專利名稱：一種產(chǎn)納豆激酶枯草芽孢桿菌及該菌種發(fā)酵生產(chǎn)納豆激酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，尤其是一種產(chǎn)納豆激酶枯草芽孢桿菌及其發(fā)酵生產(chǎn)納豆激酶的方法。
背景技術(shù)：
納豆激酶是一種由納豆芽孢桿菌產(chǎn)生的一種堿性絲氨酸蛋白酶，具有較強(qiáng)的溶栓特性，利用固態(tài)發(fā)酵方式產(chǎn)納豆激酶，具有簡單易行、成本低廉等特點(diǎn)。納豆激酶，可直接分解血栓，每克濕納豆溶栓效果相當(dāng)于尿激酶1600IU。納豆激酶對血栓的作用時(shí)間長達(dá)8-12 小時(shí)，而尿激酶作用時(shí)間只有30分鐘。尿激酶只能注射，納豆激酶即可注射也可口服，而且可以在毛細(xì)血管中發(fā)揮作用。納豆在日本已食用1000年，是一種安全的食用血栓預(yù)防劑。 目前，利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶的培養(yǎng)基種類很多，大都成本比較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)納豆激酶枯草芽孢桿菌及該菌種發(fā)酵生產(chǎn)納豆激酶的方法，本方法以豆粕為原料利用枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)目的的技術(shù)方案如下一種產(chǎn)納豆激酶枯草芽孢桿菌，名稱為TK-I，分類名稱Baci 11 ius subtilis，保藏編號為CGMCC似.4731，保藏日期2011年4月2日，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路 1號院3號，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。一種利產(chǎn)納豆激酶枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)納豆激酶的方法，發(fā)酵培養(yǎng)基包括豆粕。而且，所述發(fā)酵培養(yǎng)基為豆粕水的重量比為1 1-2，pH6. 5-7. 5，豆粕用水浸泡 3-4h。而且，發(fā)酵培養(yǎng)基確定為豆粕水的重量比為1 1.2，PH7.0，豆粕用水浸泡 3-4h。而且，所述發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌為經(jīng)110°C高壓滅菌20min。而且，發(fā)酵的接種與培養(yǎng)條件為以5-15%的種子液接種量，將產(chǎn)納豆激酶枯草芽孢桿菌TK-I (CGMCC No. 4731)種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，并攪拌，培養(yǎng)溫度30_45°C，培養(yǎng)箱濕度60-70% RH,培養(yǎng)24h。而且，發(fā)酵的接種與培養(yǎng)條件為以10%的種子液接種量，將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌，培養(yǎng)溫度37 °C，培養(yǎng)箱濕度65% RH，培養(yǎng)24h。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是1、本發(fā)明中的枯草芽孢桿菌以豆粕為原料固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶，豆粕的價(jià)格就比較低，且豆粕中蛋白質(zhì)含量很高，利于菌體的生長，獲得的納豆激酶酶活最高達(dá)到5670FU/g 干基，活菌數(shù)最高可以達(dá)到7*109cfu/g。
2、本發(fā)明以食品級豆粕為主要原料發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶，豆粕是大豆提取豆油后得到的一種副產(chǎn)品，含蛋白質(zhì)40-50%，其主要成分還有氨基酸，豐富的微量元素和較少含量的脂肪，含水量一般在10% _20%，豐富的營養(yǎng)成分可以滿足納豆芽孢桿菌生長及產(chǎn)酶的需要，目前國內(nèi)還未有只以豆粕為原料利用納豆芽孢桿菌產(chǎn)納豆激酶的記載。


圖1本發(fā)明枯草芽孢桿菌液態(tài)種子液生長曲線；圖2本發(fā)明枯草芽孢桿菌固態(tài)培養(yǎng)基生長曲線；圖3本發(fā)明枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵豆粕產(chǎn)納豆激酶曲線測定。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)一步說明，下述實(shí)施例是說明性的，不是限定性的， 不能以下述實(shí)施例來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。一種產(chǎn)納豆激酶枯草芽孢桿菌，名稱為TK-I，分類名稱Baci 11 ius subtilis，保藏編號為CGMCC似.4731，保藏日期2011年4月2日，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路 1號院3號，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。1、斜面培養(yǎng)基牛肉膏0. 5%，蛋白胨1%，氯化鈉0. 5%，瓊脂2%,pH7. 0 7. 2， 121°C滅菌20分鐘，培養(yǎng)條件37°C培養(yǎng)48h。菌株枯草芽孢桿菌TK-I在斜面培養(yǎng)基上37°C溫度下培養(yǎng)48小時(shí)，在斜面試管中加入20ml無菌水，用接種環(huán)刮取少量菌苔于無菌水，振蕩混勻，制成菌懸液，取Iml菌懸液接種于盛有99ml液態(tài)種子培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中，于37°C，150rpm搖床上培養(yǎng)8小時(shí)， 獲得種子液。2、種子培養(yǎng)液態(tài)種子液培養(yǎng)基蛋白胨1%，葡萄糖2%，磷酸氫二鉀0. 1%，硫酸鎂0.05%， PH7. 0 7. 2。培養(yǎng)條件取斜面保存的枯草芽孢桿菌接種于液態(tài)種子液培養(yǎng)基，37°C， 150rpm培養(yǎng)，每兩小時(shí)取樣600nm條件下測OD值。對數(shù)生長期在6_16h。確定接種發(fā)酵培養(yǎng)基的時(shí)間為8小時(shí)。并測定生長曲線，見圖1。3、固態(tài)培養(yǎng)(發(fā)酵培養(yǎng))發(fā)酵培養(yǎng)基新鮮豆粕20g，加水比1 1.2，水的？!17.0。用水浸泡3_4h。接種與培養(yǎng)條件以10%的種子液接種量，將種子液接入固態(tài)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度37°C，培養(yǎng)箱濕度65% RH，培養(yǎng)24小時(shí)，并測定生長曲線，每2小時(shí)取樣，檢測活菌數(shù)， 見圖2。每2小時(shí)取樣，每IOg培養(yǎng)基用50ml生理鹽水，在4°C下浸提4小時(shí)后，4500rpm 20min離心取上清液，按酶活測定方法測納豆激酶活力，見圖3。由圖可知，最佳發(fā)酵時(shí)間為 24小時(shí)。4、含不同濃度豆粕發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌情況實(shí)例1豆粕不加蒸餾水浸泡，經(jīng)121°C高壓滅菌20min。結(jié)果豆粕發(fā)生褐變，少部分豆粕成焦糊狀。實(shí)例2
豆粕以1 1.2加水比加入蒸餾水，拌勻，浸泡3_4h后，經(jīng)121°C高壓滅菌20min。結(jié)果豆粕褐變程度較輕。實(shí)例3豆粕以1 1.2加水比加入蒸餾水，拌勻，浸泡3_4h后，經(jīng)115°C高壓滅菌30min。結(jié)果豆粕褐變程度較輕。實(shí)例4豆粕以1 1.2加水比加入蒸餾水，拌勻，浸泡3_4h后，經(jīng)110°C高壓滅菌20min。結(jié)果豆粕未發(fā)生褐變，滅菌后無雜菌。以例4滅菌方式滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基，能夠達(dá)到最佳滅菌效果，也解決了培養(yǎng)基滅菌后發(fā)生褐變的問題。5、產(chǎn)納豆激酶枯草芽孢桿菌TK-I發(fā)酵生產(chǎn)納豆激酶的方法，實(shí)施例如下以下實(shí)施例用的種子液為步驟1中獲得的種子液。實(shí)施例1發(fā)酵培養(yǎng)基新鮮豆粕20g，加水比1 1.2，水的？!17.0。用水浸泡3_4h。接種與培養(yǎng)條件以10%的種子液接種量，將種子液接入固態(tài)培養(yǎng)基中，用無菌鑷子夾碎培養(yǎng)基，并攪拌，使種子液和培養(yǎng)基混勻，培養(yǎng)溫度37°C，培養(yǎng)箱濕度65% RH。培養(yǎng) 24h。測得酶活為5670FU/g干基實(shí)施例2發(fā)酵培養(yǎng)基新鮮豆粕20g，加水比1 2，水的pH7.5。用水浸泡3_4h。接種與培養(yǎng)條件以10%的種子液接種量，將種子液接入固態(tài)培養(yǎng)基中，用無菌鑷子夾碎培養(yǎng)基，并攪拌，使種子液和培養(yǎng)基混勻，培養(yǎng)溫度37°C，培養(yǎng)箱濕度65% RH。培養(yǎng) 24h。測得酶活為2500FU/g干基實(shí)施例3發(fā)酵培養(yǎng)基新鮮豆粕20g，加水比1 1.2，水的？!17.0。用水浸泡3_4h。接種與培養(yǎng)條件以10%的種子液接種量，將種子液接入固態(tài)培養(yǎng)基中，用無菌鑷子夾碎培養(yǎng)基，并攪拌，使種子液和培養(yǎng)基混勻，培養(yǎng)溫度40°C，培養(yǎng)箱濕度65% RH。培養(yǎng) 24h。測得酶活為2250FU/g干基實(shí)施例4發(fā)酵培養(yǎng)基新鮮豆粕20g，加水比1 1.2，水的？!17.0。用水浸泡3_4h。接種與培養(yǎng)條件以20%的種子液接種量，將種子液接入固態(tài)培養(yǎng)基中，用無菌鑷子夾碎培養(yǎng)基，并攪拌，使種子液和培養(yǎng)基混勻，培養(yǎng)溫度37°C，培養(yǎng)箱濕度65% RH。培養(yǎng) 24h。測得酶活為4250FU/g干基實(shí)施例5發(fā)酵培養(yǎng)基新鮮豆粕20g，加水比1 1，水的pH7. 0。用水浸泡3_4h。接種與培養(yǎng)條件以10%的種子液接種量，將種子液接入固態(tài)培養(yǎng)基中，用無菌鑷子夾碎培養(yǎng)基，并攪拌，使種子液和培養(yǎng)基混勻，培養(yǎng)溫度37°C，培養(yǎng)箱濕度65% RH。培養(yǎng) 24h。測得酶活為3550FU/g干基結(jié)果以酶活高低為依據(jù)，發(fā)酵培養(yǎng)基確定為新鮮豆粕20g，加水比1 1.2(重量比)， 水的PH7.0。用水浸泡3-4h ；接種與培養(yǎng)條件為以10%的種子液接種量，將種子液接入固態(tài)培養(yǎng)基中，用無菌鑷子夾碎培養(yǎng)基，并攪拌，使種子液和培養(yǎng)基混勻，培養(yǎng)溫度37°C，培養(yǎng)箱濕度65% RH，培養(yǎng)24h。本發(fā)明中測定酶活所用的方法和試劑如下酶活測定粗酶液制備1克發(fā)酵物用5ml無菌生理鹽水在4°C下，浸提4小時(shí)，浸提液經(jīng)4500rpm離心20分鐘，上清液即為粗酶液。酶活單位的定義一個(gè)酶活性單位(FU)定義為在指定實(shí)驗(yàn)流程的條件下，1分鐘，濾液在275nm處的吸光度值增加0. 01所需的酶量。所用試劑及配置方法如下(1)0. 05mol/L 硼酸鹽緩沖液(pH8. 5，含 NaCl) 19. 07gNa2B407 ·IOH2O 和 9. OgNaCl 溶于900ml蒸餾水中。用高濃度鹽酸調(diào)節(jié)pH，用蒸餾水定容至1000ml。(2)0. 2mol/L三氯醋酸(TCA)溶液用蒸餾水中溶解32. 68gTCA，定溶至1000ml。(3)0. 72%纖維蛋白原溶液用吸液管吸取IOmlO. 05mol/L硼酸鹽緩沖液于愛倫美氏瓶，加入 96mg 纖維蛋白原(SIGMA，F(xiàn)IBRINOGEN (Fraction I) Type I-S :From Bovine Plasma,PRODUCT NUMBER F8630)，瓶子始終保持站立。用玻璃棒碾碎不溶物直至完全溶解。 用濾紙過濾混合物(ADVANTEC，No. 6，7cm)，移除不溶物。準(zhǔn)備使用。(注釋I)。(4)凝血酶溶液用0. 05mol/L硼酸鹽緩沖液溶解凝血酶(SIGMA，F(xiàn)rom Bovine Plasma, PRODUCT NUMBER T6634)，制成lOOOU/mL溶液。一點(diǎn)一點(diǎn)的分裝到瓶子里，冷凍保存。使用前，凝血酶在0. 05mol/L硼酸鹽緩沖液中混勻。(5) lmol/L醋酸溶液用蒸餾水溶解60. Ig醋酸，定溶至1000ml。(6) lmol/L 醋酸鹽緩沖液(ρΗ6· 0)用蒸餾水溶解 129. 6g CH3COONa · 3H20。加入 47. 6mllmol/L醋酸溶液，并用蒸餾水定容至1000ml。(7)10% Triton X-100溶液在蒸餾水中加熱溶解IOg Triton X-100，并用蒸餾水定容至100ml。(注釋II)(8)稀釋液用蒸餾水溶解0. 344g (最終濃度2mmol/L) CaSO4 · 2H20和0. 585g (最終濃度lOmmol/L) NaCl。加入2. 0ml lmol/L醋酸緩沖液(pH6. 0)，0. 5ml (最終濃度 0. 005% ) 10% Triton X-100 溶液，用蒸餾水定容至 1000ml。準(zhǔn)備樣品溶液用稀釋液稀釋樣品使濾液的校正吸光度值在0. 04和0. 08之間。濃縮液濃度通常在 0. 67-1. 33FU/g 之間。實(shí)驗(yàn)步驟1.將1. 4ml 0. 05mol/L硼酸鹽緩沖液和0. 4ml 0. 72%纖維蛋白原溶液分裝到同一個(gè)試管中，纖維蛋白原溶液在37士0. 3°C水浴箱中提前孵育5分鐘。2.加入0. Olml凝血酶溶液，混勻。(注釋III)
3. 10分鐘之后，加入0. Iml樣品溶液，混合5秒，37 士 0. 3°C孵育。4.反應(yīng)開始后20和40分鐘時(shí)，分別混合5秒。5. 60分鐘后，加入2ml 0. 2mol/L TCA溶液終止反應(yīng)，37士0. 3°C孵育20分鐘。6.將混合液移入微量離心管中，15000rpm離心5分鐘。7.用巴氏吸管小心地將Iml上清液移入玻璃管中，275nm處讀取吸光度值(AT)。(空白試驗(yàn))8.將1. 4ml 0. 05mol/L硼酸鹽緩沖液和0. 4ml 0. 72%纖維蛋白原溶液分裝到同一個(gè)試管中，纖維蛋白原溶液在37士0. 3°C水浴箱中提前孵育5分鐘。9.加入0. Olml凝血酶溶液，混勻。10. 10分鐘之后，加入2ml 0. 2mol/L TCA溶液，混合5分鐘。11.在混合液中加入0. Iml樣品溶液，混合5秒，37士0. 3°C孵育20分鐘。12.將混合液移入微量離心管中，15000rpm離心5分鐘。13.用巴氏吸管小心地將Iml上清液移入玻璃管中，275nm處讀取吸光度值(AB)。 (注釋IV)計(jì)算納豆激酶活力(FU/g) = (AT-AB)/0. 01*1/60*1/0. 1*D，其中D 樣品稀釋率注釋I酶活力因纖維蛋白原的份額而不同。因此，當(dāng)纖維蛋白原的份額變化時(shí)，有必要乘以校正系數(shù)來校正酶活力。II室溫下，稀釋液可以保存15天。III每次用攪拌器來混合IV為了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，標(biāo)準(zhǔn)樣品應(yīng)該在每個(gè)檢測批同時(shí)化驗(yàn)。以下將結(jié)合具體的實(shí)施例對本發(fā)明的方法進(jìn)行更具體的描述，但本發(fā)明并不限于具體實(shí)施例。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)納豆激酶枯草芽孢桿菌，其特征在于名稱為TK-1，分類名稱Bacillius subtilis，保藏編號為=CGMCC No. 4731，保藏日期:2011年4月2日，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
2.一種利用如權(quán)利要求1所述產(chǎn)納豆激酶枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)納豆激酶的方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基包括豆粕。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的發(fā)酵生產(chǎn)納豆激酶的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基為 豆粕水的重量比為1 1-2，ρΗ6· 5-7. 5，豆粕用水浸泡3_4h。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的發(fā)酵生產(chǎn)納豆激酶的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基為 豆粕水的重量比為1 1.2, ρΗ7· 0，豆粕用水浸泡3-4h。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的發(fā)酵生產(chǎn)納豆激酶的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌為經(jīng)110°C高壓滅菌20min。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的發(fā)酵生產(chǎn)納豆激酶的方法，其特征在于發(fā)酵的接種與培養(yǎng)條件為以5-15%的種子液接種量，將產(chǎn)納豆激酶枯草芽孢桿菌TK-1CGMCC No. 4731種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，并攪拌，培養(yǎng)溫度30-45°C，培養(yǎng)箱濕度60-70% RH，培養(yǎng)24h。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的發(fā)酵生產(chǎn)納豆激酶的方法，其特征在于發(fā)酵的接種與培養(yǎng)條件為以10%的種子液接種量，將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌，培養(yǎng)溫度37°C，培養(yǎng)箱濕度65% RH，培養(yǎng)24h。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)納豆激酶枯草芽孢桿菌及其發(fā)酵生產(chǎn)納豆激酶的方法，菌種名稱為TK-1，分類名稱Bacillius subtilis，保藏編號為CGMCC No.4731，保藏日期2011年4月2日，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。發(fā)酵培養(yǎng)基中含有豆粕，發(fā)酵的方法主要包括發(fā)酵培養(yǎng)基包括豆粕。本發(fā)明中的枯草芽孢桿菌以豆粕為原料固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶，豆粕的價(jià)格就比較低，且豆粕中蛋白質(zhì)含量很高，利于菌體的生長，獲得的納豆激酶酶活最高達(dá)到5670FU/g干基，活菌數(shù)最高可以達(dá)到7×109cfu/g。
文檔編號C12N9/56GK102220258SQ201110099838
公開日2011年10月19日 申請日期2011年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月20日
發(fā)明者劉逸寒, 孫巖, 杜連祥, 王建玲, 王彥, 王海寬, 陳艷 申請人:天津科技大學(xué)