專利名稱：一種黑曲霉及其固態(tài)曲發(fā)酵生產(chǎn)飼料的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及飼料加工領(lǐng)域，特別涉及一種黑曲霉及其固態(tài)曲發(fā)酵生產(chǎn)飼料的方法。
背景技術(shù)：
近年來，隨著我國畜牧業(yè)的快速發(fā)展，對飼料的需求在數(shù)量和質(zhì)量上都有了更高的要求。提供營養(yǎng)價(jià)值高、生產(chǎn)成本低的飼料是飼料工業(yè)發(fā)展的趨勢。我國柑橘產(chǎn)量位居世界第三，近年來柑橘年產(chǎn)量均在2000萬噸以上，一般柑橘類果實(shí)榨汁后會產(chǎn)生40 50%的柑橘皮渣，大量的柑橘皮渣未經(jīng)充分利用便遭丟棄，不僅造成資源的浪費(fèi)，而且胡亂堆放霉變發(fā)臭造成環(huán)境污染。柑橘皮渣除含有香精油、果膠、黃酮類化合物、纖維素、木質(zhì)素外，還含有豐富的粗蛋白、粗脂肪、糖類化合物、微量元素等營養(yǎng)物質(zhì)，其中粗蛋白含量6. 4 8. 1 %、粗纖維含量9. 5 10.6%、粗灰分含量3. 1 3.6%、脂肪含量2. 3 2. 6%、鈣含量0. 77 0. 85%、磷含量0. 17 0. 19%，氨基酸總量為5. 85% (主要是含量為0. 48 %的賴氨酸和含量為0. 29 %的蘇氨酸)。因此，對柑橘皮渣進(jìn)行綜合利用，既能提高經(jīng)濟(jì)效益，又能充分利用資源保護(hù)環(huán)境。國內(nèi)外學(xué)者對柑橘皮渣的綜合利用進(jìn)行了大量研究，主要有以下方法提取柑橘皮渣中的有效成分，如黃酮類化合物、果膠、香精油等；將柑橘皮渣直接干燥作飼料或發(fā)酵生產(chǎn)工業(yè)原料和蛋白飼料等。將柑橘皮渣直接干燥后作為動物飼料，由于未發(fā)酵的柑橘皮渣粗蛋白含量低、適口性差，加之干燥過程能耗較大，影響柑橘皮渣直接干燥應(yīng)用于飼料的工業(yè)化生產(chǎn)。但是，柑橘皮中普遍含有果膠，易與纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、蛋白質(zhì)等結(jié)合， 不溶于水，導(dǎo)致現(xiàn)有工業(yè)化生產(chǎn)中，發(fā)酵柑橘皮渣生產(chǎn)飼料的蛋白含量較低。由于動物體內(nèi)缺乏降解果膠的酶類，無法依靠自身降解果膠，難以吸收飼料中營養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)而影響動物養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，因而果膠被認(rèn)為是動物飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子。此外，果膠具有包裹水的作用， 增加了飼料中的水分含量，易導(dǎo)致飼料霉變，如果對水分進(jìn)行處理就增大了飼料加工工藝中的干燥耗能。目前，工業(yè)生產(chǎn)多采用微生物菌株制備的固態(tài)曲發(fā)酵柑橘皮渣生產(chǎn)飼料，能夠大幅提高蛋白質(zhì)尤其是可溶性蛋白的含量，并能夠較好地降解柑橘苦素、柚皮苷等苦味物質(zhì)， 提高其適口性。但是現(xiàn)有微生物菌種產(chǎn)果膠酶的能力較低，無法有效降解果膠，限制了微生物發(fā)酵法在飼料工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明提供了保藏編號為CCTCC NO.M2011055的黑曲霉，該黑曲霉與普通黑曲霉相比，產(chǎn)果膠酶的能力顯著提高(P < 0. 05)，對果膠具有顯著的降解作用。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案本發(fā)明提供了一種黑曲霉，菌株名稱為黑曲霉315 (Aspergillus niger315)，保藏編號為CCTCC NO.M2011055。由編號為CICC40014，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心的原始菌株黑曲霉(Aspergillus niger)經(jīng)紫外光誘變和果膠誘導(dǎo)，獲得的一株新型黑曲霉菌株。本發(fā)明所述黑曲霉315(Aspergillus niger315)菌株已于2011年3月2日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)進(jìn)行保藏，保藏中心地址為武漢省武昌市珞珈山武漢大學(xué)校內(nèi)，保藏編號為CCTCC NO.M2011055。本發(fā)明還提供了通過紫外光誘變和果膠誘導(dǎo)獲得保藏編號為CCTCCNo. M2011055 的黑曲霉的方法，包括步驟1 活化菌種挑取上述黑曲霉接種于添加2. 0%葡萄糖的PDA斜面培養(yǎng)基， 置培養(yǎng)箱中于下培養(yǎng)3 4d ；所述PDA培養(yǎng)基可由質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的馬鈴薯、2%的蔗糖或葡萄糖、2%的瓊脂，加蒸餾水配制而成，自然pH值。步驟2 配制菌懸液用無菌水將斜面上的黑曲霉孢子洗下，震蕩制成黑曲霉菌懸液，約IO3 IO4個/mL。步驟3 查氏-果膠培養(yǎng)基的配制硝酸鈉3g，磷酸氫二鉀lg，硫酸鎂 (MgSO4 · 7H20) 0. 5g，氯化鉀 0. 5g，硫酸亞鐵 0. Olg,果膠 5g，瓊脂 20g,蒸餾水 IOOOmL, 121 °C
滅菌后裝培養(yǎng)皿備用。步驟4 紫外誘變將上述菌體懸浮液按0. 2mL/皿的量用無菌玻璃棒涂抹在查氏-果膠培養(yǎng)基上，后將培養(yǎng)皿置于與紫外燈(40W)相距40cm處開蓋照射lOmin，進(jìn)行誘變，再將培養(yǎng)皿倒置于30°C恒溫箱中培養(yǎng)2 3d，用剛果紅染色法，選出水解圈最大的一株菌落。步驟5 底物誘導(dǎo)挑取上述篩選出的水解圈最大的菌落制成約IO3 IO4個/mL 菌懸液，再將其按0. 2mL/皿的量用無菌玻璃棒涂抹在查氏-果膠培養(yǎng)基上，后將培養(yǎng)皿倒置于30°C恒溫箱中培養(yǎng)2 3d，用剛果紅染色法，選出水解圈最大的一株菌落，重復(fù)操作誘導(dǎo)培養(yǎng)20代，得到高產(chǎn)果膠酶的優(yōu)勢菌株，即本發(fā)明所述黑曲霉。試驗(yàn)證明，未經(jīng)紫外光誘變和果膠底物誘導(dǎo)的黑曲霉的活菌數(shù)量為5. 9X IO8個/ g曲時，產(chǎn)果膠酶酶活為635. 9021U/g曲；本發(fā)明提供的經(jīng)紫外光誘變和果膠底物誘導(dǎo)、保藏編號為CCTCC NO.M2011055的黑曲霉活菌數(shù)量為6. 2X IO8個/g曲時，產(chǎn)果膠酶酶活為 787. 201IU/g曲。經(jīng)紫外線誘變和果膠誘導(dǎo)、保藏編號為CCTCC No. M2011055的黑曲霉菌株與未經(jīng)誘變的黑曲霉菌株產(chǎn)果膠酶的能力具有顯著差異(P < 0. 05)，表明本發(fā)明提供的經(jīng)紫外線誘變和果膠誘導(dǎo)的黑曲霉菌株降解果膠的能力顯著提高。本發(fā)明還提供了由保藏編號為CCTCC NO.M2011055的黑曲霉制備的黑曲霉固態(tài)
曲ο本發(fā)明還提供了保藏編號為CCTCC NO.M2011055的黑曲霉固態(tài)曲的制備方法，包括步驟1 活化菌種挑取保藏編號為CCTCC No. M2011055的黑曲霉，接種于添加 2. O %葡萄糖的PDA斜面培養(yǎng)基，于下培養(yǎng)3 4d。步驟2 配制菌懸液將培養(yǎng)后的黑曲霉制成黑曲霉菌懸液后接種于黑曲霉制曲用的麩皮培養(yǎng)基中，在溫度為M 40°C下靜置培養(yǎng)，制得上述黑曲霉固態(tài)曲；黑曲霉制曲用的麩皮培養(yǎng)基中，麩皮填裝量為40g/L，加水量30 %。試驗(yàn)證明，將未經(jīng)紫外光誘變和果膠底物誘導(dǎo)的黑曲霉和經(jīng)紫外光誘變和果膠底物誘導(dǎo)、保藏編號為CCTCC NO.M2011055的黑曲霉在相同條件下制成固態(tài)曲，其產(chǎn)果膠酶酶活分別為1330IU/g曲和1650IU/g曲，經(jīng)紫外線誘變和果膠誘導(dǎo)、保藏編號為CCTCC NO.M2011055的黑曲霉菌株制備的固態(tài)曲與未經(jīng)誘變的黑曲霉菌株制備的固態(tài)曲產(chǎn)果膠酶的能力具有顯著差異(P < 0. 05)，表明本發(fā)明提供的經(jīng)紫外線誘變和果膠誘導(dǎo)的黑曲霉制備的固態(tài)曲降解果膠的能力顯著提高。本發(fā)明提供了上述制備方法制得的黑曲霉固態(tài)曲及其在發(fā)酵柑橘皮渣生產(chǎn)蛋白飼料中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種混合菌種固態(tài)曲，包含保藏編號為CCTCC NO.M2011055的黑曲霉制備的黑曲霉固態(tài)曲。作為優(yōu)選，保藏編號為CCTCC NO.M2011055的黑曲霉制備的黑曲霉固態(tài)曲中活菌數(shù)量為7. 2 X IO8 7. 9 X IO8個/g曲，測得果膠酶酶活為1550 1650IU/g曲。優(yōu)選地，保藏編號為CCTCC NO.M2011055的黑曲霉制備的黑曲霉固態(tài)曲中活菌數(shù)量為7. 9 X IO8個/g曲，測得果膠酶酶活為1650IU/g曲。作為優(yōu)選，上述混合菌種固態(tài)曲還可以包含嗜單寧管囊酵母固態(tài)曲和米曲霉固態(tài)曲ο作為優(yōu)選，嗜單寧管囊酵母固態(tài)曲中活菌數(shù)量為1. 45X IO8 1. 52X IO8個/g 曲，測得纖維素酶酶活為1000 1100IU/g曲；米曲霉固態(tài)曲中活菌數(shù)量為1.75X 108 1. 90 X IO8個/g曲，測得β-葡萄糖苷酶酶活為1200 1300IU/g曲。優(yōu)選地，嗜單寧管囊酵母固態(tài)曲中活菌數(shù)量為1.52X 108個/g曲，測得纖維素酶酶活為1100IU/g曲；米曲霉固態(tài)曲中活菌數(shù)量為1.90X 108 f/g曲，測得β-葡萄糖苷酶酶活為1300IU/g曲。本發(fā)明還提供了上述混合菌種固態(tài)曲的制備方法，包括步驟1 活化菌種分別挑取保藏編號為CCTCC No. M2011055的黑曲霉、嗜單寧管囊酵母和米曲霉，接種于添加2.0%葡萄糖的PDA斜面培養(yǎng)基，置培養(yǎng)箱中于下培養(yǎng) 3 4d ；上述PDA培養(yǎng)基含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的馬鈴薯、2%的蔗糖或葡萄糖、2%的瓊脂，加蒸餾水配制而成，自然pH值。步驟2 配制菌懸液，制備單菌種固態(tài)曲用無菌水將斜面上的霉菌孢子或酵母菌洗下制成保藏編號為CCTCC NO.M2011055的黑曲霉菌懸液、嗜單寧管囊酵母菌懸液和米曲霉菌懸液后，分別接種于黑曲霉制曲用的麩皮培養(yǎng)基、嗜單寧管囊酵母制曲用的麩皮培養(yǎng)基和米曲霉制曲用的麩皮培養(yǎng)基中，在溫度為M 40°C下靜置培養(yǎng)，制得黑曲霉固態(tài)曲、 嗜單寧管囊酵母固態(tài)曲和米曲霉固態(tài)曲。上述黑曲霉制曲用的麩皮培養(yǎng)基中，將菌種濃度為1. 0 X IO7個/mL的黑曲霉菌懸液按0. lmL/g接種于黑曲霉制曲用的麩皮培養(yǎng)基中；黑曲霉制曲用的麩皮培養(yǎng)基以麩皮為基礎(chǔ)，加水量30 %，制曲溫度為觀°C，制曲時間為4d。將菌種濃度為1. OX IO7個/mL的菌懸液按0. lmL/g接種于嗜單寧管囊酵母制曲用的麩皮培養(yǎng)基中；嗜單寧管囊酵母制曲用的麩皮培養(yǎng)基以麩皮為基礎(chǔ)，添加尿素作輔料，加水量40%，制曲溫度為30°C，制曲時間為5d。將菌種濃度為1. OX IO7個/mL的菌懸液按0. lmL/g接種于米曲霉制曲用的麩皮培養(yǎng)基中；米曲霉制曲用的麩皮培養(yǎng)基以麩皮為基礎(chǔ)，加水量40%，制曲溫度為32°C，制曲
5時間為5d。步驟3 制備混合種固態(tài)曲將上述保藏編號為CCTCC NO.M2011055的黑曲霉制備的黑曲霉固態(tài)曲、嗜單寧管囊酵母固態(tài)曲和米曲霉固態(tài)曲混合，制得混合菌種固態(tài)曲。為了保證上述混合菌種固態(tài)曲中保藏編號為CCTCC NO.M2011055的黑曲霉固態(tài)曲、嗜單寧管囊酵母固態(tài)曲和米曲霉固態(tài)曲中的活菌數(shù)量，保藏編號為CCTCC NO.M2011055 的黑曲霉制備的黑曲霉固態(tài)曲、嗜單寧管囊酵母固態(tài)曲和米曲霉固態(tài)曲可以按照重量比 1 0.5 3 0.5 3混合，制得混合菌種固態(tài)曲。作為優(yōu)選，上述黑曲霉固態(tài)曲、嗜單寧管囊酵母固態(tài)曲和米曲霉固態(tài)曲按照重量比為1 1.5 0.5混合，制得所述混合菌種固態(tài)曲。本發(fā)明還提供了上述混合菌種固態(tài)曲在發(fā)酵柑橘皮渣生產(chǎn)蛋白飼料中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種混合菌種固態(tài)曲發(fā)酵柑橘皮渣生產(chǎn)飼料的方法，其特征在于，所述混合菌種固態(tài)曲包含由保藏編號為CCTCC NO.M2011055的黑曲霉制備的黑曲霉固態(tài)曲。作為優(yōu)選，本發(fā)明提供的混合菌種固態(tài)曲發(fā)酵柑橘皮渣生產(chǎn)飼料的方法中，保藏編號為CCTCC NO.M2011055的黑曲霉制備的黑曲霉固態(tài)曲中活菌數(shù)量為7.2X108 7. 9 X IO8 個/g 曲。優(yōu)選地，本發(fā)明提供的混合菌種固態(tài)曲發(fā)酵柑橘皮渣生產(chǎn)飼料的方法中，保藏編號為CCTCC NO.M2011055的黑曲霉制備的黑曲霉固態(tài)曲中活菌數(shù)量為7. 9 X IO8個/g曲作為優(yōu)選，本發(fā)明提供的混合菌種固態(tài)曲發(fā)酵柑橘皮渣生產(chǎn)飼料的方法中，上述混合菌種固態(tài)曲還包含嗜單寧管囊酵母固態(tài)曲和米曲霉固態(tài)曲。優(yōu)選地，本發(fā)明提供的混合菌種固態(tài)曲發(fā)酵柑橘皮渣生產(chǎn)飼料的方法中，上述嗜單寧管囊酵母固態(tài)曲中嗜單寧管囊酵母活菌數(shù)量為1.45X 108 1.52X 108個/g曲；上述米曲霉固態(tài)曲中米曲霉活菌數(shù)量為1. 75X IO8 1. 90X IO8個/g曲。優(yōu)選地，本發(fā)明提供的混合菌種固態(tài)曲發(fā)酵柑橘皮渣生產(chǎn)飼料的方法中，嗜單寧管囊酵母固態(tài)曲中活菌數(shù)量為1.52X 108個/g曲；米曲霉固態(tài)曲中活菌數(shù)量為1.90X108 個/g曲。作為優(yōu)選，本發(fā)明提供的混合菌種固態(tài)曲發(fā)酵柑橘皮渣生產(chǎn)飼料的方法中，上述混合菌種固態(tài)曲中，黑曲霉固態(tài)曲、嗜單寧管囊酵母固態(tài)曲和米曲霉固態(tài)曲的重量比為 1 0. 5 3 0. 5 3。優(yōu)選地，本發(fā)明提供的混合菌種固態(tài)曲發(fā)酵柑橘皮渣生產(chǎn)飼料的方法中，上述混合菌種固態(tài)曲中，黑曲霉固態(tài)曲、嗜單寧管囊酵母固態(tài)曲和米曲霉固態(tài)曲的重量比為 1 1. 5 0. 5。作為優(yōu)選，本發(fā)明提供的混合菌種固態(tài)曲發(fā)酵柑橘皮渣生產(chǎn)飼料的方法中，上述混合菌種固態(tài)曲的接入量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)，為5 11%。優(yōu)選地，本發(fā)明提供的混合菌種固態(tài)曲發(fā)酵柑橘皮渣生產(chǎn)飼料的方法中，上述混合菌種固態(tài)曲的接入量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)，為9 %。作為優(yōu)選，本發(fā)明提供的混合菌種固態(tài)曲發(fā)酵柑橘皮渣生產(chǎn)飼料的方法中，培養(yǎng)溫度為32 38°C。優(yōu)選地，混合菌種固態(tài)曲發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的培養(yǎng)溫度為32°C。
作為優(yōu)選，本發(fā)明提供的混合菌種固態(tài)曲發(fā)酵柑橘皮渣生產(chǎn)飼料的方法中，培養(yǎng)時間為4 6d。優(yōu)選地，混合菌種固態(tài)曲發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的培養(yǎng)時間為6d。作為優(yōu)選，本發(fā)明提供的混合菌種固態(tài)曲發(fā)酵柑橘皮渣生產(chǎn)飼料的方法中，還可以添加0 7%的谷殼、秸稈或麩皮作輔料。作為優(yōu)選，本發(fā)明提供的混合菌種固態(tài)曲發(fā)酵柑橘皮渣生產(chǎn)飼料的方法，還包括干燥、封裝和滅菌的步驟。具體地，本發(fā)明提供的混合菌種固態(tài)曲發(fā)酵柑橘皮渣生產(chǎn)飼料的方法，包括對柑橘皮渣進(jìn)行預(yù)處理、粉碎成柑橘皮渣顆粒；在柑橘皮渣顆粒中接入5 11%混合菌種固態(tài)曲，添加0 7%的谷殼、秸稈或麩皮作輔料，在培養(yǎng)溫度為32 38°C下，培養(yǎng)時間為4 6d，制得蛋白飼料；混合菌種固態(tài)曲包含由保藏編號為CCTCC NO.M2011055的黑曲霉制備的黑曲霉固態(tài)曲；上述黑曲霉固態(tài)曲中黑曲霉活菌數(shù)量為7.2X108 7.9X108個/g曲， 測得果膠酶酶活為1550 1650IU/g曲。作為優(yōu)選，保藏編號為CCTCC No.M2011055的黑曲霉制備的黑曲霉固態(tài)曲中活菌數(shù)量為7.9X108個/g曲，測得果膠酶酶活為1650IU/g 曲。作為優(yōu)選，混合菌種固態(tài)曲還包含嗜單寧管囊酵母固態(tài)曲和米曲霉固態(tài)曲。優(yōu)選地，上述混合菌種固態(tài)曲中，嗜單寧管囊酵母固態(tài)曲中嗜單寧管囊酵母活菌數(shù)量為1.45X 108 1. 52X 108個/g曲，測得纖維素酶酶活為1000 1100IU/g曲。優(yōu)選地，上述混合菌種固態(tài)曲中，嗜單寧管囊酵母固態(tài)曲中嗜單寧管囊酵母活菌數(shù)量為1.52X 108個/g曲，測得纖維素酶酶活為1100IU/g曲。優(yōu)選地，上述混合菌種固態(tài)曲中，米曲霉固態(tài)曲中米曲霉活菌數(shù)量為1.75X 108 1.90X 108個/g曲，測得β-葡萄糖苷酶酶活為1200 1300IU/g曲。 優(yōu)選地，上述混合菌種固態(tài)曲中，米曲霉固態(tài)曲中米曲霉活菌數(shù)量為1.90X 108個/g曲，測得β -葡萄糖苷酶酶活為1300IU/g曲。本發(fā)明提供了保藏編號為CCTCC NO.M2011055的黑曲霉。試驗(yàn)證明，未經(jīng)紫外光誘變和果膠底物誘導(dǎo)的黑曲霉的活菌數(shù)量為5.9X108個/g曲時，產(chǎn)果膠酶酶活為635. 902IU/g曲；本發(fā)明提供的經(jīng)紫外光誘變和果膠底物誘導(dǎo)、保藏編號為CCTCC NO.M2011055的黑曲霉活菌數(shù)量為6. 2X108個/g曲時，產(chǎn)果膠酶酶活為787. 201IU/g曲。 經(jīng)紫外線誘變和果膠誘導(dǎo)、保藏編號為CCTCC NO.M2011055的黑曲霉菌株與未經(jīng)誘變的黑曲霉菌株產(chǎn)果膠酶的能力具有顯著差異(P <0.05)，表明本發(fā)明提供的經(jīng)紫外線誘變和果膠誘導(dǎo)的黑曲霉菌株降解果膠的能力顯著提高。本發(fā)明還提供了保藏編號為CCTCC NO.M2011055的黑曲霉制備的黑曲霉固態(tài)曲，試驗(yàn)結(jié)果表明，未經(jīng)紫外光誘變和果膠底物誘導(dǎo)的黑曲霉固態(tài)曲產(chǎn)果膠酶酶活為1330IU/g曲，本發(fā)明提供的經(jīng)紫外光誘變和果膠底物誘導(dǎo)、保藏編號為CCTCC NO.M2011055的黑曲霉固態(tài)曲產(chǎn)果膠酶酶活為1650IU/g曲，經(jīng)紫外線誘變和果膠誘導(dǎo)的黑曲霉菌株制備的固態(tài)曲與未經(jīng)誘變的黑曲霉菌株制備的固態(tài)曲產(chǎn)果膠酶的能力具有顯著差異(P < 0.05)，表明本發(fā)明提供的經(jīng)紫外線誘變和果膠誘導(dǎo)的黑曲霉菌株制備的固態(tài)曲降解果膠的能力顯著提高。本發(fā)明還提供了包含保藏編號為 CCTCC NO.M2011055的黑曲霉制備的黑曲霉固態(tài)曲、嗜單寧管囊酵母固態(tài)曲、米曲霉固態(tài)曲的混合菌種固態(tài)曲發(fā)酵柑橘皮渣生產(chǎn)蛋白飼料的方法，該方法能夠?qū)暳现泄z含量由 17. 51%降低至0. 98 1.沈％，降低了果膠對飼料中營養(yǎng)成分的影響以及包裹水的作用， 將飼料中水分含量由77 82%降低至75%以下，加快產(chǎn)品干燥速率，減少干燥能耗；同時
7可以充分利用柑橘皮渣中的有益成分，提高發(fā)酵產(chǎn)品的蛋白含量，將粗蛋白含量由8. 15% 提高到23. 05 24. 30% ；真蛋白含量由7. 00%提高至19. 73 21. 59% ；可溶性蛋白含量由200. 18 μ g/g提高至309. 37 397. 97 μ g/g。既減少了柑橘皮渣對環(huán)境的污染，又提供了果膠含量較低、蛋白含量較高的飼料，能夠有效推進(jìn)柑橘皮渣綜合開發(fā)利用的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。生物保藏說明菌株黑曲霉315 分類命名黑曲霉315 (Aspergillus niger315)于2011年3月2 日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏中心地址為武漢省武昌市珞珈山武漢大學(xué)校內(nèi)，保藏編號為CCTCC NO.M2011055。


圖1示混合菌種固態(tài)曲的制備工藝。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明公開了保藏編號為CCTCC No. M2011055的黑曲霉，該黑曲霉制備的固態(tài)曲，包含該黑曲霉制備的固態(tài)曲的混合菌種固態(tài)曲及其制備方法，以及利用該黑曲霉固態(tài)曲、該混合菌種固態(tài)曲發(fā)酵柑橘皮渣生產(chǎn)蛋白飼料的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。菌株名稱為黑曲霉315 (Aspergillus niger315)，保藏編號為CCTCC NO.M2011055。由編號為CICC40014，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心的原始菌株黑曲霉 (Aspergillus niger)經(jīng)紫外光誘變和果膠誘導(dǎo)，獲得的一株新型黑曲霉菌株。本發(fā)明所述黑曲霉315(ASpergilluS niger315)菌株已于2011年3月2日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)進(jìn)行保藏，保藏中心地址為武漢省武昌市珞珈山武漢大學(xué)校內(nèi)，保藏編號為CCTCC NO.M2011055。本發(fā)明提供了一種由保藏編號為CCTCC NO.M2011055的黑曲霉制備的黑曲霉固態(tài)
曲ο本發(fā)明還提供了由保藏編號為CCTCC NO.M2011055的黑曲霉制備的黑曲霉固態(tài)曲在發(fā)酵柑橘皮渣生產(chǎn)蛋白飼料中的應(yīng)用。柑橘皮渣中含有大量木質(zhì)纖維原料和果膠。果膠是植物組織中與纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、蛋白質(zhì)等結(jié)合的不溶于水的一類物質(zhì)，果膠廣泛存在于高等植物如水果、蔬菜、 大豆以及玉米等植物中，主要由D-半乳糖醛酸以α-1，4-糖苷鍵連接形成直鏈狀聚合物， 是非淀粉多糖的成分之一。由于動物體內(nèi)缺乏降解果膠的酶類，因而果膠被認(rèn)為是動物飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子。再加上果膠的包裹水的作用，導(dǎo)致飼料干燥速率低，干燥世間長、耗能高，生產(chǎn)成本高。因此，常在飼料中添加果膠酶對果膠進(jìn)行分解。果膠酶分解果膠的一個多酶復(fù)合物，通常包括原果膠酶、果膠甲酯水解酶、果膠酸酶，通過它們的聯(lián)合作用使果膠質(zhì)得以完全分解。天然的果膠質(zhì)在原果膠酶作用下，轉(zhuǎn)化成水可溶性的果膠；果膠被果膠甲酯水解酶催化去掉甲酯基團(tuán)，生成果膠酸；果膠酸經(jīng)果膠酸水解酶類和果膠酸裂合酶類降解生成半乳糖醛酸。果膠酶可以由黑曲霉 (Aspergillus niger)經(jīng)發(fā)酵精制而得，對分解果膠具有良好的作用。作用pH值為2. 5 6.0，最適作用pH值為3. 5。黑曲霉，半知菌亞門，絲孢綱，絲孢目，叢梗孢科，曲霉屬真菌中的一個常見種，廣泛分布于世界各地的糧食、植物性產(chǎn)品和土壤中，是重要的發(fā)酵工業(yè)菌種，可生產(chǎn)淀粉酶、 酸性蛋白酶、纖維素酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶、檸檬酸、葡糖酸和沒食子酸等。本發(fā)明將黑曲霉進(jìn)行紫外光誘變和果膠底物誘導(dǎo)，目的是提高黑曲霉生產(chǎn)果膠酶的能力。試驗(yàn)證明， 未經(jīng)紫外光誘變和果膠底物誘導(dǎo)的黑曲霉的活菌數(shù)量為5.9X108f/g曲時，產(chǎn)果膠酶酶活為635. 902IU/g曲；本發(fā)明提供的經(jīng)紫外光誘變和果膠底物誘導(dǎo)、保藏編號為CCTCC No. M2011055的黑曲霉活菌數(shù)量為6. 2X IO8個/g曲時，產(chǎn)果膠酶酶活為787. 201IU/g曲。 經(jīng)紫外線誘變和果膠誘導(dǎo)、保藏編號為CCTCC NO.M2011055的黑曲霉菌株與未經(jīng)誘變的黑曲霉菌株產(chǎn)果膠酶的能力具有顯著差異(P < 0. 05)，表明本發(fā)明提供的經(jīng)紫外線誘變和果膠誘導(dǎo)的黑曲霉菌株降解果膠的能力顯著提高。未經(jīng)紫外光誘變和果膠底物誘導(dǎo)的黑曲霉固態(tài)曲產(chǎn)果膠酶酶活為1330IU/g曲，本發(fā)明提供的經(jīng)紫外光誘變和果膠底物誘導(dǎo)、保藏編號為CCTCC No. M2011055的黑曲霉固態(tài)曲產(chǎn)果膠酶酶活為1650IU/g曲，未經(jīng)誘變的黑曲霉菌株制備的固態(tài)曲和經(jīng)紫外線誘變和果膠誘導(dǎo)的黑曲霉菌株制備的固態(tài)曲產(chǎn)果膠酶的能力具有顯著差異(P < 0. 05)，表明本發(fā)明提供的經(jīng)紫外線誘變和果膠誘導(dǎo)的黑曲霉菌株制備的固態(tài)曲產(chǎn)果膠酶的能力顯著提高。本發(fā)明還提供了一種混合菌種固態(tài)曲，包含由保藏編號為CCTCC No. M2011055的黑曲霉制備的黑曲霉固態(tài)曲。柑橘皮渣中的木質(zhì)纖維原料可再生，資源豐富，將這類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為葡萄糖、木糖等可發(fā)酵性糖，極具應(yīng)用前景。木質(zhì)纖維原料主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素三大部分組成。纖維素是由葡萄糖通過β_1，4-糖苷鍵連接而成的線性長鏈高分子聚合物，呈微元纖束狀態(tài)，具有很強(qiáng)的結(jié)晶性。半纖維素是戊糖(木糖、阿拉伯糖)、己糖(甘露糖、葡萄糖、半乳糖)和糖醛酸所組成的不均一聚糖，為異質(zhì)多糖，排列松散，無晶體結(jié)構(gòu)。木質(zhì)素以苯丙烷為結(jié)構(gòu)單元，通過醚鍵-碳鍵彼此連接成具有三度空間結(jié)構(gòu)的高聚物。柑橘皮渣中，天然半纖維素水解產(chǎn)物的85 90%是木糖，如何充分利用半纖維素是提高生物利用率的關(guān)鍵。木糖是木制纖維原料水解產(chǎn)物中含量僅次于葡萄糖的一種單糖，含量可達(dá)植物纖維水解糖類的35%以上。在戊糖發(fā)酵的微生物中，酵母的戊糖發(fā)酵能力最強(qiáng)，酵母菌種可發(fā)酵木糖的菌株主要有假絲酵母、畢氏酵母和管囊酵母三個屬。嗜單寧管囊酵母O^chysolen tannophilus)是目前研究最多最有工業(yè)應(yīng)用前景的木糖發(fā)酵微生物之一，能夠分泌纖維素酶，提高木糖的生物利用率。因此，將含有嗜單寧管囊酵母固態(tài)曲的混合菌種固態(tài)曲用來發(fā)酵柑橘皮渣生產(chǎn)飼料，可以有效分解木質(zhì)纖維原料。纖維素酶是一種復(fù)合酶，主要由外切β-葡聚糖酶、內(nèi)切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等組成，還有很高活力的木聚糖酶活力。內(nèi)切葡聚糖酶隨機(jī)切割纖維素多糖鏈內(nèi)部的無定型區(qū)，產(chǎn)生不同長度的寡糖和新鏈的末端。外切葡聚糖酶作用于這些還原性和非還原性的纖維素多糖鏈的末端，釋放葡萄糖或纖維二糖。葡萄糖苷酶可以將纖維二糖、纖維三糖及其他低分子纖維糊精分解為葡萄糖。β-葡萄糖苷酶可以由米曲霉發(fā)酵制得。
米曲霉半知菌亞門，絲孢綱，絲孢目，從梗孢科，曲霉屬真菌中的一個常見種。米曲霉是一類產(chǎn)復(fù)合酶的菌株，除產(chǎn)蛋白酶外，還可產(chǎn)淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、植酸酶等。 在淀粉酶的作用下，將原料中的直鏈、支鏈淀粉降解為糊精及各種低分子糖類，如麥芽糖、 葡萄糖等；在蛋白酶的作用下，將不易消化的大分子蛋白質(zhì)降解為蛋白胨、多肽及各種氨基酸，而且可以使輔料中粗纖維、植酸等難吸收的物質(zhì)降解，提高營養(yǎng)價(jià)值、保健功效和消化率，廣泛應(yīng)用于食品、飼料、生產(chǎn)曲酸、釀酒等發(fā)酵工業(yè)。鑒于此，將含有米曲霉固態(tài)曲的混合菌種固態(tài)曲發(fā)酵柑橘皮渣生產(chǎn)飼料，能夠有效降解其中的木質(zhì)纖維原料和蛋白質(zhì)。作為優(yōu)選，上述混合菌種固態(tài)曲還包含嗜單寧管囊酵母固態(tài)曲和米曲霉固態(tài)曲。優(yōu)選地，本發(fā)明提供的混合菌種固態(tài)曲中，選用黑曲霉315(保藏編號為CCTCC No. M2011055)、嗜單寧管囊酵母(編號CICC1771，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心)和米曲霉(編號AS3. 951，西南大學(xué)贈送，可市售獲得)作為菌源。作為優(yōu)選，所述黑曲霉固態(tài)曲中黑曲霉活菌數(shù)量為7. 2 X IO8 7. 9 X IO8個/g曲； 所述嗜單寧管囊酵母固態(tài)曲中嗜單寧管囊酵母活菌數(shù)量為1.45X 108 1.52X 108個/g 曲；所述米曲霉固態(tài)曲中米曲霉活菌數(shù)量為1.75X 108 1.90X 108個/g曲。本發(fā)明還提供了上述混合菌種固態(tài)曲在發(fā)酵柑橘皮渣生產(chǎn)飼料中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種混合菌種固態(tài)曲發(fā)酵柑橘皮渣生產(chǎn)飼料的方法，混合菌種固態(tài)曲包含由保藏編號為CCTCC NO.M2011055的黑曲霉制備的黑曲霉固態(tài)曲。作為優(yōu)選，上述黑曲霉固態(tài)曲中黑曲霉活菌數(shù)量為7. 2X IO8 7. 9X IO8個/g曲。作為優(yōu)選，本發(fā)明提供的混合菌種固態(tài)曲發(fā)酵柑橘皮渣生產(chǎn)飼料的方法中，上述混合菌種固態(tài)曲還包含嗜單寧管囊酵母固態(tài)曲和米曲霉固態(tài)曲。作為優(yōu)選，上述混合菌種固態(tài)曲中，嗜單寧管囊酵母固態(tài)曲中活菌數(shù)量為 1.45X 108 1.52X 108個/g曲，優(yōu)選為1.52X 108個/g曲；米曲霉固態(tài)曲中活菌數(shù)量為 1.75X 108 1.90X 108 個/g 曲，優(yōu)選為 1.90X 108 個/g 曲。本發(fā)明提供的生產(chǎn)飼料的方法，為了保證混合菌種固態(tài)曲中保藏編號為CCTCC NO.M2011055的黑曲霉制備的黑曲霉、嗜單寧管囊酵母、米曲霉的活菌數(shù)量，上述混合菌種固態(tài)曲中，黑曲霉固態(tài)曲、嗜單寧管囊酵母固態(tài)曲和米曲霉固態(tài)曲的重量比可以為 1 0. 5 3 0. 5 3。具體地，本發(fā)明提供的混合菌種固態(tài)曲發(fā)酵柑橘皮渣生產(chǎn)飼料的方法，包括對柑橘皮渣進(jìn)行預(yù)處理、粉碎成柑橘皮渣顆粒；在上述柑橘皮渣顆粒中接入5 11%混合菌種固態(tài)曲，添加0 7%的谷殼、秸稈或麩皮作輔料，在培養(yǎng)溫度為32 38°C下，培養(yǎng)時間為 4 6d，制得蛋白飼料；混合菌種固態(tài)曲包含由保藏編號為CCTCC NO.M2011055的黑曲霉制備的黑曲霉固態(tài)曲，其中，保藏編號為CCTCC NO.M2011055的黑曲霉制備的黑曲霉固態(tài)曲中活菌數(shù)量為7. 2 X IO8 7. 9 X IO8個/g曲。優(yōu)選地，上述混合菌種固態(tài)曲中，黑曲霉活菌數(shù)量為7. 9X IO8個/g曲。作為優(yōu)選，本發(fā)明提供的混合菌種固態(tài)曲發(fā)酵柑橘皮渣生產(chǎn)飼料的方法中，上述混合菌種固態(tài)曲還包含嗜單寧管囊酵母固態(tài)曲和米曲霉固態(tài)曲。優(yōu)選地， 上述混合菌種固態(tài)曲中，嗜單寧管囊酵母固態(tài)曲中活菌數(shù)量為1. 45X IO8 1. 52X IO8個/ g曲，優(yōu)選為1.52X 108個/g曲；米曲霉固態(tài)曲中活菌數(shù)量為1.75X 108 1.90X 108個/ g曲，優(yōu)選為1.90X 108個/g曲。優(yōu)選地，上述混合菌種固態(tài)曲中，黑曲霉固態(tài)曲、嗜單寧管囊酵母固態(tài)曲和米曲霉固態(tài)曲的重量比可以為1 0.5 3 0.5 3。
試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明采用含有保藏編號為CCTCC NO.M2011055的黑曲霉、嗜單寧管囊酵母、米曲霉的混合菌種固態(tài)曲發(fā)酵柑橘皮渣生產(chǎn)蛋白飼料，能夠?qū)暳现泄z含量由17. 51%降低至0. 98 1.沈％，降低了果膠對飼料中營養(yǎng)成分的影響以及包裹水的作用，將飼料中水分含量由77 82%降低至75%以下，加快產(chǎn)品干燥速率，減少干燥能耗；同時可以充分利用柑橘皮渣中的有益成分，提高發(fā)酵產(chǎn)品的蛋白含量，將粗蛋白含量由 8. 15%提高到23. 05 24. 30% ；真蛋白含量由7. 00%提高至19. 73 21. 59% ；可溶性蛋白含量由200. 18 μ g/g提高至309. 37 397. 97 μ g/g。本發(fā)明提供的含有保藏編號為 CCTCC NO.M2011055的黑曲霉、嗜單寧管囊酵母、米曲霉的混合菌種固態(tài)曲發(fā)酵柑橘皮渣生產(chǎn)蛋白飼料的方法，既減少了柑橘皮S對環(huán)境的污染，又提供了果膠含量較低、蛋白含量較高的飼料，能夠有效推進(jìn)柑橘皮渣綜合開發(fā)利用的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明實(shí)施例1本發(fā)明提供的黑曲霉與未誘變的黑曲霉菌株產(chǎn)果膠酶能力的檢測分別在1號、2號500mL錐形瓶中填裝IOOg麩皮為培養(yǎng)基，按照重量份數(shù)計(jì)，麩皮含量為60 %，加水量為40 %。其中，1號錐形瓶中接種未誘變的黑曲霉菌株孢子懸浮液，2 號錐形瓶中接種本發(fā)明提供的經(jīng)紫外線誘變和果膠誘變、保藏編號為CCTCC NO.M2011055 的黑曲霉315菌株，培養(yǎng)溫度為，培養(yǎng)時間為4d，24h后開始翻曲。培養(yǎng)4d后，分別測定1號錐形瓶和2號錐形瓶培養(yǎng)基中活菌數(shù)量及果膠酶酶活。其中1號錐形瓶中，未經(jīng)紫外光誘變和果膠底物誘導(dǎo)的黑曲霉的活菌數(shù)量為5.9X108個/g曲時，產(chǎn)果膠酶酶活為 635. 902IU/g曲；2號錐形中，本發(fā)明提供的經(jīng)紫外光誘變和果膠底物誘導(dǎo)、保藏編號為 CCTCC No. M2011055的黑曲霉活菌數(shù)量為6. 2X IO8個/g曲時，產(chǎn)果膠酶酶活為787. 201IU/ g曲。經(jīng)紫外線誘變和果膠誘導(dǎo)、保藏編號為CCTCC No. M2011055的黑曲霉菌株與未經(jīng)誘變的黑曲霉菌株產(chǎn)果膠酶的能力具有顯著差異(P < 0. 05)，表明本發(fā)明提供的經(jīng)紫外線誘變和果膠誘導(dǎo)的黑曲霉菌株降解果膠的能力顯著提高。實(shí)施例2本發(fā)明提供的黑曲霉制備固態(tài)曲斜面菌種培養(yǎng)挑取一環(huán)本發(fā)明提供的經(jīng)紫外線誘變和果膠誘變、保藏編號為 CCTCC No. M2011055的黑曲霉，直線法分別接種于培養(yǎng)用PDA斜面培養(yǎng)基(培養(yǎng)用PDA斜面培養(yǎng)基以PDA培養(yǎng)液為基礎(chǔ)，加入葡萄糖2. 0% )；置培養(yǎng)箱中于下培養(yǎng)3d，使黑曲霉長滿斜面。配制菌懸液用無菌水將斜面上的霉菌孢子洗下制成黑曲霉菌懸液。制備固態(tài)曲將菌種濃度為1.0X IO7個/mL的黑曲霉菌懸液按0. lmL/g接種于黑曲霉制曲用的麩皮培養(yǎng)基中；黑曲霉制曲用的麩皮培養(yǎng)基以麩皮為基礎(chǔ)，加水量30 %，制曲溫度為觀認(rèn)制曲時間為4d，制得的黑曲霉菌種固態(tài)曲中，活菌數(shù)量為7. 9X IO8個/g曲， 果膠酶酶活為1650IU/g曲。實(shí)施例3本發(fā)明提供的黑曲霉制備固態(tài)曲斜面菌種培養(yǎng)挑取一環(huán)本發(fā)明提供的經(jīng)紫外線誘變和果膠誘變、保藏編號為 CCTCC No. M2011055的黑曲霉，直線法分別接種于培養(yǎng)用PDA斜面培養(yǎng)基(培養(yǎng)用PDA斜面培養(yǎng)基以PDA培養(yǎng)液為基礎(chǔ)，加入葡萄糖2. 0% )；置培養(yǎng)箱中于下培養(yǎng)3d，使黑曲霉長滿斜面。配制菌懸液用無菌水將斜面上的霉菌孢子洗下制成黑曲霉菌懸液。
制備固態(tài)曲將菌種濃度為1.0X IO7個/mL的黑曲霉菌懸液按0. lmL/g接種于黑曲霉制曲用的麩皮培養(yǎng)基中；黑曲霉制曲用的麩皮培養(yǎng)基以麩皮為基礎(chǔ)，加水量30 %，制曲溫度為^TC,制曲時間為4d，制得的黑曲霉菌種固態(tài)曲中，活菌數(shù)量為7. 2X IO8個/g曲， 果膠酶酶活為1600IU/g曲。實(shí)施例4本發(fā)明提供的黑曲霉制備固態(tài)曲斜面菌種培養(yǎng)挑取一環(huán)本發(fā)明提供的經(jīng)紫外線誘變和果膠誘變、保藏編號為 CCTCC No. M2011055的黑曲霉，直線法分別接種于培養(yǎng)用PDA斜面培養(yǎng)基(培養(yǎng)用PDA斜面培養(yǎng)基以PDA培養(yǎng)液為基礎(chǔ)，加入葡萄糖2. 0% )；置培養(yǎng)箱中于下培養(yǎng)3d，使黑曲霉長滿斜面。配制菌懸液用無菌水將斜面上的霉菌孢子洗下制成黑曲霉菌懸液。制備固態(tài)曲將菌種濃度為1.0X IO7個/mL的黑曲霉菌懸液按0. lmL/g接種于黑曲霉制曲用的麩皮培養(yǎng)基中；黑曲霉制曲用的麩皮培養(yǎng)基以麩皮為基礎(chǔ)，加水量30 %，制曲溫度為30°C，制曲時間為4d，制得的黑曲霉菌種固態(tài)曲中，活菌數(shù)量為7. 6X IO8個/g曲， 果膠酶酶活為1550IU/g曲。實(shí)施例5本發(fā)明提供的黑曲霉制備的固態(tài)曲與未誘變的黑曲霉菌株制備的固態(tài)曲產(chǎn)果膠酶能力的檢測分別在1號、2號500mL錐形瓶中填裝IOOg麩皮為培養(yǎng)基，按照重量份數(shù)計(jì)，麩皮含量為60 %，加水量為40 %。其中，1號錐形瓶中接種未誘變的黑曲霉菌株孢子懸浮液，2 號錐形瓶中接種本發(fā)明提供的經(jīng)紫外線誘變和果膠誘變、保藏編號為CCTCC NO.M2011055 的黑曲霉315菌株，培養(yǎng)溫度為，培養(yǎng)時間為4d，24h后開始翻曲。培養(yǎng)4d后，分別分析1號錐形瓶和2號錐形瓶培養(yǎng)基中果膠酶酶活，其中1號錐形瓶培養(yǎng)基中果膠酶酶活為 1330IU/g曲，2號錐形瓶培養(yǎng)基中果膠酶酶活為1650IU/g曲，未經(jīng)誘變的黑曲霉菌株制備的固態(tài)曲和經(jīng)紫外線誘變和果膠誘變、保藏編號為CCTCC NO.M2011055的黑曲霉菌株制備的固態(tài)曲產(chǎn)果膠酶的能力具有顯著差異(P < 0. 05)，表明本發(fā)明提供的經(jīng)紫外線誘變和果膠誘變的黑曲霉菌株制備的固態(tài)曲產(chǎn)果膠酶的能力顯著提高，在相同發(fā)酵條件下，保藏編號為CCTCC No. M2011055的黑曲霉315菌株制備的固態(tài)曲降解果膠的能力顯著高于普通黑曲霉菌株制備的固態(tài)曲。實(shí)施例6本發(fā)明提供的黑曲霉與普通黑曲霉菌株制備固態(tài)曲發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料如實(shí)施例2，由保藏編號為CCTCC NO.M2011055的黑曲霉制備黑曲霉固態(tài)曲。未誘變黑曲霉固態(tài)曲的制備斜面菌種培養(yǎng)挑取一環(huán)未誘變的普通黑曲霉，直線法分別接種于培養(yǎng)用PDA斜面培養(yǎng)基(培養(yǎng)用PDA斜面培養(yǎng)基以PDA培養(yǎng)液為基礎(chǔ)，加入葡萄糖2.0%)；置培養(yǎng)箱中于下培養(yǎng)3d，使黑曲霉長滿斜面。配制菌懸液用無菌水將斜面上的霉菌孢子洗下制成黑曲霉菌懸液。制備固態(tài)曲將菌種濃度為1.0X IO7個/mL的黑曲霉菌懸液按0. lmL/g接種于黑曲霉制曲用的麩皮培養(yǎng)基中；黑曲霉制曲用的麩皮培養(yǎng)基以麩皮為基礎(chǔ)，加水量30 %，制曲溫度為觀認(rèn)制曲時間為4d，制得的黑曲霉菌種固態(tài)曲中，活菌數(shù)量為7. 8X IO8個/g曲， 果膠酶酶活為1330IU/g曲。對柑橘皮渣進(jìn)行預(yù)處理，將新鮮的柑橘皮渣粉碎成直徑約為5mm大小的柑橘皮渣顆粒。測定初始皮渣成分，粗蛋白含量8. 15%，真蛋白含量7.00%，可溶性蛋白含量 200. 18 μ g/g，果膠含量17. 51%，含水量75% 80% ；分別接入實(shí)施例2中制備的本發(fā)明提供的黑曲霉固態(tài)曲和本實(shí)施例制備的未經(jīng)誘變的黑曲霉固態(tài)曲，接種量為9%，在培養(yǎng)溫度為20°C下，不添加任何輔料，固態(tài)發(fā)酵3d，將發(fā)酵后的柑橘皮渣飼料樣品進(jìn)行干燥，分析其蛋白質(zhì)含量及果膠含量見表1。表1黑曲霉菌株制備固態(tài)曲發(fā)酵生產(chǎn)飼料
組別粗蛋白含量 (%)真蛋白含量 (% )可溶性蛋白含量 (^g)果膠含量 (% )誘變的黑曲霉固態(tài)曲 ！ 11.67 ！ 9.01305.594*1.66#未經(jīng)誘變的黑曲霉固態(tài)曲10.277.69262.0146.57* 表示 P < 0. 05，# 表示 P < 0. 01。表1結(jié)果表明，本發(fā)明提供的經(jīng)紫外線誘變和果膠誘變、保藏編號為CCTCC No. M2011055的黑曲霉制備固態(tài)曲發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料，粗蛋白含量為11.67%，與未經(jīng)誘變的普通黑曲霉固態(tài)曲相比，具有顯著差異(P<0.(^)；本發(fā)明提供的經(jīng)紫外線誘變和果膠誘變的黑曲霉制備固態(tài)曲發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料，真蛋白含量為9. 01%，與普通黑曲霉固態(tài)曲相比，具有顯著差異(P<0.(^)；本發(fā)明提供的經(jīng)紫外線誘變和果膠誘變的黑曲霉制備固態(tài)曲發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料，可溶性蛋白含量為305. 594 μ g/g，與未經(jīng)誘變的普通黑曲霉固態(tài)曲相比，具有顯著差異(P<0.(^)；本發(fā)明提供的經(jīng)紫外線誘變和果膠誘變的黑曲霉制備固態(tài)曲發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料，果膠含量為1.66%，與未經(jīng)誘變的普通黑曲霉固態(tài)曲相比，具有極顯著差異(P < 0. 01)。綜合上述試驗(yàn)結(jié)果，本發(fā)明提供的經(jīng)紫外線誘變和果膠誘變、保藏編號為CCTCC NO.M2011055的黑曲霉制備固態(tài)曲發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料，極顯著降低了飼料中果膠的含量，并且顯著提高了粗蛋白、真蛋白、可溶性蛋白的含量。實(shí)施例7制備嗜單寧管囊酵母固態(tài)曲斜面菌種培養(yǎng)挑取一環(huán)嗜單寧管囊酵母，直線法分別接種于培養(yǎng)用PDA斜面培養(yǎng)基(培養(yǎng)用PDA斜面培養(yǎng)基以PDA培養(yǎng)液為基礎(chǔ)，加入葡萄糖2.0%)；置培養(yǎng)箱中于
下培養(yǎng)3d，使嗜單寧管囊酵母長滿斜面。配制菌懸液用無菌水將斜面上的酵母菌洗下制成嗜單寧管囊酵母菌懸液。制備固態(tài)曲將菌種濃度為1.0X IO7個/mL的菌懸液按0. lmL/g接種于嗜單寧管囊酵母制曲用的麩皮培養(yǎng)基中；嗜單寧管囊酵母制曲用的麩皮培養(yǎng)基以麩皮為基礎(chǔ)，添加
尿素作輔料，加水量40%，制曲溫度為30°C，制曲時間為5d，制得的嗜單寧管囊酵母固態(tài)曲中，活菌數(shù)量為1. 52X IO8個/g曲，纖維素酶酶活為1100IU/g曲。實(shí)施例8本發(fā)明提供的米曲霉制備固態(tài)曲斜面菌種培養(yǎng)挑取一環(huán)米曲霉，直線法分別接種于培養(yǎng)用PDA斜面培養(yǎng)基(培養(yǎng)用PDA斜面培養(yǎng)基以PDA培養(yǎng)液為基礎(chǔ)，加入葡萄糖2.0% )；置培養(yǎng)箱中于下培養(yǎng) 3d，使米曲霉長滿斜面。配制菌懸液用無菌水將斜面上的霉菌孢子洗下制成米曲霉菌懸液。
制備固態(tài)曲將菌種濃度為1.0X IO7個/mL的菌懸液按0. lmL/g接種于米曲霉制曲用的麩皮培養(yǎng)基中；米曲霉制曲用的麩皮培養(yǎng)基以麩皮為基礎(chǔ)，加水量40 %，制曲溫度為32°C，制曲時間為5d，制得的米曲霉菌種固態(tài)曲中，活菌數(shù)量為1.90X 108個/g曲，β-葡萄糖苷酶酶活為1300IU/g曲。實(shí)施例9制備混合菌種固態(tài)曲選用本發(fā)明提供的經(jīng)紫外線誘變和果膠誘變、保藏編號為CCTCC No. M2011055的
黑曲霉、嗜單寧管囊酵母、米曲霉作為菌源。斜面菌種培養(yǎng)分別挑取一環(huán)本發(fā)明提供的經(jīng)紫外線誘變和果膠誘變、保藏編號為CCTCC NO.M2011055的黑曲霉、嗜單寧管囊酵母和米曲霉，直線法分別接種于培養(yǎng)用PDA 斜面培養(yǎng)基(培養(yǎng)用PDA斜面培養(yǎng)基以PDA培養(yǎng)液為基礎(chǔ)，加入葡萄糖2. 0% )；置培養(yǎng)箱中于下培養(yǎng)3d，使所述黑曲霉、嗜單寧管囊酵母和米曲霉長滿斜面。配制菌懸液用無菌水將斜面上的霉菌孢子或酵母菌洗下制成黑曲霉菌懸液、嗜單寧管囊酵母菌懸液和米曲霉菌懸液。制備單菌種固態(tài)曲按照實(shí)施例2制備本發(fā)明提供的黑曲霉固態(tài)曲，制得的黑曲霉菌種固態(tài)曲中，活菌數(shù)量為7.9X108f/g曲，果膠酶酶活為1650IU/g曲；按照實(shí)施例7 制備嗜單寧管囊酵母固態(tài)曲，制得的嗜單寧管囊酵母菌種固態(tài)曲中，活菌數(shù)量為1.52X108 個/g曲，纖維素酶酶活為1100IU/g曲；按照實(shí)施例8制備米曲霉固態(tài)曲，制得的米曲霉菌種固態(tài)曲中，活菌數(shù)量為1.90X 108個/g曲，β-葡萄糖苷酶酶活為1300IU/g曲。制備混合菌種固態(tài)曲按照黑曲霉固態(tài)曲、嗜單寧管囊酵母固態(tài)曲、米曲霉固態(tài)曲的重量比為1 1 1混合，制得混合菌種固態(tài)曲。實(shí)施例10制備混合菌種固態(tài)曲選用本發(fā)明提供的經(jīng)紫外線誘變和果膠誘變、保藏編號為CCTCC No. M2011055的
黑曲霉、嗜單寧管囊酵母、米曲霉作為菌源。斜面菌種培養(yǎng)分別挑取一環(huán)本發(fā)明提供的經(jīng)紫外線誘變和果膠誘變、保藏編號為CCTCC NO.M2011055的黑曲霉、嗜單寧管囊酵母和米曲霉，直線法分別接種于培養(yǎng)用PDA 斜面培養(yǎng)基(培養(yǎng)用PDA斜面培養(yǎng)基以PDA培養(yǎng)液為基礎(chǔ)，加入葡萄糖2. 0% )；置培養(yǎng)箱中于下培養(yǎng)3d，使所述黑曲霉、嗜單寧管囊酵母和米曲霉長滿斜面。配制菌懸液用無菌水將斜面上的霉菌孢子或酵母菌洗下制成黑曲霉菌懸液、嗜單寧管囊酵母菌懸液和米曲霉菌懸液。制備單菌種固態(tài)曲按照實(shí)施例2制備本發(fā)明提供的黑曲霉固態(tài)曲，制得的黑曲霉菌種固態(tài)曲中，活菌數(shù)量為7.9X108f/g曲，果膠酶酶活為1650IU/g曲；按照實(shí)施例7 制備嗜單寧管囊酵母固態(tài)曲，制得的嗜單寧管囊酵母菌種固態(tài)曲中，活菌數(shù)量為1.52X108 個/g曲，纖維素酶酶活為1100IU/g曲；按照實(shí)施例8制備米曲霉固態(tài)曲，制得的米曲霉菌種固態(tài)曲中，活菌數(shù)量為1.90X 108個/g曲，β-葡萄糖苷酶酶活為1300IU/g曲。制備混合菌種固態(tài)曲按照黑曲霉固態(tài)曲、嗜單寧管囊酵母固態(tài)曲、米曲霉固態(tài)曲的重量比為1 2 1混合，制得混合菌種固態(tài)曲。實(shí)施例11制備混合菌種固態(tài)曲選用本發(fā)明提供的經(jīng)紫外線誘變和果膠誘變、保藏編號為CCTCC No. M2011055的
黑曲霉、嗜單寧管囊酵母、米曲霉作為菌源。
斜面菌種培養(yǎng)分別挑取一環(huán)本發(fā)明提供的經(jīng)紫外線誘變和果膠誘變、保藏編號為CCTCC NO.M2011055的黑曲霉、嗜單寧管囊酵母和米曲霉，直線法分別接種于培養(yǎng)用PDA 斜面培養(yǎng)基(培養(yǎng)用PDA斜面培養(yǎng)基以PDA培養(yǎng)液為基礎(chǔ)，加入葡萄糖2. 0% )；置培養(yǎng)箱中于下培養(yǎng)3d，使所述黑曲霉、嗜單寧管囊酵母和米曲霉長滿斜面。配制菌懸液用無菌水將斜面上的霉菌孢子或酵母菌洗下制成黑曲霉菌懸液、嗜單寧管囊酵母菌懸液和米曲霉菌懸液。制備單菌種固態(tài)曲按照實(shí)施例2制備本發(fā)明提供的黑曲霉固態(tài)曲，制得的黑曲霉菌種固態(tài)曲中，活菌數(shù)量為7.9X108個/g曲，果膠酶酶活為1650IU/g曲；按照實(shí)施例7制備嗜單寧管囊酵母固態(tài)曲，制得的嗜單寧管囊酵母菌種固態(tài)曲中，活菌數(shù)量為 1.52X 108個/g曲，纖維素酶酶活為1100IU/g曲；按照實(shí)施例8制備米曲霉固態(tài)曲，制得的米曲霉菌種固態(tài)曲中，活菌數(shù)量為1. 90X IO8個/g曲，β -葡萄糖苷酶酶活為1300IU/g 曲ο制備混合菌種固態(tài)曲分別按照黑曲霉固態(tài)曲、嗜單寧管囊酵母固態(tài)曲、米曲霉固態(tài)曲的重量比為1 0.5 0.5混合，制得混合菌種固態(tài)曲。實(shí)施例12制備混合菌種固態(tài)曲選用本發(fā)明提供的經(jīng)紫外線誘變和果膠誘變、保藏編號為CCTCC No. M2011055的
黑曲霉、嗜單寧管囊酵母、米曲霉作為菌源。斜面菌種培養(yǎng)分別挑取一環(huán)本發(fā)明提供的經(jīng)紫外線誘變和果膠誘變、保藏編號為CCTCC NO.M2011055的黑曲霉、嗜單寧管囊酵母和米曲霉，直線法分別接種于培養(yǎng)用PDA 斜面培養(yǎng)基(培養(yǎng)用PDA斜面培養(yǎng)基以PDA培養(yǎng)液為基礎(chǔ)，加入葡萄糖2. 0% )；置培養(yǎng)箱中于下培養(yǎng)3d，使所述黑曲霉、嗜單寧管囊酵母和米曲霉長滿斜面。配制菌懸液用無菌水將斜面上的霉菌孢子或酵母菌洗下制成黑曲霉菌懸液、嗜單寧管囊酵母菌懸液和米曲霉菌懸液。制備單菌種固態(tài)曲按照實(shí)施例2制備本發(fā)明提供的黑曲霉固態(tài)曲，制得的黑曲霉菌種固態(tài)曲中，活菌數(shù)量為7.9X108f/g曲，果膠酶酶活為1650IU/g曲；按照實(shí)施例7 制備嗜單寧管囊酵母固態(tài)曲，制得的嗜單寧管囊酵母菌種固態(tài)曲中，活菌數(shù)量為1.52X108 個/g曲，纖維素酶酶活為1100IU/g曲；按照實(shí)施例8制備米曲霉固態(tài)曲，制得的米曲霉菌種固態(tài)曲中，活菌數(shù)量為1.90X 108個/g曲，β-葡萄糖苷酶酶活為1300IU/g曲。制備混合菌種固態(tài)曲按照黑曲霉固態(tài)曲、嗜單寧管囊酵母固態(tài)曲、米曲霉固態(tài)曲的重量比為1 1 2混合，制得混合菌種固態(tài)曲。實(shí)施例13制備混合菌種固態(tài)曲選用本發(fā)明提供的經(jīng)紫外線誘變和果膠誘變、保藏編號為CCTCC No. M2011055的
黑曲霉、嗜單寧管囊酵母、米曲霉作為菌源。斜面菌種培養(yǎng)分別挑取一環(huán)本發(fā)明提供的經(jīng)紫外線誘變和果膠誘變、保藏編號為CCTCC NO.M2011055的黑曲霉、嗜單寧管囊酵母和米曲霉，直線法分別接種于培養(yǎng)用PDA 斜面培養(yǎng)基(培養(yǎng)用PDA斜面培養(yǎng)基以PDA培養(yǎng)液為基礎(chǔ)，加入葡萄糖2.0%)；置培養(yǎng)箱中于下培養(yǎng)3d，使所述黑曲霉、嗜單寧管囊酵母和米曲霉長滿斜面。配制菌懸液用無菌水將斜面上的霉菌孢子或酵母菌洗下制成黑曲霉菌懸液、嗜單寧管囊酵母菌懸液和米曲霉菌懸液。
制備單菌種固態(tài)曲按照實(shí)施例2制備本發(fā)明提供的黑曲霉固態(tài)曲，制得的黑曲霉菌種固態(tài)曲中，活菌數(shù)量為7.9X108f/g曲，果膠酶酶活為1650IU/g曲；按照實(shí)施例7 制備嗜單寧管囊酵母固態(tài)曲，制得的嗜單寧管囊酵母菌種固態(tài)曲中，活菌數(shù)量為1.52X108 個/g曲，纖維素酶酶活為1100IU/g曲；按照實(shí)施例8制備米曲霉固態(tài)曲，制得的米曲霉菌種固態(tài)曲中，活菌數(shù)量為1.90X 108個/g曲，β-葡萄糖苷酶酶活為1300IU/g曲。制備混合菌種固態(tài)曲分別按照黑曲霉固態(tài)曲、嗜單寧管囊酵母固態(tài)曲、米曲霉固態(tài)曲的重量比為1 1.5 0.5混合，制得混合菌種固態(tài)曲。實(shí)施例14制備混合菌種固態(tài)曲選用本發(fā)明提供的經(jīng)紫外線誘變和果膠誘變、保藏編號為CCTCC No. M2011055的
黑曲霉、嗜單寧管囊酵母、米曲霉作為菌源。斜面菌種培養(yǎng)分別挑取一環(huán)本發(fā)明提供的經(jīng)紫外線誘變和果膠誘變、保藏編號為CCTCC NO.M2011055的黑曲霉、嗜單寧管囊酵母和米曲霉，直線法分別接種于培養(yǎng)用PDA 斜面培養(yǎng)基(培養(yǎng)用PDA斜面培養(yǎng)基以PDA培養(yǎng)液為基礎(chǔ)，加入葡萄糖2. 0% )；置培養(yǎng)箱中于下培養(yǎng)3d，使所述黑曲霉、嗜單寧管囊酵母和米曲霉長滿斜面。配制菌懸液用無菌水將斜面上的霉菌孢子或酵母菌洗下制成黑曲霉菌懸液、嗜單寧管囊酵母菌懸液和米曲霉菌懸液。制備單菌種固態(tài)曲按照實(shí)施例2制備本發(fā)明提供的黑曲霉固態(tài)曲，制得的黑曲霉菌種固態(tài)曲中，活菌數(shù)量為7.9X108f/g曲，果膠酶酶活為1650IU/g曲；按照實(shí)施例7 制備嗜單寧管囊酵母固態(tài)曲，制得的嗜單寧管囊酵母菌種固態(tài)曲中，活菌數(shù)量為1.52X108 個/g曲，纖維素酶酶活為1100IU/g曲；按照實(shí)施例8制備米曲霉固態(tài)曲，制得的米曲霉菌種固態(tài)曲中，活菌數(shù)量為1.90X 108個/g曲，β-葡萄糖苷酶酶活為1300IU/g曲。制備混合菌種固態(tài)曲按照黑曲霉固態(tài)曲、嗜單寧管囊酵母固態(tài)曲、米曲霉固態(tài)曲的重量比為1 3 3混合，制得混合菌種固態(tài)曲。實(shí)施例15本發(fā)明提供的混合菌種固態(tài)曲與單菌種固態(tài)曲發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料按照實(shí)施例2制備本發(fā)明提供的黑曲霉固態(tài)曲，制得的黑曲霉菌種固態(tài)曲中，活菌數(shù)量為7. 9 X IO8個/g曲，果膠酶酶活為1650IU/g曲。按照實(shí)施例7制備嗜單寧管囊酵母固態(tài)曲，制得的嗜單寧管囊酵母菌種固態(tài)曲中，活菌數(shù)量為1. 52 X IO8個/g曲，纖維素酶酶活為1100IU/g曲。按照實(shí)施例8制備米曲霉固態(tài)曲，制得的米曲霉菌種固態(tài)曲中，活菌數(shù)量為 1. 90X IO8個/g曲，β -葡萄糖苷酶酶活為1300IU/g曲。按照實(shí)施例9制備混合菌種固態(tài)曲，其中，黑曲霉活菌數(shù)量為7. 9 X IO8個/g曲，果膠酶酶活為1650IU/g曲；嗜單寧管囊酵母活菌數(shù)量為1. 52 X IO8個/g曲，纖維素酶酶活為 1100IU/g曲；米曲霉活菌數(shù)量為1.90X 108 f/g曲，β-葡萄糖苷酶酶活為1300IU/g曲。分別用上述黑曲霉固態(tài)曲、嗜單寧管囊酵母固態(tài)曲、米曲霉固態(tài)曲、混合菌種固態(tài)曲發(fā)酵柑橘皮渣，接種量均為9%，在培養(yǎng)溫度為20°C下，不添加任何輔料，分別固態(tài)發(fā)酵 3d，將發(fā)酵后的柑橘皮渣飼料樣品進(jìn)行干燥；對干燥后的柑橘皮渣樣品進(jìn)行分析，其蛋白質(zhì)含量及果膠含量見表2。表2混合菌種固態(tài)曲與單菌種固態(tài)曲發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料
權(quán)利要求
1.一種黑曲霉，其保藏編號為CCTCC NO.M2011055。
2.一種由保藏編號為CCTCC NO.M2011055的黑曲霉制備的黑曲霉固態(tài)曲。
3.一種混合菌種固態(tài)曲，其特征在于，包含由保藏編號為CCTCCNO.M2011055的黑曲霉制備的黑曲霉固態(tài)曲。
4.如權(quán)利要求3所述的混合菌種固態(tài)曲，其特征在于，所述黑曲霉固態(tài)曲中黑曲霉活菌數(shù)量為7. 2 X IO8 7. 9 X IO8個/g曲。
5.如權(quán)利要求3或4所述的混合菌種固態(tài)曲，其特征在于，還包含嗜單寧管囊酵母固態(tài)曲和米曲霉固態(tài)曲。
6.如權(quán)利要求5所述的混合菌種固態(tài)曲，其特征在于，所述嗜單寧管囊酵母固態(tài)曲中嗜單寧管囊酵母活菌數(shù)量為1.45X 108 1.52X 108個/g曲；所述米曲霉固態(tài)曲中米曲霉活菌數(shù)量為1. 75 X IO8 1. 90 X IO8個/g曲。
7.一種混合菌種固態(tài)曲發(fā)酵柑橘皮渣生產(chǎn)飼料的方法，其特征在于，所述混合菌種固態(tài)曲包含由保藏編號為CCTCC NO.M2011055的黑曲霉制備的黑曲霉固態(tài)曲。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述黑曲霉固態(tài)曲中黑曲霉活菌數(shù)量為 7. 2 X IO8 7. 9 X IO8 個/g 曲。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述混合菌種固態(tài)曲還包含嗜單寧管囊酵母固態(tài)曲和米曲霉固態(tài)曲。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述嗜單寧管囊酵母固態(tài)曲中嗜單寧管囊酵母活菌數(shù)量為1.45X 108 1.52X 108個/g曲；所述米曲霉固態(tài)曲中米曲霉活菌數(shù)量為 1. 75X IO8 1. 90X IO8 個 /g 曲。
全文摘要
本發(fā)明涉及飼料加工領(lǐng)域，公開了一種保藏編號為CCTCC No.M2011055的黑曲霉及其固態(tài)曲，以及包含該黑曲霉固態(tài)曲、嗜單寧管囊酵母固態(tài)曲和米曲霉固態(tài)曲的混合菌種固態(tài)曲，以及該黑曲霉固態(tài)曲、該混合菌種固態(tài)曲在發(fā)酵柑橘皮渣生產(chǎn)蛋白飼料中的應(yīng)用。利用混合菌種固態(tài)曲發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料，能夠?qū)⒐z含量由17.51％降低至0.98～1.26％，減少了果膠對飼料中營養(yǎng)成分的影響，減弱了果膠包裹水的作用，將飼料中水分含量由77～82％降低至75％以下，從而加快產(chǎn)品干燥速率，降低干燥能耗，同時提高了飼料中蛋白質(zhì)含量，利于實(shí)現(xiàn)柑橘皮渣綜合開發(fā)利用的產(chǎn)業(yè)化。
文檔編號C12N1/14GK102212482SQ20111010303
公開日2011年10月12日 申請日期2011年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月22日
發(fā)明者彭榮, 殷鐘意, 鄭旭煦, 聞學(xué)政 申請人:重慶工商大學(xué)