專利名稱：一種縱切幼苗葉基座轉化小麥的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于小麥轉基因領域，涉及一種農(nóng)桿菌介導的，縱切幼苗葉基座轉化小麥的方法。
背景技術：
小麥是總產(chǎn)量占第二位的糧食作物，在世界各地廣泛種植。隨著世界人口的增長和人們生活水平的提高，人們對小麥的需求量越來越大，對小麥品質的要求也越來越高。 常規(guī)育種已不能滿足人們對小麥品種和品質的要求。轉基因技術的發(fā)展打破了常規(guī)育種的種族限制，許多作物比如玉米、油菜等利用轉基因技術已經(jīng)成功培育出了優(yōu)質、高效的轉基因新品種。與其他作物相比，小麥的轉基因育種相對滯后，轉基因成功的例子較少，這由于小麥組織培養(yǎng)植株的再生頻率低，建立穩(wěn)定高效的再生體系比較困難；另一方面，小麥是多倍體作物，基因組大，遺傳背景復雜，遺傳轉化體系不完善。目前，小麥轉基因的方法主要有花粉管通道法、基因槍法、PEG介導法以及農(nóng)桿菌介導法。花粉管通道法是利用植物授粉后花粉萌發(fā)形成的花粉管，將外源DNA導入尚不具備正常細胞壁的卵、合子或早期胚胎細胞中。該方法具有操作簡單、耗費低廉、不需要經(jīng)過繁瑣的組織培養(yǎng)過程等優(yōu)點，但是目前該方法尚不成熟，DNA的導入時間和部位往往會影響植株的結實率，最終很難得到轉基因后代?；驑尫ㄊ切←溵D基因育種的主要方法，在獲得的小麥轉基因植株的報道中，基因槍法占了絕大多數(shù)，這主要由于該方法不受作物基因型的限制、方法相對簡單，目前基因槍介導的小麥轉化體系已經(jīng)比較完善。但是基因槍法需要經(jīng)過復雜的組織培養(yǎng)和植株再生過程，成本花費高、周期長，不利于轉基因小麥的產(chǎn)業(yè)化。 PEG法主要是以原生質體為受體的轉化方法，由于小麥的原生質體再生困難，限制了該方法的使用。由于小麥不是農(nóng)桿菌的天然宿主、谷物類作物對農(nóng)桿菌沒有傷感反應等原因，農(nóng)桿菌介導的小麥轉化一直是擺在分子生物學家和育種學家面前的一道難題。后來人們雖然實現(xiàn)了農(nóng)桿菌介導的小麥轉化，但是受到基因型、組織培養(yǎng)條件、外植體類型、農(nóng)桿菌菌株等限制，目前農(nóng)桿菌介導的小麥轉化效率低，需要組織培養(yǎng)和植株再生階段，周期比較長， 不利于產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展。由于農(nóng)桿菌轉化方法具有易操作、低費用、高效率、插入片段的確定性好、拷貝數(shù)低等獨特優(yōu)點，因此通過研究來提高農(nóng)桿菌的轉化效率具有主要的意義。本發(fā)明提供了一種農(nóng)桿菌介導的小麥活體轉化方法，除了具有上述農(nóng)桿菌轉化的通用優(yōu)點外， 還具有轉化植株存活率高、不需經(jīng)過復雜的組織培養(yǎng)等優(yōu)越性，具有很高的實際操作性和市場推廣價值。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種縱切幼苗葉基座轉化小麥的轉基因方法，包括以下步驟
3(a)浸泡小麥種子使之吸水飽和，培養(yǎng)胚軸至長1 2cm。(b)將含有目的基因的農(nóng)桿菌用滲透培養(yǎng)基懸浮，所述滲透培養(yǎng)基含有細胞分裂素KT、植物生長素2，4-D、抗氧化劑DTT和L-Cysteine。(c)幼苗浸泡在滲透培養(yǎng)基中，用11號手術刀在小麥的葉基座中間部位縱切致傷。(d)致傷處理后的小麥幼苗浸沒在滲透培養(yǎng)基中，28°C黑暗條件下140 170rpm 培養(yǎng) 15 30mino(f)處理好的小麥幼苗在吸水紙上空干，種入蛭石營養(yǎng)土混合土中25 28°C黑暗條件下培養(yǎng)2天；然后栽入大棚中。本發(fā)明使用的滲透培養(yǎng)基里添加了生長素2，4-D、激動素(KT)、抗氧化劑DTT和 L-Cysteine、這些添加劑能夠顯著提高小麥的轉化效率。本發(fā)明所有的滲透培養(yǎng)基植物生長素2，4-D的優(yōu)選用量為0. 5-5mg/L,細胞分裂素KT的優(yōu)選用量為0. l_4mg/L，抗氧化劑 DTT的優(yōu)選用量為0. 5-5mM/L, L-Cysteine的優(yōu)選用量為100 400mg/L。本發(fā)明含有目的基因的農(nóng)桿菌的獲得，是將目的基因插入表達載體，再將該載體導入農(nóng)桿菌中。常用的表達載體包括但不限于=PBin系列載體、pBI系列在、Gateway系列載體、pCAMBIA系列載體；常用的農(nóng)桿菌菌株包括但不限于AGL0、AGLU GV3101、EHA105、 LBA4404 等。本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)小麥幼苗的培養(yǎng)時間以及胚軸的長度是影響小麥的轉化
效率的一個重要因素。本發(fā)明中所用的小麥幼苗是在25 °C、14小時光照10小時黑暗、保濕條件培養(yǎng)廣3天，小麥胚軸的長度為l-2cm。這種狀態(tài)下生長的小麥幼苗縱切后植株的生長狀態(tài)是最好的，轉化效率也是最高。小麥幼苗的致傷位置和方式是影響小麥轉基因效率的另一個重要因素。本發(fā)明人經(jīng)過長期艱苦的實驗發(fā)現(xiàn)縱切部位為小麥幼苗的葉基座時轉化效率最高，具體操作為用 11號手術刀的刀尖插入葉基座的中央部位，刀刃向基部方向輕輕斜拉出，縱切傷口長度優(yōu)選為l-2mm。刀刃不能穿透葉基座。在整個致傷過程中，小麥的幼苗植株是完整的，所以本發(fā)明中小麥縱切轉化后植株的生長狀態(tài)良好，能夠得到高轉化效率的轉基因后代。在本發(fā)明中，縱切小麥幼苗的葉基座，在其中間位置制造傷口，基座內部的葉原基被分割成兩部分，在后來的生長發(fā)育過程中，原來的小麥幼苗發(fā)育成一個由2個并行植株組成的小麥。所以，采用本發(fā)明轉化小麥所得到的TO代轉基因小麥為2個并行植株組成的小麥。因為縱切力度的不同和位置的偏差，TO轉基因小麥的2個并行植株存在3種情況一種是2個并行植株大小差別不大，并行生長；另外一種是2個并行植株中一個生長比較健壯，另一個生長相對弱小，并行生長；還有一種是2個并行植株中一個生長健壯，另一個生長弱小，隨著生長發(fā)育的進行，弱小的植株逐漸退化。本發(fā)明所提供的縱切小苗幼苗葉基座轉化小麥的轉基因方法是一種農(nóng)桿菌介導的活體轉化方法，操作簡便、轉化效率高、不需經(jīng)過復雜而漫長的組織培養(yǎng)階段、轉化后小麥生長狀態(tài)良好，具有非常大的實際應用價值和市場推廣前景。為了便于理解，下面將結合附圖和實施例進一步詮釋本發(fā)明。具體實例和附圖僅是為了更好的闡述本發(fā)明，并不構成對本發(fā)明范圍的限制。顯然本領域的普通技術人員可以根據(jù)本文說明，在本發(fā)明的范圍內對本發(fā)明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發(fā)明的范圍內。


圖1為TO代轉基因小麥草丁膦涂抹實驗篩選結果示圖，其中A圖為轉基因陰性植株，B圖為轉基因陽性植株。紅色箭頭所指方向為草丁膦涂抹的葉片部位。圖2為由2個并行植株組成的TO代轉基因小麥的三種存在狀態(tài)。其中圖A所示為2個并行植株大小差別不大，并行生長；圖B所示為2個并行植株中一個生長比較健壯， 另一個生長相對弱小，并行生長；圖C所示的情況為2個并行植株中一個生長健壯，另一個生長弱小，隨著生長發(fā)育的進行，弱小的植株逐漸退化。圖3為Tl代轉基因小麥草丁膦噴灑實驗篩選結果，紅色箭頭標注的為篩選到的轉基因陽性植株。圖4為Tl代轉基因小麥的PCR檢測結果，其中泳道M為marker，+是以質粒為模板的正對照，-為野生型負對照，1 7為檢測的7個轉基因小麥。圖5為Tl代轉基因小麥的southern檢測結果，其中泳道1 7為轉基因小麥，+ 為質粒的正對照，“為野生型負對照。
具體實施例方式下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見 《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》 (Sambrook， J. ， Russell, David W.， Molecular Cloning: A Laboratory Manual，3rd edition,2001,NY,Cold Spring Harbor)。 所用引物及DNA序列均由上海英駿生物技術有限公司合成。實施例一、縱切幼苗葉原基轉化小麥
1.實驗材料
質粒含有bar基因，帶有潮霉素篩選標記基因的pCambial300-bar載體，具有抗草銨磷除草劑。PCR擴增bar基因連接到pcambial300 (購自Invitrogen公司)載體上得到 pcambial300-bar 本。農(nóng)桿菌菌株AGL0。供轉化的小麥品種京麥9158
2.農(nóng)桿菌的培養(yǎng)
挑取甘油凍存的含有目的基因的農(nóng)桿菌，于YEB平板上畫線，28°C黑暗培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 天。挑取單菌落接種于40ml抗性YEB液體培養(yǎng)基中，28°C黑暗搖床200rpm搖過夜，至 OD600 1。吸取上述培養(yǎng)物250 300 μ 1涂布于平板直徑為15cm的YEB固體培養(yǎng)基上， 28°C黑暗培養(yǎng)箱培養(yǎng)2天后，此備用的新鮮平板當天使用，約20°C室溫黑暗待用，不要繼續(xù)存留于28°C黑暗培養(yǎng)箱或轉存于4°C冰箱。3.滲透培養(yǎng)基的制備
首先按照下述配方配制AA培養(yǎng)基。AA培養(yǎng)基配制(IL) MgSO40. 12209g
5KCl2. 95gNaH2PO4 · 2H200. 15g肌醇0. Ig谷氨酸0. 876g天門冬氨酸0.,266g精氨酸0.,174g酪蛋白水解物0. 3g蔗糖20g鐵鹽溶液5ml②再加4. 5ml/L5M NaCl③ FeSO4 · 7H205. 56g/LCaCl2溶液4. 5mlVB1溶液IOmlVB6溶液Iml煙酸溶液ImlB5微量Iml
① EDTA-2Na 7.46g/L 調 pH=8. 0
25. 06g/L lg/L lg/L 0. lg/L MnSO4 ZnSO4
H2O 7H20
H3BO3 KI
Na2MoO4
2H20
CuSO4 · 5H20
CoCl9
6H20
7. 58g/L 2. Og/L 3. Og/L 0. 75g/L 0. 25g/L 0.025g/L 0.025g/L
在IL AA培養(yǎng)基中添加下列成分
As (100 200 μ M )； KT (0. 2mg)； 2，4_D (Img)5DTT (ImM )； L-Cysteine (200 400mg) ；silwet-L77 (100 400 μ 1)。
將培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌用上述滲透培養(yǎng)基懸浮，使懸浮菌液的0D_值為0. 4 0. 7，pH至 5. 0 5. 5，轉化滲透培養(yǎng)液制備完畢。4.植株選擇準備
浸泡小麥種子使之吸水飽和后25 V，14小時光照10小時黑暗，保濕條件下萌發(fā)3 4天，每天早晚各清洗一次，至胚軸長至1 2cm。5.農(nóng)桿菌菌液浸染小麥幼苗葉基座
(1)幼苗浸泡在上述滲透培養(yǎng)基中，用11號手術刀的刀尖插入葉基座的中央部位， 刀刃向基部方向輕輕斜拉出，縱切傷口長度為l-2mm，不要穿透葉基座，使小麥植株是完整的；
(2)致傷處理后的小麥幼苗浸沒在滲透培養(yǎng)基中，28°C，24小時黑暗條件下140 170rpm 培養(yǎng) 15 30min ；
(3)侵染后的小麥幼苗在吸水紙上空干，隨后種入濕潤的蛭石+營養(yǎng)土(2:1)混合土中，覆土，25 28°C，24小時黑暗條件下培養(yǎng)2天，然后移栽到大棚中培養(yǎng)。實施例二、小麥轉基因陽性植株的檢測以及獲得
61、TO代轉基因陽性苗的篩選以及獲得
用農(nóng)桿菌介導的縱切小麥幼苗葉基座的轉基因方法得到的TO代轉基因植株為嵌合體，植株的部分器官含有目的表達，具有目標表型。因載體含有目的基因bar，如果轉基因成功，bar插入小麥基因組，使轉基因陽性植株的部分器官具有草銨磷抗性。所以，我們通過草丁膦檢測實施例一中的轉基因小麥的葉片來篩選TO代陽性轉基因植株。在葉片中部用 Mark筆橫道標記，用棉簽沾取草丁膦溶液(Basta 100mg/L + silwet-L77 200 μ 1/L)均勻涂抹在標記的外端，涂抹第3片到第六片真葉，每次的涂抹量使葉片濕潤而不溢流。5-6天后不具抗性的植株表現(xiàn)萎蔫、枯黃等明顯的藥害反應。三片真葉均表現(xiàn)草銨磷藥害反應的， 認定為轉基因陰性植株，有一片及以上葉片表現(xiàn)草丁膦抗性的，認定為轉基因陽性植株(圖 1)。TO代的轉基因小麥是由2個并行植株組成的小麥。因為縱切力度的不同和位置的偏差，TO轉基因小麥的2個并行植株存在3種情況一種是2個并行植株大小差別不大，并行生長；另外一種是2個并行植株中一個生長比較健壯，另一個生長相對弱小，并行生長； 還有一種是2個并行植株中一個生長健壯，另一個生長弱小，隨著生長發(fā)育的進行，弱小的植株逐漸退化(見圖2)。我們利用涂抹法篩選得到320株TO代陽性植株。得到的將陽性植株移栽入土壤中，在大棚條件下培養(yǎng)，直至種子成熟收獲Tl代種子。2. Tl代篩選除草劑抗性植株
將收獲的T1代種子播種到適于小麥生長的土壤中(播種量達20Kg/畝)，待第3片真葉完全展開，噴灑草丁膦溶液(Basta 150mg/L + silwet-L77 200 μ 1/L，除草劑噴灑量達到90L/畝)，7-10天后藥害情況穩(wěn)定，對草丁膦表現(xiàn)抗性的植株為轉基因陽性植株(圖3) 3. Tl代轉基因植株的PCR檢測
對Tl代草丁膦篩選的抗性植株，進行PCR檢測實驗進一步驗證轉基因是否成功。轉基因陽性植株因成功轉化bar基因而表現(xiàn)草丁膦抗性。根據(jù)bar基因的序列，設計PCR擴增引物，進一步驗證轉基因株系的陽性。每株取一片次新完全展開葉片采用CTAB法提取植物基因組DNA。根據(jù)bar基因的序列，設計PCR擴增引物序列如下 引物 1 (上游)5' TCATCAGATTTCGGTGACGG 3' 引物 2 (下游)5' TCAACTTCCGTACCGAGCCG 3'
分別利用引物1和引物2，以抗性植株基因組DNA模板，擴增bar基因片段。擴增體系和程序為
IOX Buffer 2ul ；IOmM dNTP 0. 5ul ；IOuM引物1 0. 5ul ；IOuM引物2 0. 5ul ；genomic DNA IOpg ；Taq DNA Polymerase(5U/ul)0. 4ulddH20 補足20ul。 PCR反應條件為
預變性95°C， 5min ； 變性 94°C， 20sec ；退火 55°C, 30sec ； 延伸 72°C， Imin ； 30個循環(huán)；
再延伸72°C，IOmin0反應結束后，對PCR產(chǎn)物進行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可以檢測到450bp的目的片段(結果見圖4)。我們對10個株系進行了 PCR實驗，結果全部呈陽性。這進一步證明了我們獲得的抗性植株為轉基因陽性株系。4. Tl代陽性植株的Southern blot檢測
為了確定目標bar基因確實整合到了小麥的基因組上，以及整合的拷貝數(shù)，我們進一步進行Southern blot檢測。根據(jù)bar基因的序列，設計Southern blot的探針模板引物如下
引物 3 (上游)5' TCATCAGATTTCGGTGACG 3' 引物 4 (下游)5' ATGAGCCCAGAACGACGC 3'
取小麥新長出的嫩葉，CTAB法提取植物基因組DNA。利用引物3和引物4擴增得到的片段制作bar探針，PCR擴增反應條件同上。Southern檢測為本領域常規(guī)做法。我們檢測了 7個Tl代小麥，得到了 5個單拷貝插入的轉基因陽性植株，檢測結果如圖5示。
權利要求
1.一種農(nóng)桿菌介導的縱切幼苗葉基座轉化小麥的轉基因方法，包括以下步驟(a)、浸泡小麥種子使之吸水飽和，培養(yǎng)胚軸至長1 2cm;(b)、將含有目的基因的農(nóng)桿菌用滲透培養(yǎng)基懸浮，所述滲透培養(yǎng)基含有細胞分裂素 KT、植物生長素2，4-D、抗氧化劑DTT和L-Cysteine;(c)、幼苗浸泡在滲透培養(yǎng)基中，用11號手術刀在小麥的葉基座中間部位縱切致傷；(d)、致傷處理后的小麥幼苗浸沒在滲透培養(yǎng)基中，28°C、24小時黑暗條件下140 170rpm 培養(yǎng) 15 30min ；(f)、處理好的小麥幼苗在吸水紙上空干，種入蛭石營養(yǎng)土混合土中25 28°C黑暗條件下培養(yǎng)2天，然后栽入大棚中培養(yǎng)。
2.根據(jù)權利要求1所述的小麥轉基因方法，其特征在于步驟(a)所述的培養(yǎng)胚軸的培養(yǎng)條件為25 °C、14小時光照10小時黑暗、保濕，培養(yǎng)時間為2 3天。
3.根據(jù)權利要求1所述的小麥轉基因方法，其特征在于所述的滲透培養(yǎng)基中植物生長素2，4-D的優(yōu)選用量為0. 5-5mg/L,細胞分裂素KT的優(yōu)選用量為0. l_4mg/L，抗氧化劑 DTT的優(yōu)選用量為0. 5-5mM/L, L-Cysteine的優(yōu)選用量為100 400mg/L。
4.根據(jù)權利要求1所述的小麥轉基因方法，其特征在于所述含有目的基因的農(nóng)桿菌是將目的基因插入表達載體，再將該載體導入農(nóng)桿菌中。
5.根據(jù)權利要求4所述的小麥轉基因方法，其特征在于所述表達載體為植物表達載體，優(yōu)選PBin系列載體、pBI系列在、Gateway系列載體、pCAMBIA系列載體。
6.根據(jù)權利要求1所述的農(nóng)桿菌菌株，為可轉染植物的農(nóng)桿菌菌株，優(yōu)選AGLO、AGLU GV3101、EHA105、LBA4404。
7.根據(jù)權利要求1所述的小麥轉基因方法，其特征在于步驟(c)所述的用11號手術刀在小麥的葉基座中間部位縱切致傷，具體操作為用11號手術刀的刀尖插入葉基座的中央部位，刀刃向基部方向輕輕斜拉出，縱切傷口長度優(yōu)選為l-2mm，不要穿透葉基座，使小麥植株是完整的。
8.根據(jù)權利要求1 7任一權利要求所述的小麥轉基因方法，其特征在于，所述小麥為栽培或野生小麥品種、品系、育種材料或中間材料。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種農(nóng)桿菌介導的縱切幼苗葉基座轉化小麥的轉基因方法，包括(a)浸泡小麥種子使之吸水飽和，培養(yǎng)胚軸至長1～2cm；(b)將含有目的基因的農(nóng)桿菌用含有細胞分裂素KT、植物生長素2,4-D、抗氧化劑DTT和L-Cysteine滲透培養(yǎng)基懸?。?c)幼苗浸泡在滲透培養(yǎng)基中，用11號手術刀在小麥的葉基座中間部位縱切致傷；(d)致傷處理后的小麥幼苗浸沒在滲透培養(yǎng)基中培養(yǎng)；(e)處理好的小麥幼苗在吸水紙上空干，栽入大棚中培養(yǎng)。該方法是一種無需經(jīng)過組織培養(yǎng)階段的農(nóng)桿菌介導的小麥轉化方法，具有比較高的實際應用價值和推廣前景。
文檔編號C12N15/84GK102220373SQ20111010527
公開日2011年10月19日 申請日期2011年4月26日 優(yōu)先權日2010年5月17日
發(fā)明者何峰, 夏勉, 孔祥鳳, 張會新, 張斌 申請人:北京未名凱拓作物設計中心有限公司