專利名稱：一種家蠶腸道益生菌的分離鑒定及其酶基因的克隆與表達的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種家蠶腸道益生菌的分離鑒定及其酶基因的克隆與表達方法，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
動物腸道是多種微生物生長繁殖的理想場所。正常腸道微生物對宿主具有營養(yǎng)、 免疫、生長刺激、生物拮抗等作用，是機體的生理組成部分。蠶是有著巨大經(jīng)濟效益和社會效益的重要經(jīng)濟昆蟲。但是蠶業(yè)生產(chǎn)過程中一直存在著葉絲轉(zhuǎn)化率低(10%左右)，桑葉成本占蠶繭生產(chǎn)成本的50%以上。同時，蠶病發(fā)生率高，我國每年因蠶病損失的繭量達10% 以上。因此，通過多種渠道提高蠶對桑葉的利用率，提高葉絲轉(zhuǎn)化率，減少蠶病的發(fā)生，是蠶業(yè)生產(chǎn)上長期面臨的重要課題。微生態(tài)制劑的應(yīng)用與發(fā)展為解決這些問題提供了良好的途徑。在動物疾病的防治中，抗生素應(yīng)用弊端日益顯現(xiàn)，微生態(tài)制劑具有促動物生長、防治疾病，無副作用等特點，也因此成為抗生素理想的替代品之一。家蠶作為一種重要的經(jīng)濟動物與鱗翅目昆蟲研究模型，具有生長快、周期短的特點。在幼蟲期20多天時，家蠶除了本身具有消化食物的能力之外，腸道中種類繁多、數(shù)量巨大的微生物群體也對其食物的消化和營養(yǎng)的吸收起重要作用。同時，由于長期馴化的結(jié)果， 家蠶防病能力極其脆弱；腸道內(nèi)有益菌群的存在，能夠有效地幫助家蠶抵制內(nèi)源性細菌病害的侵襲。因此，腸道里的微生物對家蠶具有重要意義，將產(chǎn)酶益生菌添加到家蠶人工飼料中或涂抹于桑葉表面喂食家蠶，將有利于蠶充分消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)，提高飼料效率。家蠶的中腸是消化桑葉的主要場所，聚集著大量各種各樣的微生物，這些微生物在家蠶飼料消化、疾病發(fā)生等方面起著重要作用，因而它們是作為家蠶微生態(tài)制劑的很好材料。腸道益生菌可通過其所分泌的酶起到益生作用。研究蠶腸道菌及其產(chǎn)酶并對產(chǎn)酶基因進行原核表達分析，在改善蠶腸微生態(tài)環(huán)境及蠶人工飼料開發(fā)上有一定意義。目前國內(nèi)關(guān)于家蠶腸道益生菌的研究主要集中于其抗病與助消化方面，尚處于起始階段。易發(fā)平等對不同蠶期、不同齡期間腸道好氧微生物種群構(gòu)成及其變化進行了系統(tǒng)的研究(西南農(nóng)業(yè)大學學報，2001,23 ) :117-119)，但沒有對益生菌群進行研究。高繪菊等對家蠶腸道產(chǎn)蛋白酶菌株進行了分離與篩選(家蠶腸道產(chǎn)酶菌的分離與篩選，蠶業(yè)科學，2007，33 (2) 228 233.)，從家蠶腸道中分離得到30株菌株，研究了它們的胞外淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶和脂肪酶的產(chǎn)酶能力，家蠶腸道中的各種產(chǎn)酶菌高達60%，表明了腸道菌在家蠶食物消化過程中的重要性，但未對產(chǎn)酶微生物作出鑒定。孫雪奇等從家蠶腸道內(nèi)篩選出多株好氧及兼性厭氧微生物(家蠶腸道好氧和部分兼性厭氧微生物及蠶用微生態(tài)制劑的研究[J].四川蠶業(yè)，1996,24(1) :13-15.)，選用其中5個屬的5株菌，加上另一種菌配成4種混合菌液，在家蠶4齡最后一天進行添食試驗，其結(jié)果是發(fā)病率明顯降低，全繭量和繭層量也有較大提高。其它關(guān)于家蠶基因和人類互作效應(yīng)方面的研究較多。目前尚未見關(guān)于家蠶腸道產(chǎn)酶益生菌的定向選育與作用機理研究的報道。目前關(guān)于α-淀粉酶的研究，主要集中在分子改良及工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用方面。包括對該酶基因的啟動子功能、編碼區(qū)序列的克隆及在不同表達體系中進行原核及真核表達等， 以及對其基因突變、基因表達調(diào)控、將基因轉(zhuǎn)入植物中的表達研究和基因功能的機理研究， 如耐熱性的作用機制，極端環(huán)境下其酶學性質(zhì)等，對含該基因的重組質(zhì)粒在傳代過程中的保持率等問題也引起了較多關(guān)注。工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用方面也有較多的研究報導。目前，暫未見腸源性蠟樣芽孢桿菌及其所產(chǎn)酶類在蠶業(yè)微生態(tài)制劑方面的應(yīng)用，且關(guān)于腸源性α-淀粉酶產(chǎn)生菌的研究報導也不多。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種家蠶腸道益生菌的分離鑒定及其酶基因的克隆與表達方法，對家蠶腸道中蠟樣芽孢桿菌進行分離鑒定及酶基因的克隆與表達，對改善家蠶腸道環(huán)境，提高桑葉、飼料淀粉消化率及葉絲轉(zhuǎn)化率有著重要的意義。本發(fā)明的目的在于提供一種家蠶腸道益生菌酶，它是腸道微生物源α-淀粉酶， 具有SEQID NO 3所述的氨基酸序列。本發(fā)明的目的還在于提供一種家蠶腸道益生菌酶的基因，具有SEQ NO ID 1或SEQ NO ID 2所述堿基序列。提供一種含上述基因的表達載體及由表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。本發(fā)明的另一目的在于提供一種家蠶腸道益生菌酶菌株的分離方法，包括以下步驟1)隨機取家蠶大造品種五齡幼蟲，饑餓24h后待用；2)將步驟1)中的蠶體浸入體積濃度75%乙醇中體表消毒后，移入無菌水中漂洗2 次，無菌操作取出腸道，搗碎后分別移入NA液體培養(yǎng)基中，進行富集培養(yǎng)；培養(yǎng)條件150r/ minJ8°C，4a!，培養(yǎng)2次。將第2次富集液按10倍稀釋法稀釋后分別取0. 2mL涂布于NA 固體培養(yǎng)基上上，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；3)將經(jīng)步驟2、培養(yǎng)出的菌落用劃線法分離成單個菌落，將所得的菌種進行平板接種，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h ；4)用接種針取純化后的菌種點接在預先準備好的NA淀粉篩選培養(yǎng)基平板上， 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，加碘液染色觀察，有水解現(xiàn)象，并且在對照NA培養(yǎng)基上未水解的菌
株，即為篩選所得產(chǎn)淀粉酶菌株。與已有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果具體體現(xiàn)在本發(fā)明通過對家蠶腸道中蠟樣芽孢桿菌進行分離鑒定及克隆與表達基因來獲得淀粉酶酶基因，對改善家蠶腸道環(huán)境，提高桑葉、飼料淀粉消化率及葉絲轉(zhuǎn)化率有著重要的
眉、ο本發(fā)明過程中篩選出的家蠶腸道產(chǎn)酶菌，屬于飼料級微生物添加劑范圍，具有較好的應(yīng)用前景。


圖1是本發(fā)明產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選結(jié)果。圖加是本發(fā)明DZ-a號菌顯微鏡觀察結(jié)果。
圖2b是本發(fā)明DZ-h號菌顯微鏡觀察結(jié)果。圖3是本發(fā)明基因擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測的結(jié)果。圖 3 中 M 為 MarkerD, 1，2，3，4，5，6 分別代表引物 Primer3004_4081 擴增 DZ_a 片段、Primer3004-4081 擴增 DZ_h 片段、Primer512_1751 擴增 DZ_a 片段、Primer512_1751 擴增 DZ-h 片段、Primer666-2041 擴增 DZ_a 片段、Primer666-2041 擴增 DZ_h 片段。圖4是本發(fā)明基因膠回收，瓊脂糖凝膠電泳檢測的結(jié)果。圖 4 中 M 為 MarkerD, 1，2，3，4，5，6 分別代表引物 Primer3004_4081 擴增 DZ_a 片段、Primer3004-4081 擴增 DZ_h 片段、Primer512_1751 擴增 DZ_a 片段、Primer512_1751 擴增 DZ-h 片段、Primer666-2041 擴增 DZ_a 片段、Primer666-2041 擴增 DZ_h 片段。圖 5 是 pET28a_DZamy 表達產(chǎn)物 SDS-PAGE 分析。圖5中1 =Transetta(DE3)菌體蛋白；2 未經(jīng)IPTG誘導的蛋白樣品；3-8 :IPTG誘導濃度分別是0. 2mM,0. 4mM,0. 6mM,0. 8mM, 1. OmM和1. 2mM時的重組蛋白的表達；M 蛋白分
子量標準。以下結(jié)合附圖通過具體實施方式
對本發(fā)明做進一步說明
具體實施例方式1.材料的選擇及培養(yǎng)基的制備11.家蠶腸道樣品家蠶Bombyx mori大造品種由安徽農(nóng)業(yè)大學蠶學教研室提供， 由人工飼料喂養(yǎng)至五齡蠶作為供試材料。1. 2試驗用培養(yǎng)基NA培養(yǎng)基蛋白胨10. 0g、牛肉膏5. 0g、NaC15. 0g、瓊脂18. 0g、 水lL，pH為7. 2 7. 4。NA淀粉篩選培養(yǎng)基NA培養(yǎng)基添加1. 0%的可溶性淀粉。LB培養(yǎng)基胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl IOgdK 1L，pH 7. 0，固體培養(yǎng)基添加1. 5%的瓊脂粉，高壓滅菌后備用。液體培養(yǎng)基不加瓊脂。1. 3主要試劑及質(zhì)粒K1201型UNIQ-10柱式細菌基因組DNA提取試劑盒，DNA分子量標記，PCR擴增試劑等購自上海生工生物工程有限公司；dNTPs、感受態(tài)細胞TranS5a、 pEASYTl、Transetta等購自TransGen公司；質(zhì)粒抽提試劑盒和凝膠回收試劑盒AP-GX-50， 購自Axygen公司；PET-28 (a+) Vector購自Novagen公司；BamHI和XhoI限制性內(nèi)切酶，!"4 連接酶，PMD19-T Simple Vector等購自Takara公司，重組質(zhì)粒pEI^8a_DZamy為本研究中構(gòu)建。其它試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。2.蠟樣芽孢桿菌的分離鑒定及其酶基因的克隆與表達過程2. 1家蠶腸道菌產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選2. 1. 1隨機取家蠶大造品種五齡幼蟲10條，饑餓24h后待用.2. 1. 2家蠶腸道菌的培養(yǎng)將蠶體浸入體積濃度75%乙醇中體表消毒后，移入無菌水中漂洗2次，無菌操作取出腸道，搗碎后分別移入NA液體培養(yǎng)基中，進行富集培養(yǎng)。培養(yǎng)條件150r/minJ8°C， 48h，培養(yǎng)2次。將第2次富集液按10倍稀釋法稀釋后分別取0. 2mL涂布于NA固體培養(yǎng)基上，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2. 1. 3家蠶腸道菌的分離純化將培養(yǎng)出的菌落用劃線法分離成單個菌落，直至經(jīng)顯微鏡觀察為單一菌體，保存
2. 1. 4家蠶腸道菌的形態(tài)觀察將分離純化的菌種進行平板接種，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。2. 1. 5產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選用接種針取純化后的菌種點接在預先準備好的NA淀粉篩選培養(yǎng)基平板上，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 加碘液染色觀察，對于有水解現(xiàn)象并且在其對照NA平板上未見水解
的菌株，即為篩選所得的產(chǎn)酶分離菌。篩選結(jié)果如下產(chǎn)淀粉酶菌在NA淀粉培養(yǎng)基上出現(xiàn)產(chǎn)酶透明圈，如圖1所示。從中挑選形態(tài)較典型的兩株菌，編號為DZ-a號、DZ-h號，NA液體培養(yǎng)基富集培養(yǎng)后，DNS法測定酶活，見表1。 酶活定義在pH7. 0，40°C條件下，每分鐘降解可溶性淀粉釋放1微摩爾還原糖所需要的酶量為1個酶活力單位，以U · mL-1表示。表1酶活測定結(jié)果產(chǎn)淀粉酶菌株大造-a號大造-h號
權(quán)利要求
1.一種家蠶腸道益生菌酶，其特征在于，具有SEQ ID NO 3所述的氨基酸序列。
2.編碼權(quán)利要求1所述家蠶腸道益生菌酶的基因，其特征在于，具有SEQNO ID 1或 SEQ NO ID 2所述堿基序列。
3.含權(quán)利要求2所述基因的表達載體。
4.由權(quán)利要求4所述表達載體轉(zhuǎn)化的的宿主細胞。
5.一種家蠶腸道益生菌酶的分離方法，其特征在于，包括以下步驟，1)隨機取家蠶大造品種五齡幼蟲，饑餓24h后待用；2)將步驟1)中的蠶體浸入體積濃度75%乙醇中體表消毒后，移入無菌水中漂洗2 次，無菌操作取出腸道，搗碎后移入NA液體培養(yǎng)基中，進行富集培養(yǎng)；培養(yǎng)條件150r/min， 28°C，48h，培養(yǎng)2次，將第2次富集液按10倍稀釋法稀釋后分別取0. 2mL涂布于NA固體培養(yǎng)基上，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；3)將經(jīng)步驟幻培養(yǎng)出的菌落用劃線法分離成單個菌落，將所得的菌種進行平板接種， 于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h;4)用接種針取純化后的菌種點接在預先準備好的NA淀粉篩選培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，加碘液染色觀察，有水解現(xiàn)象，并且在對照NA培養(yǎng)基上未水解的菌株，即為篩選所得產(chǎn)淀粉酶菌株。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種家蠶腸道益生菌酶的分離方法，其特征在于，所述NA培養(yǎng)基按如下配比每升水中含有蛋白胨10. 0g、牛肉膏5. 0g、NaC15. 0g、瓊脂18. 0g, pH為 7. 2 7. 4 ；所述NA淀粉篩選培養(yǎng)基是以NA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)添加質(zhì)量分數(shù)1. 0%的可溶性淀粉；所述LB培養(yǎng)基按如下配比胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl IOgdK 1L，pH 7. 0。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種家蠶腸道益生菌的分離鑒定及其酶基因的克隆與表達方法，對家蠶腸道中蠟樣芽孢桿菌進行分離鑒定及酶基因的克隆與表達，對改善家蠶腸道環(huán)境，提高桑葉、飼料淀粉消化率及葉絲轉(zhuǎn)化率有著重要的意義。本發(fā)明過程中篩選出的家蠶腸道產(chǎn)酶菌，屬于飼料級微生物添加劑范圍，具有較好的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/56GK102242092SQ20111010440
公開日2011年11月16日 申請日期2011年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月25日
發(fā)明者劉朝良, 楊文靜, 王在貴, 韓薇 申請人:安徽農(nóng)業(yè)大學