專利名稱：一種熱穩(wěn)定性改良的木聚糖酶xyn-CDBFV-m及其基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種熱穩(wěn)定性改良的木聚糖酶xyn-⑶BFV-m及其基因、包含該基因的重組載體和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
木聚糖是一種五碳糖，是植物細胞中重要的結(jié)構(gòu)多聚糖，在植物細胞壁中的含量僅次于纖維素，約占細胞干重的35 %。木聚糖是半纖維素的重要組分，它是自然界中含量僅次于纖維素的第二豐富的多聚糖，幾乎占地球可更新有機碳含量的三分之一。木聚糖也廣泛存在于飼料原料中，如玉米、麥麩、米糠、秸桿、豆柏等。富含于飼料中的非淀粉多糖(Non-starch Polysaccharides, NSPs)是重要的抗營養(yǎng)因子,其中含量較高的木聚糖的抗營養(yǎng)作用主要表現(xiàn)為木聚糖本身難以被單胃動物消化，同時結(jié)合大量的水，使采食動物消·化道中食糜的體積增大、粘度增加、養(yǎng)分與消化道內(nèi)源酶的作用降低，從而阻礙營養(yǎng)物質(zhì)，尤其是脂肪和蛋白質(zhì)的消化吸收，降低飼料的利用率。木聚糖酶是可將木聚糖降解成低聚糖或木糖的一類酶的總稱，一般指內(nèi)切￠-1,4木聚糖酶。木聚糖酶可以有效地從木聚糖的主鏈內(nèi)部作用于木糖苷鍵，將高分子量的木聚糖，降解為低分子量的低聚糖。研究結(jié)果表明，飼料中如果添加木聚糖酶，就可顯著降低阿拉伯木聚糖分子大小，將其分解成較小聚合度的低聚木糖，從而改善飼料性能，消除或降低因粘度增加而引起的抗營養(yǎng)作用總而言之木聚糖酶可以破壞植物細胞壁結(jié)構(gòu)，提高各種類型飼料的利用率；降解可溶性多糖，降低其粘性；減少畜禽腸道疾??；增進畜禽健康，提高成活率；減少粘糞，降低空氣中氨氣和硫化物濃度；減少糞便排出和臟蛋；使畜禽體重均勻；減少環(huán)境污染。因此，木聚糖酶在飼料資源開發(fā)和提高廉價副產(chǎn)品的利用率方面，具有廣闊的應(yīng)用前景。和其他的酶制劑不同，用于飼料上的酶制劑，需要經(jīng)歷一個高溫制粒的過程，因為在飼料制粒時的高溫處理，可以將飼料轉(zhuǎn)化率提高10%，料肉比提高；避免畜禽挑食，達到均衡營養(yǎng)；增大密度，倉儲運輸費用降低；流動性好，飼養(yǎng)方便；減少喂養(yǎng)過程、畜禽食料過程及自然環(huán)境造成的飼料損失；有效殺滅飼料中的沙門氏菌達到綠色飼料要求等優(yōu)點。因此飼料用酶需要較好的熱穩(wěn)定性，能夠抵御在制粒過程中的高溫處理。雖然目前發(fā)現(xiàn)的木聚糖酶比較多，但能夠直接應(yīng)用于飼料的天然木聚糖酶卻很少，在飼料行業(yè)的木聚糖酶需要具備一些特殊的性質(zhì)，如好的熱穩(wěn)定性。大多數(shù)木聚糖酶在飼料制粒的過程中都會大幅度失活，因此耐高溫的酶有更好的應(yīng)用前景。來源于瘤胃真菌Neocallimastixpatriciarum的木聚糖酶催化結(jié)構(gòu)域xyn_CDBFV是一種性質(zhì)優(yōu)良的木聚糖酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示，基因序列如SEQ ID NO. 4所示)，其表達量及pH活性特征都比較適合在單位動物體內(nèi)發(fā)揮水解木聚糖的作用。但該酶不能抵御在制粒過程中的高溫，在高溫制粒的過程中有大量的酶失活，因此提高該木聚糖酶的熱穩(wěn)定性，使其能夠有效地在飼料工業(yè)上應(yīng)用。目前通過蛋白質(zhì)工程的手段在酶分子改造方面已經(jīng)有很多成功的例子，特別是在提高酶的熱穩(wěn)定性。定點突變即理性設(shè)計是在已知酶的結(jié)構(gòu)與功能的基礎(chǔ)上有目的、有針對性地改變酶的某一活性基團或模塊，最終獲得特定氨基酸殘基的具有性質(zhì)得到預期改變的蛋白質(zhì)，該技術(shù)已被廣泛用于酶分子的改造。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過對來源于瘤胃真菌Neocallimastix patriciarum的木聚糖酶的改造，使改造后的木聚糖酶xyn-CDBFV-m在高溫時穩(wěn)定性提高，能夠抵御飼料高溫制粒時由于溫度過高造成酶蛋白的變性，使其能夠更好的在飼料中內(nèi)發(fā)揮水解木聚糖的作用。本發(fā)明的目的是提供一種優(yōu)化改良的木聚糖酶xyn-⑶BFV-m及其基因。本發(fā)明的再一目的是提供包含上述的木聚糖酶基因的重組載體。
本發(fā)明的再一目的是提供包含上述的木聚糖酶基因的重組菌株。本發(fā)明的再一目的是提供上述木聚糖酶xyn-⑶BFV-m的應(yīng)用。本發(fā)明的木聚糖酶Xyn-⑶BFV-m和原有木聚糖酶xyn_⑶BFV相比，有16個氨基酸發(fā)生了突變或刪除，突變位點分別是 A33C，Y58C，N88P, P122T，D124T，W125S，V126L，D176E，以及第90，91和92位點刪除，和第128到132位點刪除。突變后的氨基酸序列如SEQ IDNO. I所示 QSFCSSASHSGQSVKVTGNKVGTIGGVGYELWCDSGNNSATFYSDGSFSCTFQNAGDCLCRSGLSFDSTKTPSQIGRMKADFKLVKQPSGYSYVGVYGWTRSPLVEYYIVDNWLSPFPTGTSLGSFTIDGAQYTVYENTRTGPSID⑶TTFNQYFSIRQQARDCGTIEISAHFDQWEKLGMTMGKLHEAKVLGEAGNVNGGASGTADFPYAKVYI⑶本發(fā)明還提供了上述改良的耐高溫木聚糖酶xyn-⑶BFV-m的基因序列，其堿基序列如SEQ ID NO. 2所示CAATCCTTCTGTTCCAGCGCTTCTCACTCTGGACAATCCGTCAAGGTCACCGGCAACAAGGTTGGAACTATCGGTGGTGTTGGTTACGAGCTGTGGTGTGATAGTGGTAATAACTCCGCTACCTTCTACTCTGACGGATCCTTCTCGTGCACTTTCCAGAACGCTGGCGACTGTTTGTGTAGATCCGGTTTGTCTTTCGACTCCACTAAGACCCCATCTCAAATCGGTCGTATGAAGGCTGACTTCAAACTTGTCAAACAACCTTCCGGTTACTCCTACGTTGGTGTTTACGGTTGGACTAGATCCCCTTTGGTCGAGTACTACATTGTCGACAACTGGCTTTCTCCATTCCCAACTGGTACTTCTCTTGGATCTTTCACTATCGACGGTGCCCAATACACTGTCTACGAGAACACTAGAACTGGTCCATCTATTGACGGTGACACCACCTTCAATCAGTACTTTTCCATTAGACAACAAGCTAGAGACTGTGGTACCATTGAAATCTCTGCTCACTTTGACCAATGGGAGAAGTTGGGAATGACCATGGGTAAGTTGCATGAAGCCAAGGTTTTGGGTGAAGCCGGTAACGTCAACGGTGGTGCCTCTGGTACCGCTGATTTCCCTTACGCAAAGGTTTACATCGGTGACTAA本發(fā)明還提供了包含上述優(yōu)化改良的木聚糖酶xyn-⑶BFV-m的重組載體，將本發(fā)明的優(yōu)化改良的木聚糖酶xyn-CDBFV-m插入到表達載體合適的限制性酶切位點之間，使其核苷酸序列可操作的與表達調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個最優(yōu)選的實施方案，優(yōu)選為將本發(fā)明的木聚糖酶xyn-⑶BFV-m插入到質(zhì)粒pPIC9上的EcoRI和Not I限制性酶切位點之間，使該核苷酸序列位于AOXl啟動子的下游并受其調(diào)控，得到重組酵母表達質(zhì)粒pPIC9-xyn-CDBFV-m。本發(fā)明還提供了包含上述木聚糖酶xyn-⑶BFV-m的重組菌株，所述重組菌株為畢赤酵母細胞、啤酒酵母細胞或多型遜酵母細胞，優(yōu)選重組菌株是畢赤酵母菌株GS115。
本發(fā)明還提供了上述木聚糖酶xyn-⑶BFV-m在飼料添加劑中的應(yīng)用，主要涉及所述木聚糖酶在制備飼料添加劑中的用途，以及相應(yīng)的飼料添加劑，所述飼料添加劑的有效成分可以是所述木聚糖酶多肽、表達木聚糖酶多肽的宿主細胞。本發(fā)明優(yōu)選采用理性設(shè)計的方法，其一、在木聚糖酶的N端引入二硫鍵，即33位的丙氨酸和58位的苯丙氨酸分別替換為半胱氨酸；其二、消除了兩個B-factor因子比較高的區(qū)域，即分別將88位到93位的NSSNVG突變?yōu)镻SG ；121位到131位的PPGDWVGNKKH突變?yōu)镻TGTSL ;其三、在分子表面增加鹽鍵，將xyn-⑶BFV中的第176位的天冬氨酸突變?yōu)楣劝彼岷?，可以明顯的與第77位的精氨酸形成鹽鍵，該鹽鍵可以穩(wěn)定相鄰的兩個beta折疊片。本發(fā)明通過理性設(shè)計,在木聚糖酶的催化結(jié)構(gòu)域xyn-⑶BFV的N端引入二硫鍵,消除B-Factor值高的區(qū)域，以及在分子表面增加鹽鍵的手段，對木聚糖酶xyn_CDBFV進行改良，最終得到了一個熱穩(wěn)定性提高的木聚糖酶xyn-⑶BFV-m。與木聚糖酶xyn-⑶BFV相比，突變后的酶的熱穩(wěn)定性得到了明顯的提高，在80°C高溫處理30分鐘仍然能夠保留80%左右的酶活性。木聚糖酶xyn-CDBFV-m具有比較好的性質(zhì)，可以彌補目前飼料行業(yè)使用的木 聚糖酶，在飼料高溫制粒時酶活性損失過多的缺陷，同時xyn-CDBFV-m能在畢赤酵母中得到高水平的表達，因此該木聚糖酶xyn-CDBFV-m可以更適合用于飼料行業(yè)。本發(fā)明利用基因工程手段對來源于瘤胃真菌Neocallimastix patriciarum木聚糖酶xyn-CDBFV的進行改良，以解決該木聚糖酶在飼料高溫制粒時酶活性損失過多的缺陷，經(jīng)過優(yōu)化改良的木聚糖酶xyn-CDBFV-m在80°C條件下的熱穩(wěn)定性得到了很大的提高，進一步滿足了飼料用酶的要求，因此，本發(fā)明的優(yōu)化改良的木聚糖酶xyn-CDBFV-m可在飼料工業(yè)中顯示出巨大的應(yīng)用潛力。


圖I 木聚糖酶 xyn-CDBFV 和 xyn-CDBFV-m 的最適 pH。圖2木聚糖酶xyn-Q)BFV和xyn_0)BFV-m的pH穩(wěn)定性。圖3木聚糖酶xyn-Q)BFV和xyn_0)BFV-m的最適溫度。圖4木聚糖酶xyn_Q)BFV和xyn-Q)BFV-m的熱穩(wěn)定性。
具體實施例方式實驗條件I、菌株與載體大腸桿菌菌株ToplO、Escherichia coli BL21 (DE3)、表達載體 pET_22b (+)(購自Novagen公司)。畢赤酵母63115、載體卩 109(購自Invitrogen公司)。2、酶類及其他生化試劑Fast pfu購自全式金公司，內(nèi)切酶購自TaKaRa公司，連接酶購自Invitrogen公司。X-Gal、IPTG、植酸鈉等底物購自Sigma公司，其它都為國產(chǎn)試劑。3、培養(yǎng)基大腸桿菌培養(yǎng)基為LB(1%蛋白胨，0. 5%酵母提取物，l%NaCl，pH7. O)。酵母培養(yǎng)基為YPD (I %酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖)。酵母篩選培養(yǎng)基為MD (葡萄糖20g/L，瓊脂粉 20g/L,生物素 4 X 10 VL, YNB 13. 4g/L)。
酵母誘導培養(yǎng)基BMGY(1 %酵母提取物、2%蛋白胨、I. 34% YNB,0. 00004 %Biotin、l%甘油(V/V))和BMMY(除以I %甲醇代替甘油，其余成份相與BMGY相同)。本發(fā)明中所用到重組遺傳學技術(shù)均為本領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)。在以下實施例中未作詳細介紹的技術(shù)，均按照以下實驗手冊或文獻中的相關(guān)章節(jié)或部分來進行，包括=Samtoook等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual (第 3 版 2001) ；Kriegler,Gene Tranferand Expression A Laboratory Manual (1990);和 James M. Cregg, Pichia Protocols (第一版，1998)。實施例I、與木聚糖酶xyn-⑶BFV熱穩(wěn)定相關(guān)突變的理性設(shè)計(I)同源建模將來自于瘤胃真菌Neocallimastix patriciarum的木聚糖酶催化結(jié)構(gòu)域xyn-CDBFV，同源建模是以Bacillus subtillis B230木聚糖酶的晶體結(jié)構(gòu)(PDB:1IG0)為 模板，通過SWISS-MODEL服務(wù)器中的Mo de I模塊進行同源比較建模方式來完成，并將其命名為xyn-NP. pdb,利用Deepview/Swiss-PdbViewer軟件進行三維立體模型瀏覽分析。(2) 二硫鍵設(shè)計及選擇本發(fā)明利用二硫鍵設(shè)計軟件Disulfideby Design (version I. 20)對xyn-NP. pdb進行二硫鍵的預測分析。經(jīng)分析在xyn-NP. pdb的三維結(jié)構(gòu)中存在24個可以形成二硫鍵的潛在位點。它們分別是33位和58位；43位和47位；46位和62位；51位和209位；61位和198位；61位和200位；70位和74位；83位和214位；88位和93位；88位和95位；90位和206位；92位和118位；93位和117位；93位和206位；94位和204位；98位和113位;102位和195位；115位和169位；130位和142位；134位和183位；141位和164位；144位和163位；176位和179位；184位和189位。但進一步通過二硫鍵的形成部位及預測的能量分析，基本確定N端的33位和58位形成的二硫鍵更有利于提高木聚糖酶xyn-CDBFV的熱穩(wěn)定性。因此分別將33位的丙氨酸和58位的苯丙氨酸分別替換為半胱氨酸，以用于該位點形成二硫鍵。(3) B-factor 分析現(xiàn)在有許多理論和研究用來研究影響蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的因素，例如熱穩(wěn)定的蛋白質(zhì)的結(jié)果比中溫蛋白質(zhì)包裝的緊密。蛋白質(zhì)的B-factor主要用來反應(yīng)蛋白質(zhì)中特定氨基酸的穩(wěn)定性的一個指標，如果某個氨基的B-Factor的值比較大，則表示該氨基酸或該區(qū)段結(jié)構(gòu)不夠穩(wěn)定，在自然條件下可能變化比較大。利用Deepview/Swiss-PdbViewer軟件,我們發(fā)現(xiàn)在木聚糖酶xyn-Q)BFV中存在兩個B-factor值非常高的區(qū)域，這兩個區(qū)域分別為88位到93位的氨基酸；以及121位到131位的氨基酸。該兩個區(qū)域在木聚糖酶xyn-CDBFV中都比較松散，與周圍的氨基酸結(jié)合不夠緊密。蛋白質(zhì)這種表面突起的無規(guī)則轉(zhuǎn)曲不利于蛋白自身的穩(wěn)定，通過其他熱穩(wěn)定較好的木聚糖酶比較分析，將這兩個區(qū)域進行了改良。分別將88位到93位的NSSNVG突變?yōu)镻SG ；121 位到 131 位的 PPGDWVGNKKH 突變?yōu)?PTGTSL。(4)鹽鍵分析蛋白的酸性或堿性氨基酸側(cè)鏈在生理環(huán)境中是帶正電或負電的，隨著蛋白的卷曲折疊，當正負基團相互接近時，則通過靜電吸引而形成鹽鍵，通常鹽鍵也被成為鹽橋。鹽橋可以使蛋白質(zhì)保持緊密和牢固的構(gòu)像，并且使其熱穩(wěn)定性提高。鹽橋結(jié)構(gòu)對木聚糖酶的熱穩(wěn)定性有一定的作用。本發(fā)明通過分析將xyn-CDBFV中的第176位的天冬氨酸突變?yōu)楣劝彼岷?，可以明顯的與第77位的精氨酸形成鹽鍵，該鹽鍵可以穩(wěn)定相鄰的兩個beta折疊片。將以上理性設(shè)計的突變位點都匯總到一個新的木聚糖酶基因上，并將其命名為xyn-Q)BFV-m。實施例2、木聚糖酶催化結(jié)構(gòu)域基因xyn-CDBFV及Xyn-CDBFV_m的合成將來自于瘤胃真菌Neocallimastix patriciarum的木聚糖酶催化結(jié)構(gòu)域基因xyn-⑶BFV及xyn-⑶BFV_m，按照畢赤酵母密碼子的偏愛性(趙翔，2000)，在不改變其氨基
酸序列的前提下進行序列改造。改造中避免GT......AG這一形式的位點，盡量避免富含
AT (如ATTTA、AATAA, AATTAA等)序列的出現(xiàn)，該些序列與mRNA的穩(wěn)定性有關(guān)。將改造設(shè)計好的基因序列送南京金瑞斯公司進行全基因合成。 實施例3、重組表達載體 pET-22b (+) -xyn-CDBFV 及 pET_22b (+) -xyn-CDBFV-m 的構(gòu)
建根據(jù)合成基因的序列設(shè)計PCR引物5’端含有Nco I內(nèi)切酶位點，3’端含EcoR I內(nèi)切酶位點，引物序列如下5’ 端引物 pET-xvn-F GCACCCATGGGACAATCCTTCTGTTCCAGCGC 3 端引物 pET-xyn-R GCACGAATTCTTAGTCACCGATGTAAACCTTTG ；以合成基因為模板，用上述引物進行PCR擴增，將擴增得到的片段克隆到載體pET-22b (+)上，得到重組載體pET-22b(+)-xyn-CDBFV。pET-22b (+) -Xyn-OTBFVn的構(gòu)建和以上載體一樣，其引物分別為5 ’端引物pET-xyn-m-F GCACCCATGGGACAATCCTTCTGTTCCAGCG ;3，端引物 pET-xyn-m-R GCACGAATTCTTAGTCACCGATGTAAACCTT。實施例4木聚糖酶xyn-⑶BFV及xyn_⑶BFV_m在大腸桿菌中的表達實施例3中所述兩種表達載體pET_22b (+)-xyn-Q)BFV和pET-22b (+) -xyn-CDBFV-m轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coli BL21 (DE3)，分別獲得重組菌株pET-22b (+) -xyn-CDBFV (DE3)，和 pET_22b (+) -xyn-CDBFV-m (DE3)。取含有重組質(zhì)粒的BL21 (DE3)菌株和含有pET_22b (+)空質(zhì)粒的BL21 (DE3)菌株(作為對照)，分別接種于3mLLB (含100 ii g/mLAmp)培養(yǎng)液中，37°C快速振蕩培養(yǎng)過夜。分別取IOOii L過夜培養(yǎng)液加入含Amp的IOmL LB培養(yǎng)液(1%接種量)中，快速振蕩培養(yǎng)約2 3h (OD600達到0. 6 0. 8)，后加入終濃度0. 6 0. 8mmol/L的誘導劑IPTG，37°C繼續(xù)振蕩培養(yǎng)約4h，或30°C振蕩培養(yǎng)約6h，12，OOOrpm離心5min，分別收集培養(yǎng)基上清和沉淀，細胞沉淀用PH6. 0的檸檬酸-Na2HPO4緩沖液重懸，超聲波破碎后12，OOOrpm離心lOmin。分別檢測培養(yǎng)基上清和細胞破碎液中木聚糖酶的活性。木聚糖酶的酶活力測定采用DNS法。具體方法如下向試管中加入900 ii L 1%燕麥木聚糖底物，置于60°C水浴預先保溫5min，加入100 u L適當稀釋的酶液，于60°C水浴準確保溫lOmin，加入I. 5mL DNS終止反應(yīng)，沸水煮5min。冷卻到室溫后540nm測定OD值。經(jīng)過計算木聚糖酶xyn-CDBFV和xyn-CDBFV-m在大腸桿菌中誘導表達，表達上清液的木聚糖酶活性分別為18. 9和22. 3U/mL。同時各種提取液取出20 ii L加入5X電泳上樣緩沖液，沸水煮5min，與同樣處置的含有空質(zhì)粒pET-22b(+)-lic的菌體BL21進行SDS-PAGE電泳檢測。酶活測定結(jié)果及SDS-PAGE結(jié)果都表明，兩個木聚糖酶基因在大腸桿菌中得到了明顯的活性表達。
實施例5、木聚糖酶xyn-Q)BFV和xyn_0)BFV-m的純化木聚糖酶xyn-CDBFV純化的具體過程是，將pET_22b (+) -xyn-CDBFV (DE3)搖瓶表達的上清液用中空纖維進行濃縮。然后在每IOOmL的濃縮液中緩慢加入36. Ig的硫酸銨(相當于60%的硫酸銨飽和度)，并不斷攪拌3h。然后12，OOOrpm離心IOmin,收集沉淀。沉淀用少量PH 8.0的20mM Tris-HCl緩沖液溶解，并在大量該緩沖液中透析過夜。透析后的溶液過陰離子柱(HiTrap Q Sepharose XL 5mL)進行純化。陰離子柱事先用pH 8. 0的20mM Tris-HCl緩沖液平衡，上樣后用0 I. OmoI/L線性梯度的NaCl溶液洗脫，收集有木聚糖酶活性的洗脫管。收集液再用PEG8000處理，使其濃縮，濃縮液過分子篩(Superdex 7510/300 GL column)進一步純化。分子篩事先用磷酸鹽緩沖液(50mmol/L, pH 7.0)平衡，上樣后以同樣緩沖液0. 5mL/min的速度洗脫。收集有木聚糖酶活性的洗脫管，經(jīng)SDS-PAGE確認后用于酶學性質(zhì)的分析。木聚糖酶xyn-⑶BFV-m的純化方法和木聚糖酶xyn-⑶BFV基本一樣。
實施例6、對木聚糖酶xyn_Q)BFV和xyn-Q)BFV-m的部分性質(zhì)分析(I)木聚糖酶xyn-⑶BFV和xyn-⑶BFV-m的最適pH和pH穩(wěn)定性經(jīng)純化的木聚糖酶xyn-CDBFV和xyn-CDBFV-m，在60°C下，不同的pH下進行酶促反應(yīng)以測定其最適pH。所用緩沖液為pH3. 0 8. 0的檸檬酸-Na2HPO4緩沖液，pH8. 0 9. 0的0. lmol/L的Tris-HCl緩沖液，以及PH9. 0 10. 0的Gly-NaOH緩沖液。其結(jié)果如圖I所示，這兩個木聚糖酶xyn-⑶BFV和xyn-CDBFV-m的最適pH曲線稍有改變，xyn-CDBFV-m最適pH比xyn-CDBFV有所降低，由原先的6. 0，降低到了 5. 5。同時xyn-CDBFV-m在酸性條件下的相對酶活性有一定的提高。將純化好的木聚糖酶xyn_Q)BFV和xyn-Q)BFV-m,稀釋到一定濃度，在pH 3-10的緩沖液中，37°C放置lh。然后再在60°C，pH 6.0的條件下測定酶活，通過計算相對酶活來分析木聚糖酶在不同PH條件下的穩(wěn)定性，結(jié)果如圖2所示。從圖2可見，這兩個木聚糖酶xyn-⑶BFV和xyn-⑶BFV_m的pH穩(wěn)定性曲線基本沒有改變，只是在堿性條件下xyn-0)BFV-m更穩(wěn)定點。(2)木聚糖酶xyn-CDBFV和xyn-CDBFV-m的最適溫度和熱穩(wěn)定性將純化好的木聚糖酶xyn-CDBFV和xyn-CDBFV-m稀釋到所需濃度，取50 y L分別在40、50、55、60、65、70、80、90°C溫度下測定酶活，計算相對酶活，以確定該酶的最適溫度。其結(jié)果如圖3所示，xyn-⑶BFV-m的最適溫度有了明顯的提高，從60°C提高到了 70°C，并且在80°C時的相對酶活仍然能夠維持在50%以上。由此可見，通過理性設(shè)計xyn-⑶BFV-m最適溫度得到了明顯的提高。將純化好的木聚糖酶xyn-CDBFV和xyn-CDBFV-m稀稀釋到所需濃度，取2mL在80°C保溫。接著分別在2、4、6、8、10、15、20min取出100 y L酶液稀釋到所示濃度。在60。。，pH 6. 0的條件下測定酶活，以未處理的原酶液作為100%的對照。其測定結(jié)果如圖4所示，xyn-⑶BFV-m在80°C的熱穩(wěn)定性有了明顯的提高，在80°C處理4min還能保留56. 7%的酶活性，處理IOmin后還有22. 8%的剩余酶活性。而xyn-⑶BFV在80°C處理2min酶活性就損失了 75%, IOmin酶活性完全損失。xyn-⑶BFV_m在80°C的穩(wěn)定性實驗結(jié)果表明，該木聚糖酶能夠抵御飼料高溫(80°C左右)制粒時短暫的高溫處理。因此，本發(fā)明的優(yōu)化改良的木聚糖酶xyn-⑶BFV-m可在飼料工業(yè)中顯示出巨大的應(yīng)用潛力。實施例7、木聚糖酶xyn-⑶BFV-m在畢赤酵母中的高效表達
(I)表達載體的構(gòu)建及在酵母的表達以合成的木聚糖酶xyn-⑶BFV-m為模板，設(shè)計合成了帶有EcoR I和Not I限制性酶切位點的引物pIC9-xyn-F和pIC9_xyn-R,對xyn-CDBFV-m的成熟蛋白的編碼區(qū)進行擴增。并利用EcoR I和Not I酶切PCR產(chǎn)物，連接進入表達載體pPIC9(Invitrogen，SanDiego),使木聚糖酶xyn-⑶BFV-m插入到上述表達載體的信號肽序列的下游，與信號肽形成正確的閱讀框架，構(gòu)建成酵母表達載體pPIC9-xyn-CDBFV-m，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞JM109o陽性轉(zhuǎn)化子進行DNA測序，測序表明序列正確的轉(zhuǎn)化子用于大量制備重組質(zhì)粒。約8微克的用限制性內(nèi)切酶BglII進行線性化表達質(zhì)粒載體DNA，電擊轉(zhuǎn)化酵母GS115感受態(tài)細胞，涂布于組氨酸缺陷性的RDB平板，30°C培養(yǎng)2-3天，挑取在RDB平板上生長的轉(zhuǎn)化子 進行進一步的表達實驗。酵母表達引物序列如下pPIC9-xyn-m-F GCACGAATTCCAATCCTTCTGTTCCAGCGCpPIC9-xyn-m-R GCACGCGGCCGCTTAGTCACCGATGTAAACCTTTG(2)高木聚糖酶活性轉(zhuǎn)化子的篩選用滅過菌的牙簽從長有轉(zhuǎn)化子的RDB板上挑取單菌落，按照編號先點到麗上，再點到相應(yīng)編號的MD平板上，每個平板上點100個單菌落，共計500個轉(zhuǎn)化子；將點有轉(zhuǎn)化子的麗、MD平板置于30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)I 2天，至菌落長出。按編號從MD平板上挑取轉(zhuǎn)化子接種于裝有3mL BMGY培養(yǎng)基的離心管中，30°C、260rpm搖床培養(yǎng)48h ;將搖床培養(yǎng)48h的菌液3，000 X g離心15min，去上清，離心管中再加入ImL含有0. 5%甲醇的BMMY培養(yǎng)基，在30°C、260rpm誘導培養(yǎng)；誘導培養(yǎng)48h后，3，OOOXg離心5min，取上清用于酶活性檢測，從中篩選出高木聚糖酶活性的轉(zhuǎn)化子。(3)高木聚糖酶活性轉(zhuǎn)化子在發(fā)酵罐水平的小試表達高細胞密度發(fā)酵用3. 7-L發(fā)酵罐進行實驗，按照InviTOgen公司的畢赤發(fā)酵過程指導(Pichia Fermentation Process Guidelines)操作。將上述獲得的高木聚糖酶活性的轉(zhuǎn)化子進行發(fā)酵罐水平高密度發(fā)酵試驗。隨著甲醇誘導時間的延長，發(fā)酵上清液中木聚糖酶酶活力顯著增加。誘導156h后木聚糖酶活性可達57，364U/mL，菌體濕重達353g/L。
權(quán)利要求
1.一種熱穩(wěn)定性改良的木聚糖酶xyn-⑶BFV-m，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO. I所示。
2.一種熱穩(wěn)定性改良的木聚糖酶基因xyn-CDBFV-m，其特征在于，其編碼權(quán)利要求I所述的木聚糖酶xyn-Q)BFV-m。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的木聚糖酶基因xyn-CDBFV-m，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2 所示。
4.包含權(quán)利要求2所述的木聚糖酶基因xyn-⑶BFV-m的表達載體。
5.包含權(quán)利要求2所述的木聚糖酶基因xyn-⑶BFV-m的表達載體pPIC9-xyn-CDBFV-m。
6.包含權(quán)利要求2所述的木聚糖酶基因xyn-⑶BFV-m的重組菌株。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組菌株，其特征在于，所述重組菌株為畢赤酵母細胞、啤酒酵母細胞或多型遜酵母細胞。
8.包含權(quán)利要求I所述的木聚糖酶xyn-⑶BFV-m的飼料添加劑。
9.權(quán)利要求I所述的木聚糖酶xyn-⑶BFV-m應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種熱穩(wěn)定性提高的木聚糖酶xyn-CDBFV-m及其基因和應(yīng)用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。為了提高瘤胃真菌Neocallimastix patriciarum的木聚糖酶xyn-CDBFV的熱穩(wěn)定性，使其能夠抵御飼料制粒時的高溫，以便于在飼料中得到應(yīng)用。本發(fā)明利用蛋白質(zhì)工程的手段，在木聚糖酶xyn-CDBFV的N端引入二硫鍵；消除了兩個B-factor比較高的區(qū)域；和在分子表面引入鹽鍵的方法，最終得到了一個熱穩(wěn)定性明顯提高的木聚糖酶xyn-CDBFV-m。本發(fā)明獲得木聚糖酶xyn-CDBFV-m，在80℃處理4min還能保留56.7％的酶活性，使其可以抵御飼料在制粒時短暫的高溫處理，顯示出巨大的應(yīng)用潛力。
文檔編號C12N1/19GK102757947SQ201110105010
公開日2012年10月31日 申請日期2011年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月25日
發(fā)明者張菁, 詹志春 申請人:武漢新華揚生物股份有限公司