專利名稱：通過超量表達(dá)yerP基因提高枯草芽孢桿菌抗菌肽產(chǎn)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過超量表達(dá)J^rP基因提高枯草芽孢桿菌抗菌肽產(chǎn)量的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。背景技術(shù)：
枯草芽孢桿菌OfeCiBm ·5油^Vi1S)是目前公認(rèn)的安全微生物之一，其抗菌代謝產(chǎn)物豐富多樣，尤其是脂肽類抗菌物質(zhì)，不僅抗菌譜廣而且還具有生物表面活性劑的功能，因此不僅可以在農(nóng)業(yè)上用于進(jìn)行生物防治，而且在工業(yè)和環(huán)境保護(hù)上也有著廣泛的應(yīng)用。枯草芽孢桿菌(feci/^Assubtil is) ATCC 9943 是一種可以分泌 surfactin， fengycin等抗菌月太物質(zhì)的枯草芽孢桿菌(Val6rie Leclere, Romain Marti, Max Bechet. The lipopeptides mycosubtilin and surfactin enhance spreading of Bacillus subtilis strains by their surface-active properties. Arch Microbiol. (2006) 186: 475-483)。其中，surfactin作為一種生物表面活性劑，與化學(xué)表面活性劑相比，其具有擁有生物降解能力，低毒，結(jié)構(gòu)豐富的優(yōu)點(diǎn)，隨著對(duì)工業(yè)原料的環(huán)境適應(yīng)性要求的提高， 其應(yīng)用于環(huán)境保護(hù)，石油開采方面潛力將會(huì)越來越大。但實(shí)際中，其并未在工業(yè)以及環(huán)境保護(hù)中廣泛應(yīng)用，究其原因，是因?yàn)樗a(chǎn)成本巨大，所以提高其產(chǎn)量便成為降低其生產(chǎn)成本的核心問題。目前，世界范圍內(nèi)，提高其產(chǎn)量的方法主要是篩選優(yōu)良菌株，以及優(yōu)化發(fā)酵條件， 而很少采用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)菌種進(jìn)行改良的方法來提高其產(chǎn)抗菌物質(zhì)的產(chǎn)量。但隨著對(duì)抗菌肽合成分泌研究的日益深入，已經(jīng)逐漸開始采用分子生物學(xué)技術(shù)，通過改造其合成分泌中信號(hào)通路等方法來對(duì)原始菌種進(jìn)行基因改良，從而提高其自身合成分泌抗菌肽能力。J^r/7基因(Gene ID: 154684518)，其表達(dá)產(chǎn)物YerP蛋白是枯草桿菌中surfactin 抗菌肽的免疫蛋白，可以免疫surfactin對(duì)細(xì)胞自身的傷害，相關(guān)研究表明，YerP蛋白可以免除枯草桿菌分泌的surfactin對(duì)自身的傷害。本方法首先以枯草芽孢桿菌ATCC 9943為出發(fā)菌株，以枯草桿菌表達(dá)載體 PHCMC04為骨架構(gòu)建一個(gè)J^rP基因超量表達(dá)載體pHCMC-YerP，通過電轉(zhuǎn)化將其轉(zhuǎn)入到枯草桿菌ATCC9943中使J^rP基因超量表達(dá)，構(gòu)建了一個(gè)高產(chǎn)抗菌肽菌株FMB 45。三、發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題
本發(fā)明的目的是利用分子生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建J^rP基因超量表達(dá)載體，通過電轉(zhuǎn)化將其轉(zhuǎn)入到枯草桿菌ATCC 9943中，從而構(gòu)建一種高產(chǎn)抗菌肽的枯草芽孢桿菌菌株FMB 45。技術(shù)方案
1、通過超量表達(dá)J^rP基因提高枯草芽孢桿菌抗菌肽產(chǎn)量的方法，其特征在于 (DyerP基因超量表達(dá)載體pHCMC_YerP的構(gòu)建
根據(jù)枯草芽孢桿菌P43啟動(dòng)子基因設(shè)計(jì)引物P43-F和P43-R，以枯草芽孢桿菌 {Bacillus subtilis)klCC 9943基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增P43啟動(dòng)子基因，獲得300 bp基因片段；設(shè)計(jì)引物YerP-F和YerP-R，以枯草芽孢桿菌(feci/A/s subtil is) ATCC 9943 基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增YerP基因，獲得3195 bp基因片段；擴(kuò)增得到的兩個(gè)基因分別克隆至PMD19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(fecAericAia cWi) DH5a，經(jīng)驗(yàn)證、測序正確后，分別命名為p/￥J_T、pFerP- ,于_20°C條件下保存?zhèn)溆茫?br> 權(quán)利要求
1.通過超量表達(dá)J^rP基因提高枯草芽孢桿菌抗菌肽產(chǎn)量的方法，其特征在于 (DyerP基因超量表達(dá)載體pHCMC_YerP的構(gòu)建設(shè)計(jì)引物P43-F和P43-R，以枯草芽孢桿菌(feci/A/s subtil is) ATCC 9943基因組 DNA為模板PCR擴(kuò)增P43啟動(dòng)子基因，獲得300 bp基因片段；設(shè)計(jì)引物YerP-F和YerP-R， 以枯草芽孢桿菌(Mcillus subtiHs)kTCC 9943基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增YerP基因表達(dá)框，獲得3195 bp基因片段；擴(kuò)增得到的兩個(gè)基因分別克隆至PMD19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿 ^Escherichia co7i)DH5a,經(jīng)驗(yàn)證、測序正確后，分別命名為 p/￥J_T、pVerP- ,于-20°C 條件下保存?zhèn)溆茫?br> 2.權(quán)利要求1所述方法獲得的超量表達(dá)J^rP基因菌株FMB45。
3.權(quán)利要求2所述超量表達(dá)J^rP基因菌株FMB45在生產(chǎn)枯草芽孢桿菌抗菌肽中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求2所述超量表達(dá)J^rP基因菌株FMB45生產(chǎn)的枯草芽孢桿菌抗菌肽產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過超量達(dá)yerP基因提高枯草桿菌抗菌肽產(chǎn)量的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本方法首先以枯草芽孢桿菌ATCC9943為出發(fā)菌株，以大腸桿菌克隆載體pHCMC04為骨架構(gòu)建一個(gè)基因超量表達(dá)載體pHCMC-YerP，通過電轉(zhuǎn)化將其轉(zhuǎn)入到枯草桿菌ATCC9943中使yerP基因超量表達(dá)，構(gòu)建了一個(gè)高產(chǎn)抗菌肽菌株FMB45。經(jīng)過高效液相色譜分析，確定改良菌株產(chǎn)surfactin和fengycin的能力大大提高。
文檔編號(hào)C12P21/02GK102220367SQ20111010539
公開日2011年10月19日 申請日期2011年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月27日
發(fā)明者別小妹, 呂鳳霞, 張充, 曹國強(qiáng), 鐘蕾, 陸兆新 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)