專利名稱：一種激光顯微切割染色體標本制作液及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于染色體激光顯微切割技術領域，具體涉及一種激光顯微切割染色體標本制作液及其應用。
背景技術：
染色體切割的方法目前可以分為兩種，即顯微玻璃針分離法和激光切割法。顯微玻璃針分離法是借助顯微操作儀，在顯微鏡下用尖端直徑約2微米的玻璃針對完整的目標染色體或者目標帶紋區(qū)段進行切割和分離。該技術使用范圍廣泛，但是需要調(diào)節(jié)性能好、放大倍數(shù)足夠大的顯微操作儀，而且要求實驗者要有非常高的操作技術。激光切割法是利用熱效應較低的波長為340 355nm的激光微束，通過計算機控制其軌跡，切割目標染色體。 與玻璃針切割法相比，該方法精確、高效、操作方便、容易掌握。但是到目前為止，激光顯微切割系統(tǒng)更多的是被用于各種細胞及組織的切割分離，而對于染色體的顯微切割，卻僅有很少的研究報道。究其原因，大多數(shù)的激光顯微切割系統(tǒng)在進行顯微切割時，采用了特殊的專用表面覆膜載玻片，而在這種載玻片上制備出形態(tài)好、數(shù)量多且能夠用于切割的染色體分裂相具有很大的難度。目前進行激光顯微切割的染色體制備，仍然在使用通用的制片方法，因此迫切需要從染色體標本的制作液等方面進行改進，以方便進行染色體激光顯微切割操作。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種激光顯微切割染色體標本制作液及其應用，即提供一種有效的激光顯微切割染色體標本制作液，并建立了一種新的染色體標本制備技術，使用該技術在激光顯微切割系統(tǒng)所使用的專用表面覆膜載玻片上制備的分裂相，染色體分散得很好，完全適合于進行染色體顯微分離。本發(fā)明的激光顯微切割染色體標本制作液，其特征在于，所述的標本制作液包含有甲醇、冰醋酸和氯仿，其體積比為5 10 1 3 1 3。上述的標本制作液中甲醇、冰醋酸和氯仿的體積比優(yōu)選為8 1 1。本發(fā)明的染色體標本制作液在制備激光顯微切割染色體標本中的應用，包括有1) 染色體的制備和2、制片兩個步驟其中1)染色體的制備步驟如下a、將實驗樣品通過酶消化或物理破碎的方法制成細胞懸液，用0. 005%秋水仙素處理1. 5小時；b、將a中樣品離心收集后，用0. 075M的KCL低滲溶液低滲處理30分鐘；C、將b中處理后的樣品再次離心收集，用卡諾固定液固定3次，每次20分鐘，最后一次固定后置于-20°C中存放；d、制片前，將c中的樣品離心收集，重新懸浮于染色體標本制作液中，細胞濃度約為1 X IO6左右，制成染色體標本工作液；
步驟2)制片具體步驟如下e、將激光顯微切割表面覆膜載玻片置于紫外燈下照射30分鐘；f、然后將e中處理過的載玻片置于染色體標本制作液中浸泡1分鐘；g、用吸管吸取少量d中的染色體標本工作液，在距離玻片上方IOcm處垂直滴下一至幾滴，待膜上的染色體樣品在空氣中完全干燥后，使用經(jīng)0. 2 μ m濾膜抽濾后的Giemsa染液染色10分鐘，再用超純水沖洗掉多余的染液，空氣中完全干燥即制得激光顯微切割染色體標本。本發(fā)明的染色體標本制作液制備的激光顯微切割染色體標本，各條染色體均分散得很好，方便后續(xù)的顯微切割操作。同時本發(fā)明的制備方法簡單實用，易于操作，方便普通技術人員的使用。


圖1 使用不同的制片方法得到的半滑舌鰨染色體標本的分裂相。A，使用本發(fā)明的染色體標本制作液(比例為8 1 1)制備的染色體標本；B，使用通用的染色體制片方法制備的染色體標本；C，使用本發(fā)明的染色體標本制作液(比例為5 1 幻制備的染色體標本；D，使用本發(fā)明的染色體標本制作(比例為10 2 1)制備的染色體標本。圖2 以切割分離的半滑舌鰨W染色體的PCR產(chǎn)物為探針進行的染色體熒光原位雜交結果，箭頭所示為W染色體。
具體實施例方式下面結合半滑舌鰨雌魚W染色體切割為例對本發(fā)明的染色體標本制作液和制備方法進行詳細的描述(1)、染色體的制備①、取半滑舌鰨的頭腎組織通過物理破碎的方法制成細胞懸液，用0. 005%秋水仙素處理1. 5小時；②、細胞離心收集后，用0. 075M的KCL低滲溶液低滲處理30分鐘；③、再次離心收集，用卡諾固定液(無水己醇冰醋酸=3 1)固定3次，每次20 分鐘，最后一次固定后置于-20°C中存放；④、制片前，將細胞離心收集，重新懸浮于激光顯微切割染色體標本制作液中，細胞濃度約為IXlO6左右，制成染色體標本工作液。O)、制片①、將切割專用表面覆膜載玻片置于紫外燈下照射30分鐘；②、然后置于激光顯微切割染色體標本制作液中浸泡1分鐘；③、用吸管吸取少量染色體標本工作液，在距離玻片上方IOcm處垂直滴下一至幾滴，待膜上的染色體樣品在空氣中完全干燥后，使用經(jīng)0. 2 μ m濾膜抽濾后的Giemsa染液染色10分鐘，再用超純水沖洗掉多余的染液，空氣中完全干燥。顯微鏡下觀察制片效果，發(fā)現(xiàn)染色體分散得非常好，很少有染色體相互重疊的情況出現(xiàn)，可以順利的進行染色體的顯微切割分離(圖1A)。④、對照組的設定按照通用的制片方法，用吸管吸取少量含有染色體材料的卡諾固定液直接滴在表面覆膜載玻片上，待樣品在空氣中完全干燥后，Giemsa染液染色10分鐘，顯微鏡下觀察制片效果。經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，染色體分散的效果非常不好，幾乎所有的分散相中染色體均有相互重疊的情況出現(xiàn)，無法進行激光顯微切割(圖1B)。⑤、不同比例的染色體標本制作液的效果比較本發(fā)明對染色體標本制作液中甲醇、冰醋酸和氯仿的比例進行了篩選，經(jīng)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，8 1 1的標本制作液具有最好的效果，而其他比例的染色體標本制作液的制片效果都沒有8 1 1比例的好，出現(xiàn)了染色體相互重疊(圖1)。(3)、激光顯微切割利用激光顯微切割系統(tǒng)對制好的染色體標本進行顯微切割分離，共分離得到40 條半滑舌鰨的W染色體。使用DOP-PCR方法擴增得到了大量的PCR產(chǎn)物，經(jīng)染色體熒光原位雜交實驗驗證了這些產(chǎn)物為W染色體的部分片段(圖2箭頭所示)，證實了該制作液及激光顯微切割方法對染色體切割分離的有效性。
權利要求
1.一種激光顯微切割染色體標本制作液，其特征在于，所述的標本制作液包含有甲醇、 冰醋酸和氯仿，其體積比為5 10 1 3 1 3。
2.如權利要求1所述的標本制作液，其特征在于上述的標本制作液中甲醇、冰醋酸和氯仿的體積比為8 1 1。
3.權利要求1或2所述的染色體標本制作液在激光顯微切割染色體標本制備中的應用。
4.權利要求3所述的激光顯微切割染色體標本制備，包括有1)染色體的制備和2)制片兩個步驟，其中1)染色體的制備步驟如下a、將實驗樣品通過酶消化或物理破碎的方法制成細胞懸液，用0.005%秋水仙素處理 1. 5小時；b、將a中樣品離心收集后，用0.075M的KCL低滲溶液低滲處理30分鐘；c、將b中處理后的樣品再次離心收集，用卡諾固定液固定3次，每次20分鐘，最后一次固定后置于-20°C中存放；d、制片前，將c中的樣品離心收集，重新懸浮于染色體標本制作液中，細胞濃度為 1 X IO6,制成染色體標本工作液；步驟2)制片具體步驟如下e、將激光顯微切割表面覆膜載玻片置于紫外燈下照射30分鐘；f、然后將e中處理過的載玻片置于染色體標本制作液中浸泡1分鐘；g、用吸管吸取少量d中的染色體標本工作液，在距離玻片上方IOcm處垂直滴下一至幾滴，待膜上的染色體樣品在空氣中完全干燥后，使用經(jīng)0. 2 μ m濾膜抽濾后的Giemsa染液染色10分鐘，再用超純水沖洗掉多余的染液，空氣中完全干燥即制得激光顯微切割染色體標本。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種激光顯微切割染色體標本制作液及其應用，所述的標本制作液包含有甲醇、冰醋酸和氯仿，其體積比為5～10∶1～3∶1～3，優(yōu)選比例為8∶1∶1。本發(fā)明的染色體標本制作液用于制備激光顯微切割染色體標本。本發(fā)明的染色體標本制作液制備的激光顯微切割染色體標本，各條染色體均分散得很好，方便后續(xù)的顯微切割操作。同時本發(fā)明的制備方法簡單實用，易于操作，方便普通技術人員的使用。
文檔編號C12Q1/68GK102251024SQ201110100728
公開日2011年11月23日 申請日期2011年4月21日 優(yōu)先權日2011年4月21日
發(fā)明者于海洋, 張全啟, 王志剛, 王旭波, 齊潔 申請人:中國海洋大學