專利名稱：一種優(yōu)化的小麥轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于小麥轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域，涉及一種優(yōu)化的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的縱切幼苗葉基座轉(zhuǎn)化小麥的方法。
背景技術(shù)：
小麥?zhǔn)强偖a(chǎn)量占第二位的糧食作物，在世界各地廣泛種植。隨著世界人口的增長(zhǎng)和人們生活水平的提高，人們對(duì)小麥的需求量越來(lái)越大，對(duì)小麥品質(zhì)的要求也越來(lái)越高。常規(guī)育種已不能滿足人們對(duì)小麥品種和品質(zhì)的要求。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展打破了常規(guī)育種的種族限制，許多作物比如玉米、油菜等利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)成功培育出了優(yōu)質(zhì)、高效的轉(zhuǎn)基因新品種。與其他作物相比，小麥的轉(zhuǎn)基因育種相對(duì)滯后，轉(zhuǎn)基因成功的例子較少，這由于小麥組織培養(yǎng)植株的再生頻率低，建立穩(wěn)定高效的再生體系比較困難；另一方面，小麥?zhǔn)嵌啾扼w作物，基因組大，遺傳背景復(fù)雜，遺傳轉(zhuǎn)化體系不完善。目前，小麥轉(zhuǎn)基因的方法主要有花粉管通道法、基因槍法、PEG介導(dǎo)法以及農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。花粉管通道法是利用植物授粉后花粉萌發(fā)形成的花粉管，將外源DNA導(dǎo)入尚不具備正常細(xì)胞壁的卵、合子或早期胚胎細(xì)胞中。該方法具有操作簡(jiǎn)單、耗費(fèi)低廉、不需要經(jīng)過(guò)繁瑣的組織培養(yǎng)過(guò)程等優(yōu)點(diǎn)，但是目前該方法尚不成熟，DNA的導(dǎo)入時(shí)間和部位往往會(huì)影響植株的結(jié)實(shí)率，最終很難得到轉(zhuǎn)基因后代?；驑尫ㄊ切←溵D(zhuǎn)基因育種的主要方法，在獲得的小麥轉(zhuǎn)基因植株的報(bào)道中，基因槍法占了絕大多數(shù)，這主要由于該方法不受作物基因型的限制、方法相對(duì)簡(jiǎn)單，目前基因槍介導(dǎo)的小麥轉(zhuǎn)化體系已經(jīng)比較完善。但是基因槍法需要經(jīng)過(guò)復(fù)雜的組織培養(yǎng)和植株再生過(guò)程，成本花費(fèi)高、周期長(zhǎng)，不利于轉(zhuǎn)基因小麥的產(chǎn)業(yè)化。 PEG法主要是以原生質(zhì)體為受體的轉(zhuǎn)化方法，由于小麥的原生質(zhì)體再生困難，限制了該方法的使用。由于小麥不是農(nóng)桿菌的天然宿主、谷物類作物對(duì)農(nóng)桿菌沒(méi)有傷感反應(yīng)等原因，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥轉(zhuǎn)化一直是擺在分子生物學(xué)家和育種學(xué)家面前的一道難題。后來(lái)人們雖然實(shí)現(xiàn)了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥轉(zhuǎn)化，但是受到基因型、組織培養(yǎng)條件、外植體類型、農(nóng)桿菌菌株等限制，目前農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥轉(zhuǎn)化效率低，需要組織培養(yǎng)和植株再生階段，周期比較長(zhǎng)， 不利于產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展。由于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法具有易操作、低費(fèi)用、高效率、插入片段的確定性好、拷貝數(shù)低等獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，因此通過(guò)研究來(lái)提高農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化效率具有主要的意義。本發(fā)明提供了一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥活體轉(zhuǎn)化方法，除了具有上述農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的通用優(yōu)點(diǎn)外， 還具有轉(zhuǎn)化植株存活率高、不需經(jīng)過(guò)復(fù)雜的組織培養(yǎng)等優(yōu)越性，具有很高的實(shí)際操作性和市場(chǎng)推廣價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種優(yōu)化的縱切幼苗葉基座轉(zhuǎn)化小麥的轉(zhuǎn)基因方法，包括 首先浸泡小麥種子使之吸水飽和，長(zhǎng)出下胚軸；將含有目的基因的農(nóng)桿菌用滲透培養(yǎng)基懸?。挥?1號(hào)手術(shù)刀在小麥的葉基座中間部位縱切致傷。
本發(fā)明人經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的探索發(fā)現(xiàn)，下胚軸的長(zhǎng)度是影響小麥分化的關(guān)鍵因素，本發(fā)明下胚軸的長(zhǎng)度優(yōu)選為1. 5cm。含有目的基因的農(nóng)桿菌的獲得，是將目的基因插入表達(dá)載體，再將該載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌中。常用的表達(dá)載體包括但不限于=PBin系列載體、pBI系列在、Gateway系列載體、 pCAMBIA系列載體；常用的農(nóng)桿菌菌株包括但不限于AGL0、AGL1、GV3101、EHA105、LBA4404寸。小麥幼苗的致傷位置和方式是影響小麥轉(zhuǎn)基因效率的另一個(gè)重要因素。本發(fā)明人經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期艱苦的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)縱切部位為小麥幼苗的葉基座時(shí)轉(zhuǎn)化效率最高，具體操作為用 11號(hào)手術(shù)刀的刀尖插入葉基座的中央部位，刀刃向基部方向輕輕斜拉出，縱切傷口長(zhǎng)度優(yōu)選為1.5mm。刀刃不能穿透葉基座。在整個(gè)致傷過(guò)程中，小麥的幼苗植株是完整的，所以本發(fā)明中小麥縱切轉(zhuǎn)化后植株的生長(zhǎng)狀態(tài)良好，能夠得到高轉(zhuǎn)化效率的轉(zhuǎn)基因后代。本發(fā)明所提供的縱切小苗幼苗葉基座轉(zhuǎn)化小麥的轉(zhuǎn)基因方法是一種優(yōu)化的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的活體轉(zhuǎn)化方法，操作簡(jiǎn)便、轉(zhuǎn)化效率高、不需經(jīng)過(guò)復(fù)雜而漫長(zhǎng)的組織培養(yǎng)階段、 轉(zhuǎn)化后小麥生長(zhǎng)狀態(tài)良好，具有非常大的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值和市場(chǎng)推廣前景。為了便于理解，下面將結(jié)合附圖和實(shí)施例進(jìn)一步詮釋本發(fā)明。具體實(shí)例和附圖僅是為了更好的闡述本發(fā)明， 并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。顯然本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)本文說(shuō)明，在本發(fā)明的范圍內(nèi)對(duì)本發(fā)明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發(fā)明的范圍內(nèi)。


附圖 1 :pcambial300-bar 的質(zhì)粒圖譜。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見(jiàn) 《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》 (Sambrook， J. ， Russell, David W.， Molecular Cloning: A Laboratory Manual，3rd edition,2001,NY,Cold Spring Harbor)。 所用引物及DNA序列均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。實(shí)施例一、縱切幼苗葉原基轉(zhuǎn)化小麥
1.實(shí)驗(yàn)材料
質(zhì)粒含有bar基因，帶有潮霉素篩選標(biāo)記基因的pCambial300-bar載體，具有抗草銨磷除草劑。PCR擴(kuò)增bar基因連接到pcambial300 (購(gòu)自hvitrogen公司)載體上得到 pcambial300-bar i^f 本。農(nóng)桿菌菌株AGLO。供轉(zhuǎn)化的小麥品種京麥9158
2.農(nóng)桿菌的培養(yǎng)
挑取甘油凍存的含有目的基因的農(nóng)桿菌，于YEB平板上畫(huà)線，黑暗培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 天。挑取單菌落接種于40ml抗性YEB液體培養(yǎng)基中黑暗搖床200rpm搖過(guò)夜，至 OD600 1。吸取上述培養(yǎng)物250 300 μ 1涂布于平板直徑為15cm的YEB固體培養(yǎng)基上， 黑暗培養(yǎng)箱培養(yǎng)2天后，此備用的新鮮平板當(dāng)天使用，約20°C室溫黑暗待用，不要繼續(xù)存留于黑暗培養(yǎng)箱或轉(zhuǎn)存于4°C冰箱。
3.滲透培養(yǎng)基的制備
首先按照下述配方配制AA培養(yǎng)基。AA培養(yǎng)基配制(IL) MgSO40. 12209g KCl 2.95g NaH2PO4 2H20 0. 15g 肌醇 0. Ig 谷氨酸 0.876g
天門(mén)冬氨酸 0. 266g 精氨酸0. 174g
酪蛋白水解物 0. 3g 蔗糖20g
鐵鹽溶液5ml ① EDTA-2Na 7. 46g/L 調(diào) pH=8. 0
②再加4. 5ml/L 5M NaCl
③FeSO4 7H20 5. 56g/L
CaCl2 溶液 4. 5ml25.06g/L
VB1 溶液IOmllg/L
VB6 溶液Imllg/L
畑酸溶液Iml0. lg/L
B5 微量ImlMnSO4 H2O 7. 58g/L
ZnSO4 7H20 2. Og/L H3BO33. Og/L
KI0. 75g/L
Na2MoO4 2H20 0. 25g/L
CuSO4 5H20 0. 025g/L
CoCl2 6H20 0. 025g/L
在IL AA培養(yǎng)基中添加下列成分
As (100 200 ii M )； KT (0. 2mg)； 2，4_D (Img)5DTT (ImM )； L-Cysteine (200 400mg) ；silwet-L77 (100 400 ぬ)。
將培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌用上述滲透培養(yǎng)基懸浮，使懸浮菌液的0D_值為0. 4 0. 7，pH至 5. 0 5. 5，轉(zhuǎn)化滲透培養(yǎng)液制備完畢。4.植株選擇準(zhǔn)備
浸泡小麥種子使之吸水飽和后25 0C，14小時(shí)光照10小時(shí)黑暗，保濕條件下萌發(fā)3 4天，每天早晩各清洗一次，至胚軸長(zhǎng)至1. 5cm。5.農(nóng)桿菌菌液浸染小麥幼苗葉基座
(1)幼苗浸泡在上述滲透培養(yǎng)基中，用11號(hào)手木刀的刀尖插入葉基座的中央部位， 刀刃向基部方向輕輕斜拉出，縱切傷ロ長(zhǎng)度為1. 5mm,不要穿透葉基座，使小麥植株是完整 的；
(2)致傷處理后的小麥幼苗浸沒(méi)在滲透培養(yǎng)基中，28°C，24小時(shí)黑暗條件下140 170rpm 培養(yǎng) 15 30min ；
(3)侵染后的小麥幼苗在吸水紙上空干，隨后種入濕潤(rùn)的蛭石+營(yíng)養(yǎng)土(2 :1)混合土中，覆土，25 ^°C，M小時(shí)黑暗條件下培養(yǎng)2天，然后移栽到大棚中培養(yǎng)。
權(quán)利要求
1.一種優(yōu)化的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的縱切幼苗葉基座轉(zhuǎn)化小麥的轉(zhuǎn)基因方法，包括首先浸泡小麥種子使之吸水飽和，長(zhǎng)出下胚軸；將含有目的基因的農(nóng)桿菌用滲透培養(yǎng)基懸浮；用11 號(hào)手術(shù)刀在小麥的葉基座中間部位縱切致傷。
2.權(quán)利要求1所述的小麥轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于浸泡小麥種子使之吸水飽和，長(zhǎng)出下胚軸，下胚軸的長(zhǎng)度為1. 5cm。
3.權(quán)利要求1所述的小麥轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于用11號(hào)手術(shù)刀在小麥的葉基座中間部位縱切致傷口長(zhǎng)度為1. 5mm。
全文摘要
本發(fā)明提供了供一種優(yōu)化的縱切幼苗葉基座轉(zhuǎn)化小麥的轉(zhuǎn)基因方法，包括首先浸泡小麥種子使之吸水飽和，長(zhǎng)出下胚軸；將含有目的基因的農(nóng)桿菌用滲透培養(yǎng)基懸?。挥?1號(hào)手術(shù)刀在小麥的葉基座中間部位縱切致傷。
文檔編號(hào)C12N15/82GK102329814SQ20111010025
公開(kāi)日2012年1月25日 申請(qǐng)日期2011年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月14日
發(fā)明者何峰, 夏勉, 張建新, 張斌 申請(qǐng)人:北京未名凱拓作物設(shè)計(jì)中心有限公司