專利名稱：用骨髓組織塊分離及培養(yǎng)禽類骨髓間充質(zhì)干細胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及干細胞的分離培養(yǎng)技術(shù)，具體地說，涉及一種利用骨髓組織塊分離及 培養(yǎng)禽類骨髓間充質(zhì)干細胞的方法。
背景技術(shù)：
骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone mesenchymal stem cell，BMSC)是一群具有多向分化 潛能的干細胞，可以分化為成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、成肌細胞、神經(jīng)細胞和心肌細胞 等等。這一特性使得BMSC成為理想的種子細胞應(yīng)用于組織工程中，在細胞工程、基因治療 及器官移植等領(lǐng)域具有重要意義。BMSC具有單個貼壁生長形成克隆，成為集落形成成纖維 樣細胞(colony-forming fibroblastic units, CFU-F)。CFU-F 成為鑒定骨髓間充質(zhì)干細 胞的手段之一。體外BMSC呈梭形，表達CD44、⑶73、⑶29、⑶106、⑶105、CD90等，不表達 ⑶；34、⑶45和⑶14等，由于尚未發(fā)現(xiàn)BMSC的特異性標記分子，⑶44+、⑶45\⑶73+、⑶四+、 ⑶106+、⑶105+、⑶90+，可用來間接對骨髓間充質(zhì)干細胞進行表型鑒定。目前，人和嚙齒動物的BMSC的體外分離培養(yǎng)及分化潛能的研究較為廣泛，主要方 法為密度梯度離心法、貼壁篩選法和免疫分離法。密度梯度離心法根據(jù)不同細胞密度不同 原理利用Percoll分離液將BMSC分離出來，方法簡單，但BMSC獲得率較低。貼壁篩選法一 般將骨髓吹打為單細胞懸浮液，進行全血細胞貼壁4-12小時，根據(jù)不同細胞貼壁特性進行 分離得到的BMSC，操作簡單，但細胞均一性較差，細胞的實質(zhì)是多種類型細胞的混合，抗原 差異性也較大，細胞克隆化能力、繼代培養(yǎng)和擴增能力均較低。免疫分離法可以根據(jù)細胞表 面標志進行富集或根據(jù)表面負表達抗原進行負分選，能更好的分離純化BMSC，但是對細胞 活性影響較大，費用高，所需樣本量較大。目前，針對禽類BMSC的研究相對較少，主要原因在于禽類的BMSC分離困難，基本 采用上述已有的方法，費用較高同時存在BMSC獲得率和所得細胞分化潛能均較差等缺點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用骨髓組織塊分離及培養(yǎng)禽類骨髓間充質(zhì)干細胞的 新方法。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種利用骨髓組織塊分離及培養(yǎng)禽類骨髓間充質(zhì) 干細胞的方法，其是將禽類骨髓碎塊懸浮于胎牛血清中，然后將該血清懸浮液移至培養(yǎng)皿 中，傾斜放置一段時間，去除血清后加入完全培養(yǎng)液貼壁培養(yǎng)，獲得原代培養(yǎng)細胞；經(jīng)胰蛋 白酶消化后進行傳代，然后以完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，傳代2-4次后獲得禽類骨髓間充質(zhì)干細胞， 在體外培養(yǎng)體系中繼代擴增培養(yǎng)；其中，所述完全培養(yǎng)液為含有10%胎牛血清的低糖DMEM 培養(yǎng)液。前述的方法，所述傾斜放置是培養(yǎng)皿與水平面呈30-60度角。前述的方法，傾斜放置放置的時間為40-60分鐘。前述的方法，去除血清后加入完全培養(yǎng)液貼壁培養(yǎng)的時間為3-6天，優(yōu)選為3天。
前述的方法，原代培養(yǎng)細胞經(jīng)胰蛋白酶消化后，以1 2-3的比例傳代，優(yōu)選為 1 3的比例傳代。 前述的方法，禽類骨髓來自于禽類的股骨和/或肱骨。前述的方法，所述禽類骨髓碎塊為1 2mm3。前述的方法，貼壁培養(yǎng)的密度為0. 5 1骨髓組織碎塊/cm2。前述的方法，繼代擴增培養(yǎng)時細胞接種密度為IX IO5 IX IO6個細胞/cm2。具體地，本發(fā)明提供的禽類骨髓間充質(zhì)干細胞的分離及體外擴增培養(yǎng)方法包括1)原代培養(yǎng)取禽類股骨和肱骨，取出骨髓放入離心管中，用剪刀將骨髓剪碎至 1 2mm3，向離心管中加入500 800 μ 1胎牛血清，移液器緩慢吹打至骨髓組織塊懸浮，移 置到IOOmm培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿放入二氧化碳培養(yǎng)箱中，與水平面呈30 60度角傾斜放置 40 60分鐘，將血清去除后加入IOml完全培養(yǎng)液培養(yǎng)3天，獲得原代細胞。完全培養(yǎng)液成 分為低糖 DMEM 培養(yǎng)液(Dulbecco' s modification ofEagle' s medium Dulbecco，改良 Eagle培養(yǎng)基)+10%胎牛血清。2)傳代培養(yǎng)將培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液去除，加入5ml，0. 25%胰蛋白酶消化原代細 胞，顯微鏡下觀察梭形細胞逐漸變圓后去除胰蛋白酶，加入6mlDMEM用移液器吹打細胞后， 平均分至3個培養(yǎng)皿中以完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，為Pl代細胞。Pl代細胞培養(yǎng)3天，將培養(yǎng)液去 除，胰蛋白酶消化，顯微鏡下觀察梭形細胞逐漸變圓，將胰蛋白酶吸出，加入DMEM用移液器 吹打，將圓形細胞吹起，吸出，1 3比例以完全培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)，獲得P2代細胞，其他雜細 胞繼續(xù)貼在培養(yǎng)皿底部(差速消化法)，P2代細胞即為經(jīng)純化的禽類骨髓間充質(zhì)干細胞。借由上述技術(shù)方案，本發(fā)明至少具有下列優(yōu)點及有益效果(一 )本發(fā)明中禽類骨髓間充質(zhì)干細胞的分離方法是骨髓組織塊直接貼壁法，而 非以往的細胞密度梯度離心，大大降低了分離細胞時細胞分離液以及離心環(huán)境對細胞造成 的化學(xué)及機械刺激，減少細胞損傷，由此方法分離的骨髓間充質(zhì)干細胞具有比較好的增殖 潛能和分化潛力。( 二)本發(fā)明中禽類骨髓間充質(zhì)干細胞的分離方法是骨髓組織塊直接貼壁法，骨 髓間充質(zhì)干細胞從骨髓組織塊中生長爬出，細胞類型單一；傳統(tǒng)的全骨髓貼壁法是將全骨 髓吹打制成單細胞懸液后進行貼壁培養(yǎng)，貼壁細胞中包括大量雜細胞。采用本發(fā)明方法獲 得的骨髓間充質(zhì)干細胞較純，簡化了后期純化過程，提高純化效率。(三)本發(fā)明中骨髓組織塊貼壁培養(yǎng)過程中培養(yǎng)皿采用傾斜靜置法，使得例如紅 細胞等未貼壁的細胞可隨血清流動至培養(yǎng)皿邊緣，待去除血清時隨之將大部分雜細胞剔 除，由此方法分離的骨髓間充質(zhì)干細胞純度較高，且純化過程相對較短，骨髓間充質(zhì)干細胞 活力較強。(四)本發(fā)明獲得的骨髓間充質(zhì)干細胞能夠在體外生長并穩(wěn)定傳代，具有典型的 梭形形態(tài)，生長速度快，本發(fā)明所述方法簡單易行，可操作性強，適合應(yīng)用于組織工程學(xué)和 基因治療領(lǐng)域。


圖1為本發(fā)明方法獲得的骨髓間充質(zhì)干細胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果。圖2A和圖2B分別為本發(fā)明方法獲得的骨髓間充質(zhì)干細胞的抗體檢測以及RT-PCR檢測結(jié)果。圖3為本發(fā)明方法獲得的骨髓間充質(zhì)干細胞的成集落能力(CFU-F)檢測結(jié)果。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1雞骨髓間充質(zhì)干細胞分離培養(yǎng)(1)雞骨髓間充質(zhì)干細胞的分離和原代培養(yǎng)取5日齡白來航雞股骨和肱骨，去兩端骨骺，用骨剪將骨剪開，取出骨髓放入5ml 離心管中，用手術(shù)剪剪碎至l_2mm3，加入800 μ 1胎牛血清，用移液器緩慢吹打使得骨髓碎塊 懸浮，移置到IOOmm培養(yǎng)皿中，用移液器整理使得骨髓碎塊在培養(yǎng)皿中均勻分布，將培養(yǎng)皿 放入二氧化碳培養(yǎng)箱，37 0C，90%濕度，5% CO2，傾斜60度角放置60分鐘后，將培養(yǎng)皿取出， 吸凈培養(yǎng)皿中的血清，緩慢加入完全培養(yǎng)液(含有10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液)，培 養(yǎng)3天，得到雞骨髓間充質(zhì)干細胞原代(Ρ0代)細胞。(2)雞骨髓間充質(zhì)干細胞的傳代培養(yǎng)取雞骨髓間充質(zhì)干細胞原代細胞，倒掉其中培養(yǎng)液，PBS清洗2遍，加入0. 25%胰 蛋白酶消化，顯微鏡下觀察細胞由梭形逐漸變成圓形時，將胰蛋白酶倒掉，向培養(yǎng)皿中緩慢 加入6ml DMEM吹打，使得培養(yǎng)皿中的骨髓間充質(zhì)干細胞懸浮，其它雜細胞則繼續(xù)留在培養(yǎng) 皿底部(差速消化法)，將DMEM懸液平均加入3個IOOmm培養(yǎng)皿中，再向每個培養(yǎng)皿中加入 7ml DMEM和Iml胎牛血清，培養(yǎng)3天，重復(fù)同樣方法傳代，可得到純化的雞骨髓間充質(zhì)干細 胞。(3)骨髓間充質(zhì)細胞的鑒定雞骨髓間充質(zhì)干細胞的形態(tài)學(xué)觀察雞骨髓間充質(zhì)干細胞原代培養(yǎng)3天后，顯微 鏡XlOO下觀察細胞，骨髓碎塊周圍已爬出大量梭形細胞緊密排列，隨著細胞的傳代，細胞 逐漸以平行或放射狀排列，呈梭形或星形。如圖1所示，PO代(原代)細胞呈短梭形，從骨 髓組織塊(黑色實心塊狀物)中爬出；P2代細胞貼壁分裂增殖；P3代細胞逐漸形成平行狀 排列，P4代細胞呈梭形，細胞形態(tài)較好。雞骨髓間充質(zhì)干細胞表面抗原單克隆抗體鑒定取P3代細胞接種于96孔培養(yǎng)板， 培養(yǎng)M小時，PBS清洗3遍，加入4%多聚甲醛50ul，4°C固定30分鐘，去除固定液，PBS清洗 3遍，加入抗體染液50ul和濃度為50ng/ml的hoestch33342 5ul，避光4°C染色1小時。棄 去染色，PBS清洗3遍，在倒置熒光顯微鏡下觀察，CD44、CD45激發(fā)波長550nm，hoestch33342 激發(fā)波長360nm?？贵w檢測結(jié)果如圖2A所示，⑶44呈陽性，⑶45呈陰性。雞骨髓間充質(zhì)干細胞RT-PCR檢測利用TRIZOL方法提取骨髓和分離P3代細 胞的總 RNA，取 3yg 總 RNA 使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒 PrimeScriptlst Strand cDNA Synthesis Kit (Takara 公司)合成 cDNA。以 cDNA 為模板，力Π 入 GAPDH(上游5，-CTGAGAACGGGAAACTTGTG-3，，下游 5，-CCACAACATACTCAGCACCTG-3，，105bp)、CD106 (上游5，-TCCTATCATTGAGACCAGTG-3，，下 游5，-TTTGTGCTGACATCTCCTTC-3，，159bp)、CD73 (上游5，-GGCATCGTTGGCTACACTAC-3，， 下 游5‘ -ATGTCCACAGTAAAGCCAGAG-3' , 167bp)、CD29 (上 游 5， -GGAGAAATGTTACACGGCTG-3，，下游5， -GGAGAAATGTTACACGGCTG-3，，163bp)、 CD105(上游5，-GAACCTCCTCATCCACACTG-3，，下游5，-GCTCGCTGTAGGATGTGATG-3，，13lbp)、CD90 (上 游5，-TGCCGCTATGAGAACAAGAC-3，，下游5，-CTCATCGCTGGTGGTGAAG-3，，186bp)弓丨物和 PCRmix (Takara公司)進行擴增反應(yīng)。反應(yīng)條件95°C 5min，溫度分別為95°C 30s, 60°C 30s, 72°C 30s, 72°C lOmin，循環(huán)數(shù)32個。RT-PCR檢測結(jié)果如圖2B所示，結(jié)果顯示分離細胞表達 CD73、CD29、CD106、CD105、CD90 基因。骨髓間充質(zhì)干細胞成集落(CFU-F)能力檢測取P3代細胞，按500、1000、1500、 2000,2500個細胞/cm2的密度將細胞接種于6孔板中，加入完全培養(yǎng)液，二氧化碳培養(yǎng)箱 37°C，90%濕度，5% CO2條件下培養(yǎng)，每3天換液一次，20天后可形成集落形態(tài)，即為CFU-F 集落。將細胞用4%多聚甲醛固定30min后，0. 結(jié)晶紫染色30min，計數(shù)。結(jié)果如圖3所 示，細胞接種密度分別為500、1000、1500、2000、2500個細胞/cm2，經(jīng)過20天培養(yǎng)，分別形成 1. 2,1. 8,3. 6,4. 5,6. O個克隆cm2，結(jié)果顯示，所分離骨髓間充質(zhì)干細胞具有增殖和自我更 新并形成克隆的能力。實施例2鴨骨髓間充質(zhì)干細胞分離培養(yǎng)(1)鴨骨髓間充質(zhì)干細胞的分離和原代培養(yǎng)取3日齡北京鴨股骨和肱骨，去兩端骨骺，用骨剪將骨剪開，取出骨髓放入5ml離 心管中，用手術(shù)剪剪碎至l_2mm3，加入500 μ 1胎牛血清，用移液器緩慢吹打使得骨髓碎塊懸 浮，移置到IOOmm培養(yǎng)皿中，用移液器整理使得骨髓碎塊在培養(yǎng)皿中均勻分布，將培養(yǎng)皿放 入二氧化碳培養(yǎng)箱，37 0C，90%濕度，5% CO2，傾斜45度角放置40分鐘后，將培養(yǎng)皿取出，吸 凈培養(yǎng)皿中的血清，緩慢加入完全培養(yǎng)液(低糖DMEM培養(yǎng)液，10%胎牛血清)，培養(yǎng)3天，得 到鴨骨髓間充質(zhì)干細胞原代細胞。(2)鴨骨髓間充質(zhì)干細胞的傳代培養(yǎng)取鴨骨髓間充質(zhì)干細胞原代細胞，倒掉其中培養(yǎng)液，PBS清洗2遍，加入0. 25%胰 蛋白酶消化，顯微鏡下觀察細胞由梭形逐漸變成圓形時，將胰蛋白酶倒掉，向培養(yǎng)皿中緩慢 加入:3ml DMEM吹打，使得培養(yǎng)皿中的骨髓間充質(zhì)干細胞懸浮，其它雜細胞則繼續(xù)留在培養(yǎng) 皿底部(差速消化法)，將DMEM懸液平均加入3個IOOmm培養(yǎng)皿中，再向每個培養(yǎng)皿中加 入7mlDMEM和Iml胎牛血清，培養(yǎng)3天，重復(fù)同樣方法傳代，可得到純化的鴨骨髓間充質(zhì)干 細胞。(3)骨髓間充質(zhì)細胞的鑒定骨髓間充質(zhì)干細胞表面抗原抗體鑒定取P4代細胞接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)M 小時，PBS清洗3遍，加入4 %多聚甲醛50 μ 1，4°C固定30分鐘，去除固定液，PBS清洗3遍， 加入抗體染液50 μ 1，避光4°C染色1小時。棄去染色，PBS清洗3遍，在倒置熒光顯微鏡下 觀察，⑶44、⑶45激發(fā)波長550nm?？贵w檢測結(jié)果顯示，⑶44呈陽性，⑶45呈陰性。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
權(quán)利要求
1.一種利用骨髓組織塊分離及培養(yǎng)禽類骨髓間充質(zhì)干細胞的方法，其特征在于，將禽 類骨髓碎塊懸浮于胎牛血清中，然后將該血清懸浮液移至培養(yǎng)皿中，傾斜放置一段時間，去 除血清后加入完全培養(yǎng)液貼壁培養(yǎng)，獲得原代培養(yǎng)細胞；經(jīng)胰蛋白酶消化后進行傳代，然后 以完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，傳代2-4次后獲得禽類骨髓間充質(zhì)干細胞，在體外培養(yǎng)體系中繼代擴 增培養(yǎng)；其中，所述完全培養(yǎng)液為含有10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述傾斜放置是培養(yǎng)皿與水平面呈30-60 度角。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，傾斜放置放置的時間為40-60分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，去除血清后加入完全培養(yǎng)液貼壁培養(yǎng)的 時間為3-6天。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，原代培養(yǎng)細胞經(jīng)胰蛋白酶消化后，以 1 2-3的比例傳代。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的方法，其特征在于，禽類骨髓來自于禽類的股骨和/ 或肱骨。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的方法，其特征在于，所述禽類骨髓碎塊為1 2mm3。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的方法，其特征在于，貼壁培養(yǎng)的密度為0.5 1骨髓 組織碎塊/cm2。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的方法，其特征在于，繼代擴增培養(yǎng)時細胞接種密度 為1 X IO5 1 X IO6個細胞/cm2。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用骨髓組織塊分離及培養(yǎng)禽類骨髓間充質(zhì)干細胞的方法。其是采用骨髓組織塊直接貼壁法獲得大量原代骨髓間充質(zhì)干細胞后，進行體外繼代培養(yǎng)，從而獲得純化的禽類骨髓間充質(zhì)干細胞。本方法與已有方法相比具有分離時間短，細胞獲得量大且純度較高，細胞體外增殖能力較強等優(yōu)點，可為禽類間充質(zhì)干細胞的研究應(yīng)用及組織工程提供豐富的材料來源。
文檔編號C12N5/0775GK102140440SQ20111010695
公開日2011年8月3日 申請日期2011年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月27日
發(fā)明者李想, 連正興, 韓紅兵 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)