)控耐高溫和低溫遺傳改良中的應(yīng)用，其特征在于該基因的編碼的氣基酸序列如序列表SEQ ID NO 2所不。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種水稻基因OsbZIP46在調(diào)控耐熱性和耐冷性中的應(yīng)用。該基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示；該基因的編碼的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO2所示。本發(fā)明采用候選基因篩選方法，克隆到控制水稻抗熱性和抗冷性的基因OsbZIP46，超量表達(dá)OsbZIP46基因增強(qiáng)了對ABA信號的傳導(dǎo)能力，提高了轉(zhuǎn)基因水稻抗熱和抗冷的能力，證實了該基因的功能及應(yīng)用途徑。
文檔編號C12N15/87GK102747099SQ20111009971
公開日2012年10月24日 申請日期2011年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月21日
發(fā)明者唐寧, 熊立仲 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)