專利名稱：酵母展示脂肪酶催化合成淀粉磷酸酯的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種酵母展示脂肪酶催化合成淀粉磷酸酯的方法。
背景技術(shù)：
淀粉磷酸酯是由原淀粉與磷酸鹽發(fā)生酯化而生成的一種淀粉衍生物，屬陰離子變性淀粉，具有透明度高、易糊化、膠粘性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、凝沉性弱的特點(diǎn)，特別是在食品工藝中，作為一種食品添加劑，淀粉磷酸酯是良好的乳化穩(wěn)定劑，清澈穩(wěn)定的增稠劑，具有良好的凍結(jié)融化穩(wěn)定性。目前，淀粉磷酸酯大都是由無機(jī)磷酸鹽(磷酸二氫鈉NaH2PO4、三聚磷酸鈉STP Na5P3Oltl、三偏磷酸鈉=STMP(NaPO3)3等)與淀粉漿在弱堿性條件下經(jīng)酯化反應(yīng)生成，存在的主要問題是產(chǎn)物含磷量(即取代度(DQ)不高，產(chǎn)物酯化反應(yīng)速不夠快、反應(yīng)時(shí)間過長，導(dǎo)致副反應(yīng)的發(fā)生以及產(chǎn)物水解，從而影響酯化反應(yīng)效率，并使淀粉磷酸酯成品中摻雜副反應(yīng)產(chǎn)物。相較于化學(xué)法合成淀粉磷酸酯，生物酶法可以在較短時(shí)間內(nèi)獲得高取代度的反應(yīng)產(chǎn)物。就相同反應(yīng)體系而言，生物酶法相比化學(xué)法顯著提升反應(yīng)效率和產(chǎn)率，均一度和穩(wěn)定度也有顯著提高。同時(shí)，采用生物酶法避免了化學(xué)法反應(yīng)條件苛刻(強(qiáng)酸、堿催化、高溫高壓)、無特異性、產(chǎn)物復(fù)雜、副產(chǎn)物多、分離難、安全性差等弊端。脂肪酶是目前酯化合成中使用最廣泛的酶，但是生產(chǎn)成本高、固定化過程繁雜費(fèi)時(shí)大大局限了其商業(yè)化應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種酵母展示脂肪酶催化合成淀粉磷酸酯的方法，該方法可提高淀粉磷酸酯合成的酯化反應(yīng)效率和產(chǎn)率，降低合成成本。一種酵母展示脂肪酶催化合成淀粉磷酸酯的方法，包括將谷物淀粉溶于水，吸漲后加入NaH2PO4和酵母展示脂肪酶，在55 65°C下攪拌反應(yīng)1 1. 5小時(shí)，分離、純化制得淀粉磷酸酯；以重量份計(jì)，反應(yīng)各原料配比可以如下水80 100份、谷物淀粉5 10份、 NaH2PO4I 1. 2份、酵母展示脂肪酶1 2份。優(yōu)選的，所述的分離、純化方法為將反應(yīng)液PH值調(diào)節(jié)至7. 0，經(jīng)乙醇將淀粉磷酸酯沉淀，洗滌，抽濾，真空干燥，得到粉末。優(yōu)選的，所述的攪拌速率為200 300轉(zhuǎn)/分鐘。所述的酵母展示脂肪酶通過如下方法制備將線性化處理的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母(Pichia paStoriS)GS115，將所得轉(zhuǎn)化子接種于BMMY培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)培養(yǎng)72 144小時(shí)后離心收集菌體，菌體經(jīng)沖洗、生物印跡和冷凍干燥制得酵母展示脂肪酶。所述的重組質(zhì)粒由原始載體PPIC9K和依次插入原始載體PPIC9K中MF α 1信號肽下游的脂肪酶基因和畢赤酵母GS115的細(xì)胞壁α凝集素基因組成。所述的脂肪酶基因可選用Genbank號為AF229435的序列，畢赤酵母(Pichia paStoriS)GS115為商業(yè)化產(chǎn)品，可從^witrogen公司購得。它的細(xì)胞壁α凝集素基因序列的 Genbank 號為]\C8164。載體PPIC9K為商業(yè)化產(chǎn)品(如hvitrogen公司)，它存在MF α 1信號肽序列(Genbank號Μ17301)，同時(shí)該載體內(nèi)信號肽序列上游存在AOXl啟動(dòng)子(Genbank號 Ζ46233)。重組質(zhì)粒線性化處理的目的是為了與胞內(nèi)基因組發(fā)生同源重組，提高表達(dá)穩(wěn)定性。優(yōu)選的，所述生物印跡所用配體為油酸，它可以誘導(dǎo)酶結(jié)構(gòu)改變，提高轉(zhuǎn)化率。本發(fā)明通過將脂肪酶基因和細(xì)胞壁α凝集素基因?qū)氘叧嘟湍讣?xì)胞GS115，畢赤酵母細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)后，脂肪酶表達(dá)并分泌到胞外，同時(shí)利用細(xì)胞壁α凝集素將該脂肪酶固定在細(xì)胞表面。利用該酵母展現(xiàn)脂肪酶對酯化反應(yīng)進(jìn)行催化，不僅提高了操作穩(wěn)定性、耐熱性以及重復(fù)性，反應(yīng)時(shí)間也大大縮短，從原來的12小時(shí)下降到1 2小時(shí)，另外該酵母展現(xiàn)脂肪酶生物催化劑生產(chǎn)成本低，催化合成轉(zhuǎn)化效率高。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1制備酵母展示脂肪酶通過人工合成的方法，合成米根霉(lihizopus oryzae)的脂肪酶基因(Genbank 號AF229435)和畢赤酵母GS115的細(xì)胞壁α凝集素基因(Genbank號為Μ28164)，同時(shí)在脂肪酶基因C端加上連接肽序列GSSGGSGGSGGSGGSGS (linker)，連接后得到核苷酸序列 pro-ROL-linker-α -agglutinin,同時(shí)在序列兩端添加EcoR I和Not I酶切位點(diǎn)，其中 pro-ROL為脂肪酶基因，α-agglutinin為細(xì)胞壁α凝集素基因。以上述人工合成序列為模板，利用下述引物對，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上游引物5，-AAGGAAAAAAGAATTCGTTCCAGTTTCTGG-3，；下游引物5，-TTTTCCTTTTGCGGCCGCTAATGAAACG-3，PCR反應(yīng)體系為模板DNA為1 μ 1，高保真DNA聚合酶0. 5 μ 1，dNTP (50mM) 0. 4 μ 1， 上下游引物各0. 5 μ 1，10XPCR緩沖液5 μ 1，加水至50 μ 1。PCR運(yùn)行條件為94°C 3分鐘，；35個(gè)循環(huán)(94°C 30秒，60°C 1分鐘，72°C 30秒)， 72 V 10分鐘。用EocR I和Not I同時(shí)酶切PCR產(chǎn)物和pPIC9K質(zhì)粒，并在T4連接酶的作用下過夜連接形成PPIC9K-R0L質(zhì)粒，通過電泳檢驗(yàn)并回收質(zhì)粒。為使目的基因與畢赤酵母GS115 發(fā)生His 4單位點(diǎn)置換重組，用Ml I對pPIC9K-R0L質(zhì)粒進(jìn)行酶切線性化處理。將酶切線性化處理好的目的基因約15 μ 1加入到事先準(zhǔn)備好的畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)杯中，冰浴15min，然后在1500V，400Q，25yF條件下電擊10ms，并加入約Iml預(yù)冷的山梨醇。將上述混勻的電轉(zhuǎn)產(chǎn)物約400μ 1涂于MD平板上，篩選陽性轉(zhuǎn)化子，然后將陽性轉(zhuǎn)化子涂于不同濃度的G418平板上，根據(jù)陽性轉(zhuǎn)化子對G418的抗性篩選出Mut表型的多拷貝陽性重組菌株。將多拷貝陽性重組菌株接種在BMGY培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)30h，離心收集細(xì)胞；再將細(xì)胞置于含有0.5% (體積百分比)甲醇的BMMY培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)144h，離心收集細(xì)胞，用水沖洗后，接種至YGC培養(yǎng)基中30°C培養(yǎng)120h，然后3000g離心分鐘收集菌體，蒸餾水洗滌后再用50mM pH7.0磷酸緩沖液洗滌，然后與2倍體積油酸混合，-80°C下預(yù)凍后再經(jīng)德國 Christ真空冷凍干燥機(jī)干燥Mh，用己烷洗滌除去油酸，再進(jìn)行再真空干燥去除己烷，即得到經(jīng)生物印跡處理的酵母展示脂肪酶。實(shí)施例2酵母展示脂肪酶催化合成淀粉磷酸酯實(shí)例1取350g谷物淀粉用水配制成35%淀粉乳(淀粉干基)、于65°C下吸水處理15min使淀粉乳吸水膨脹，冷卻后加入Ig上述制備的酵母展示脂肪酶，然后分批加入IOg NaH2PO4,置于85-1型磁力攪拌器中攪拌開始反應(yīng)，轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘，反應(yīng)溫度保持在 600C，反應(yīng)Ih后停止攪拌，調(diào)節(jié)pH值至7. 0，經(jīng)乙醇將淀粉磷酸酯沉淀，洗滌，抽濾，真空干燥，所得粉末即為成品。實(shí)例2取400g谷物淀粉用水配制成40%淀粉乳(淀粉干基)、于65°C下吸水處理15min使淀粉乳吸水膨脹，冷卻后加入2g上述制備的酵母展示脂肪酶，然后分批加入15g NaH2PO4,置于85-1型磁力攪拌器中攪拌開始反應(yīng)，轉(zhuǎn)速為250轉(zhuǎn)/分鐘，反應(yīng)溫度保持在 62°C，反應(yīng)1. 后停止攪拌，調(diào)節(jié)pH值至7.0，經(jīng)乙醇將淀粉磷酸酯沉淀，洗滌，抽濾，真空干燥，所得粉末即為成品。實(shí)施例3采用傳統(tǒng)化學(xué)法合成淀粉磷酸酯取350g谷物淀粉用水配制成35%淀粉乳(淀粉干基)、于65°C下吸水處理15min 使淀粉乳吸水膨脹，然后分批加入log NaH2PO4，置于85-1型磁力攪拌器中攪拌開始反應(yīng)， 轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘，反應(yīng)溫度保持在60°C，反應(yīng)Ih后停止攪拌，調(diào)節(jié)pH值至7. 0，經(jīng)乙醇將淀粉磷酸酯沉淀，洗滌，抽濾，真空干燥，所得粉末即為成品。實(shí)施例4測定取代度和含磷量用水洗滌低取代度的淀粉磷酸醋和游離磷(以無機(jī)鹽存在)后用硫酸/硝酸混合酸處理，使結(jié)合磷游離出來，加入鉬酸按和抗壞血酸，使之形成磷鉬藍(lán)，在波長為825nm上用分光光度計(jì)測定吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線查出結(jié)合磷含量即可計(jì)算出取代度(DS)。結(jié)合磷(%) = (Hi1VcZmciV1) X 100%DS =磷的物質(zhì)的量/葡萄糖殘基的物質(zhì)的量=[結(jié)合磷(％) Χ162/30·974]/[(100-水分(％ ))_(結(jié)合磷-K)]式中，162為淀粉分子中每個(gè)葡萄糖殘基相對分子質(zhì)量；30. 974為磷的相對原子質(zhì)量；K為生成磷酸醋淀粉比原淀粉的增量系數(shù)，以磷酸醋淀粉一鈉鹽計(jì)，則換算系數(shù)為 3. 8734 ；叫為樣品的質(zhì)量(mg)叫為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得得樣品液的含量(mg) Λ為樣品液的定量體積(IOOmL) 乂為用于測定的樣品液的等分體積(25mL)。取代反應(yīng)效率=實(shí)際取代度/理論取代度X 100%根據(jù)上述方法對制得的淀粉磷酸酯樣品進(jìn)行檢測，實(shí)施例2中，實(shí)例1產(chǎn)品的取代度和反應(yīng)效率分別為0. 043和89%，實(shí)例2產(chǎn)品的取代度和反應(yīng)效率分別為0. 041和83%。 實(shí)施例3利用傳統(tǒng)方法合成淀粉磷酸酯的取代度和反應(yīng)效率僅為0. 032和75%。
權(quán)利要求
1.一種酵母展示脂肪酶催化合成淀粉磷酸酯的方法，包括將谷物淀粉溶于水，吸漲后加入NaH2PO4和酵母展示脂肪酶，在55 65°C下攪拌反應(yīng) 1 1. 5小時(shí)，分離、純化制得淀粉磷酸酯； 所述的酵母展示脂肪酶通過如下方法制備將經(jīng)線性化處理的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母(Pichia paSt0riS)GS115，將所得轉(zhuǎn)化子接種于BMMY培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)培養(yǎng)72 144小時(shí)后離心收集菌體，菌體經(jīng)沖洗、生物印跡和冷凍干燥制得酵母展示脂肪酶；所述的重組質(zhì)粒由原始載體PPIC9K和依次插入原始載體pPIC9K中MFa 1信號肽下游的脂肪酶基因和畢赤酵母GS115的細(xì)胞壁α凝集素基因組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于以重量份計(jì)，水80 100份、谷物淀粉 5 10份、NaH2PO4I 1. 2份、酵母展示脂肪酶1 2份。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的攪拌速率為200 300轉(zhuǎn)/分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述生物印跡中所采用的配體為油酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種酵母展示脂肪酶催化合成淀粉磷酸酯的方法，包括將谷物淀粉溶于水，吸漲后加入NaH2PO4和酵母展示脂肪酶，在55～65℃下攪拌反應(yīng)1～1.5小時(shí)，分離、純化制得淀粉磷酸酯。所述的酵母展示脂肪酶制備方法為將線性化處理的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115，將所得轉(zhuǎn)化子接種于BMMY培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)培養(yǎng)72～144小時(shí)后離心收集菌體，菌體經(jīng)沖洗、生物印跡和冷凍干燥制得酵母展示脂肪酶。本發(fā)明通過將脂肪酶展現(xiàn)在細(xì)胞外，利用該酶制劑催化合成淀粉磷酸酯，不僅提高了轉(zhuǎn)化效率，而且縮短了反應(yīng)時(shí)間，降低了生產(chǎn)成本。
文檔編號C12R1/84GK102212585SQ20111010881
公開日2011年10月12日 申請日期2011年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月28日
發(fā)明者何國慶, 古再麗努爾, 周陳偉, 徐娟, 林吉恒, 王睿之, 阮暉 申請人:浙江大學(xué)