專利名稱：一種石斑魚虹彩病毒保護(hù)性抗原的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于疫苗生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地講涉及一種石斑魚虹彩病毒保護(hù)性抗原的篩選方法。
背景技術(shù)：
石斑魚肉質(zhì)鮮美蛋白含量高，是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高的食用魚類，也是我國(guó)創(chuàng)匯的優(yōu)良魚類品種。但近年來(lái)隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大和養(yǎng)殖環(huán)境的日益惡化，各種病害特別是病毒性疾病頻繁爆發(fā)，造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。虹彩病毒是石斑魚的重要致病病原。它可以造成魚類的死亡率從30%(成魚中)到100%(幼苗階段)。這種病毒在亞洲，特別是在22°C以上的高水溫時(shí)，極易感染中國(guó)、日本和東南亞等國(guó)養(yǎng)殖的海水名貴魚類，如石斑魚、尖吻鱸、 真鯛、牙鲆和大黃魚等，致使魚類大面積的死亡，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，因而被稱之為“海洋口蹄疫”。石斑魚虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus, SGIV)是從養(yǎng)殖的石斑魚中分離到的一株新的虹彩病毒，可導(dǎo)致石斑魚死亡率達(dá)90%以上，給石斑魚的養(yǎng)殖帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，如何預(yù)防和治療虹彩病毒病已成為當(dāng)今世界上石斑魚養(yǎng)殖業(yè)急需解決的重要問題。目前，針對(duì)各種魚類病毒性疾病，大都沒有可根治的特效藥物，只能通過提高魚類機(jī)體自身免疫能力，及時(shí)發(fā)現(xiàn)病害并采取相應(yīng)措施防止擴(kuò)散等防治辦法來(lái)降低病毒感染魚體的機(jī)會(huì)。同時(shí)傳統(tǒng)抗生素和化學(xué)合成藥物的濫用，帶來(lái)了藥物殘留、誘變產(chǎn)生抗藥菌株及導(dǎo)致水體污染等嚴(yán)重問題。而疫苗作為控制病原最有力的手段，是治療疾病、特別是病毒病的最好選擇。水產(chǎn)病害疫苗研究在最近幾十年來(lái)得到了長(zhǎng)足的發(fā)展。然而有關(guān)虹彩病毒的疫苗，特別是基因工程疫苗的研制報(bào)道很少。Caipang等構(gòu)建了真鯛虹彩病毒的2個(gè)抗原性基因的DNA疫苗，并用它們對(duì)真鯛幼魚進(jìn)行免疫實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示該疫苗誘導(dǎo)了機(jī)體的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生了較好的保護(hù)效果。Tamaru等利用釀酒酵母成功表達(dá)了真鯛虹彩病毒的主要衣殼蛋白，非常適合用于制備口服疫苗。Kim等構(gòu)建了條石鯛虹彩病毒主要衣殼蛋白的重組蛋白疫苗，免疫條石鯛，對(duì)照組死亡率90%，而免疫組僅為5-15%。國(guó)內(nèi)的研究者何建國(guó)等構(gòu)建了 ISKNV的2個(gè)基因工程疫苗，中試試驗(yàn)表明這2個(gè)基因工程疫苗聯(lián)合免疫鱖魚，在對(duì)照組死亡率100%的情況下，免疫組鱖魚成活率達(dá)到70%，說(shuō)明基因工程疫苗用于免疫保護(hù)鱖魚的可行性較高。另外孫修勤等用不同的物質(zhì)包裹牙鲆淋巴囊腫病毒的DNA疫苗，在口服DNA 疫苗方面做出了很好的嘗試。然而，到目前為止，還沒有見到石斑魚虹彩病毒基因工程疫苗的報(bào)道。而且針對(duì)虹彩病毒疫苗的研究，多數(shù)研究者僅局限于少數(shù)幾個(gè)保護(hù)性抗原，對(duì)虹彩病毒的保護(hù)性抗原缺乏一個(gè)比較全面的了解。隨著基因工程疫苗的研制在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中得到了越來(lái)越多的重視，靶抗原的鑒定顯得越發(fā)重要。為此，采用反向疫苗學(xué)的分析方法結(jié)合 DNA疫苗技術(shù)，篩選出能提供保護(hù)作用的病毒編碼基因，為研制新型的石斑魚虹彩病毒疫苗奠定基礎(chǔ)
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種石斑魚虹彩病毒保護(hù)性抗原基因。本發(fā)明的另一目的是提出一種石斑魚虹彩病毒保護(hù)性抗原的篩選方法，具體為來(lái)自石斑魚虹彩病毒的具有疫苗開發(fā)前景的保護(hù)性抗原基因的鑒定。本發(fā)明同時(shí)提供了一種石斑魚虹彩病毒保護(hù)性DNA疫苗。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)施
一種石斑魚虹彩病毒保護(hù)性抗原基因，其特征在于基因的核苷酸序列如SEQ ID =Nol 或2或3所示。一種如權(quán)利要求1所述抗原基因的篩選方法，其特征在于包括以下步驟①在石斑魚虹彩病毒編碼基因中排除假的開放閱讀框及定位于胞質(zhì)和胞核中的蛋白和小于140 個(gè)氨基酸的蛋白后，通過同源性分析、蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域分析及信號(hào)肽與跨膜區(qū)分析，篩選跨膜蛋白和分泌蛋白，得到疫苗候選基因；②篩選出的疫苗候選基因PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)，構(gòu)建各個(gè)基因的DNA疫苗；③使用DNA疫苗免疫石斑魚幼魚，篩選出能產(chǎn)生明顯免疫保護(hù)作用的抗原。石斑魚虹彩病毒保護(hù)性DNA疫苗，由以下方法獲得以SEQ ID :Nol或2或3為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pcDNA 3. 1載體獲得重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染大腸桿菌DH5 α后， 培養(yǎng)12 16小時(shí)，提取質(zhì)粒DNA獲得所述的DNA疫苗。石斑魚虹彩病毒保護(hù)性DNA疫苗的應(yīng)用方法，將DNA疫苗進(jìn)行肌肉注射注入石斑魚體內(nèi)。石斑魚虹彩病毒保護(hù)性DNA疫苗的應(yīng)用方法，每次注射DNA疫苗50-100 μ L，所含質(zhì)粒 DNA 為 30-50 μ g。本發(fā)明提供了從SGIV 162個(gè)病毒編碼基因中篩選出來(lái)的3個(gè)保護(hù)性抗原基因，并提供了分析和篩選病毒編碼基因中潛在的疫苗候選抗原的方法，有益于進(jìn)一步開發(fā)出新型的石斑魚虹彩病毒疫苗，有效地預(yù)防和控制石斑魚虹彩病毒病，提高養(yǎng)殖石斑魚的存活率和養(yǎng)殖效率。此3個(gè)能提供明顯保護(hù)作用的石斑魚虹彩病毒編碼基因，病毒基因組序列的 GenBank Accession Number 為 NC_006549，3 個(gè)基因分別是病毒編碼基因0RF036、0RF039 及 0RF072。本發(fā)明綜合運(yùn)用基因組序列分析、生物信息學(xué)和疫苗學(xué)研究方法，提供了篩選石斑魚虹彩病毒保護(hù)性抗原基因的方法，包括以下步驟
1、跨膜蛋白和分泌蛋白是疫苗抗原的首選蛋白。首先通過查閱文獻(xiàn)，排除了一些假的開放閱讀框及定位于胞質(zhì)和胞核中的蛋白和小于140個(gè)氨基酸的蛋白，然后通過同源性分析、蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域分析及信號(hào)肽與跨膜區(qū)分析等一系列生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，篩選出疫苗候選基因。2、上述篩選出的疫苗候選基因PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)，分別與真核表達(dá)載體pcDNA 3. 1連接，構(gòu)建各個(gè)基因的DNA疫苗。3、上述DNA疫苗免疫石斑魚幼魚，取注射部位的肌肉組織RT-PCR驗(yàn)證各個(gè)DNA疫苗的體內(nèi)轉(zhuǎn)錄；同時(shí)免疫后攻毒，統(tǒng)計(jì)死亡率，評(píng)價(jià)各DNA疫苗提供的免疫保護(hù)效果，篩選出能產(chǎn)生明顯免疫保護(hù)作用的抗原。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是
本發(fā)明為今后利用上述保護(hù)性抗原進(jìn)行合成肽疫苗、蛋白疫苗及其它基因工程疫苗的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)，以為基于反向疫苗學(xué)的分析方法篩選保護(hù)性抗原基因帶來(lái)了新的思路。本發(fā)明提供的保護(hù)性抗原的篩選方法相對(duì)于傳統(tǒng)疫苗學(xué)方法，它減少了鑒定疫苗抗原所需的時(shí)間和花費(fèi)，并能提供新的解決方案。


圖1為全基因組水平篩選疫苗候選抗原工作流程； 圖2為13個(gè)病毒編碼基因的PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果；
圖3為DNA疫苗免疫后第3天，各DNA疫苗在石斑魚注射部位肌肉組織中轉(zhuǎn)錄的RT-PCR 檢測(cè)；
圖4為免疫后攻毒各組的累積死亡率。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述。材料
實(shí)驗(yàn)所用病毒為石斑魚虹彩病毒(SGIV，A3/12/98 PPD)。選用細(xì)胞系為石斑魚胚胎細(xì)胞系，細(xì)胞在含8-10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。斜帶石斑魚購(gòu)自廣東省大亞灣水產(chǎn)試驗(yàn)中心。質(zhì)粒提取試劑盒PureLink HiPure Plasmid DNA Purification Kits, Life Technologies 公司產(chǎn)品。質(zhì)粒載體pcDNA 3. 1 =Life Technologies公司，用于構(gòu)建DNA疫苗。方法
2. 1全基因組水平篩選疫苗候選抗原
石斑魚虹彩病毒SGIV全基因組序列的測(cè)定和注釋已在2004年完成。隨后，相繼完成了 SGIV蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組的工作。2007年，Kon等重新注釋了已全基因組測(cè)序的虹彩病毒。我們根據(jù)這些已經(jīng)發(fā)表的文獻(xiàn)資料，首先排除了一些假的開放閱讀框(open reading frame, ORF)?？缒さ鞍缀头置诘鞍资且呙缈乖氖走x蛋白，我們采用下列方法對(duì)SGIV疫苗候選抗原進(jìn)行預(yù)測(cè)和篩選。首先結(jié)合測(cè)序時(shí)的注釋結(jié)果和后續(xù)的相關(guān)研究報(bào)道，排除定位于胞質(zhì)和胞核中的蛋白和小于140個(gè)氨基酸的蛋白。經(jīng)過此步排除，對(duì)余下的開放閱讀框進(jìn)行同源性分析(BLASTX，BLASTP, BLASTN和TBLASTX等)和蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域分析 (Conserved Domain Database, CDD)，排除于真核生物同源的基因和核質(zhì)定位的基因。接著剩下的所有開放閱讀框用SignalP進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，TMHMM Server v. 2.0 (http:// www. cbs. dtu. dk/services/TMHMM)禾口 DAS-TMfilter server (http://mendel. imp. ac. at/ sat/DAS/DAS. html)進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測(cè)，上述3個(gè)預(yù)測(cè)方法任何一個(gè)預(yù)測(cè)為陽(yáng)性的進(jìn)入下一輪的分析。在多個(gè)二級(jí)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索，多序列比對(duì)尋找保守的序列模式(Pattern)、基序 (Motif)、序型(Profile)以及蛋白質(zhì)指紋(Fingerprints)等，包括 SWISS_PR0T、PR0SITE、 PRINT-S、ProDon、Blocks、M0TIFS、Pfam、SMART 和 BLOCKS + 等。因?yàn)楸Ｊ氐男蛄衅慰梢泽w現(xiàn)其所在序列的結(jié)構(gòu)特征或功能特征，所以能夠被用來(lái)構(gòu)造標(biāo)識(shí)基因家族或功能的“特征信號(hào)”，從而識(shí)別新的序列。根據(jù)這些預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)一步排除非跨膜蛋白和分泌蛋白，選擇到疫苗候選抗原。一個(gè)簡(jiǎn)要的工作流程如圖1。2. 2病毒基因組DNA的提取與DNA疫苗載體的構(gòu)建
石斑魚胚胎細(xì)胞傳代至25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中于25-28°C培養(yǎng)。次日待細(xì)胞鋪滿單層后， 每瓶細(xì)胞接種1.0 MOI (multiplicity of infection，感染復(fù)數(shù))的病毒。待60-80%的細(xì)胞出現(xiàn)病變后，500Xg離心5min收集細(xì)胞。用TE (pH7. 4)重懸沉淀，加入蛋白酶K至終濃度為150yg/mL，加10% SDS至終濃度1%，37°C水浴消化池。消化后，依次用等體積苯酚氯仿異戊醇(25 24 1)和氯仿異戊醇(24 1)抽提。上清用2. 5倍體積冰冷無(wú)水乙醇-20°C沉淀30min。12000Xg 4°C離心20min，沉淀用預(yù)冷的70%乙醇漂洗2次。 7000 Xg 4°C離心5min，棄去乙醇，空氣中干燥DNA，最后用滅菌水溶解DNA。根據(jù)載體多克隆位點(diǎn)處的限制性酶切圖譜和目標(biāo)序列的限制性酶切圖譜設(shè)計(jì)引物，在每對(duì)引物的上游引物中均加入Kozak序列。引物在上海英駿生物技術(shù)有限公司合成， 序列見表1。以提取的病毒基因組DNA為模板分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pcDNA 3. 1 載體，從而獲得重組質(zhì)粒。將菌落PCR陽(yáng)性克隆送公司進(jìn)行DNA測(cè)序確證。2. 3去內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA的提取
在去內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA提取相關(guān)的實(shí)驗(yàn)過程中，所有的玻璃器皿，如量筒、燒杯及稱量用的勺子均在180°C烘烤8h，以破壞內(nèi)毒素。劃線接種各重組質(zhì)粒及pcDNA 3.空載體(均保存于大腸桿菌DH5 α中)，次日挑單克隆于2 5mL LB/Amp液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)管中，37°C 300rpm搖床培養(yǎng)他左右。菌落PCR 鑒定為陽(yáng)性后1/500 1/1000接種于含IOOmL LB/Amp液體培養(yǎng)基的500mL錐形瓶中，37°C 300rpm 搖床培養(yǎng) 12h 16h 左右。用試劑盒 PureLink HiPure Plasmid DNA Purification Kits提取內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA，具體操作步驟見試劑盒說(shuō)明書。2. 4 DNA疫苗的體外轉(zhuǎn)錄
實(shí)驗(yàn)前2周選取同一批次的健康養(yǎng)殖斜帶石斑魚，體重12g左右，購(gòu)自廣東省大亞灣水產(chǎn)試驗(yàn)中心。運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后，養(yǎng)殖于充氧過濾的人工海水中，水溫25士0.5°C。實(shí)驗(yàn)時(shí)每尾石斑魚肌肉注射50-100 μ L相應(yīng)的質(zhì)粒(含30 μ g質(zhì)粒DNA)。免疫3天后取注射部位肌肉 (每組取3尾)，液氮研磨后TRIzol Reagents提取組織的總RNA。在RNA相關(guān)的實(shí)驗(yàn)過程中，所有離心管、槍頭及水均用DEPC水浸泡處理過并經(jīng)高壓滅菌。RNA提取方法簡(jiǎn)述如下
1)加Trizol的懸液15-30°C靜置5min，徹底裂解樣品；
2)加0.2 mL氯仿，劇烈混勻15 s，15-30°C靜置2-3 min ；
3)2-8°C不超過 12 000 g 離心 15 min ；
4)小心取出上層水相到另一干凈的Eppendorf管中，加等體積的異丙醇混勻，15-30°C 靜置10 min ；
5)2-8°C不超過 12 000 g 離心 10 min ；
6)1mL 75%預(yù)冷的乙醇清洗兩次，2-8°C不超過7 500 g離心5 min ；
7)空氣中干燥約10min，注意不要使沉淀過分干燥；
8)加30-50μ L DEPC處理水，_80°C保存?zhèn)溆谩?br> RNA提取后反轉(zhuǎn)。PCR擴(kuò)增用特異擴(kuò)增相應(yīng)基因部分序列的引物。PCR時(shí)各檢測(cè)基因所用的退火溫度為=ORFlOl為57V，其余各基因均為60°C。PCR結(jié)束后1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。引物在上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，序列見表2。2. 5 DNA疫苗免疫石斑魚和病毒感染評(píng)價(jià)免疫保護(hù)率
石斑魚購(gòu)回后實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)2周后進(jìn)行免疫。整個(gè)DNA疫苗的免疫分2次。初次免疫肌肉注射50-100 μ L相應(yīng)的質(zhì)粒(含30 μ g質(zhì)粒DNA)，14天后加強(qiáng)免疫一次(50-100 μ L相應(yīng)的質(zhì)粒，含20 μ g質(zhì)粒DNA)。實(shí)驗(yàn)共分15個(gè)組13個(gè)實(shí)驗(yàn)組和2個(gè)對(duì)照組(注射磷酸緩沖鹽溶液對(duì)照組和注射PcDNA 3. 1質(zhì)粒對(duì)照組)，每組免疫10尾。加強(qiáng)免疫21天后腹腔注射接種病毒，每日統(tǒng)計(jì)死亡魚數(shù)，統(tǒng)計(jì)15天，分析各組的累積死亡率及相對(duì)保護(hù)率。結(jié)果
3. 1生物信息學(xué)分析結(jié)果
SGIV基因組預(yù)測(cè)的開放閱讀框162個(gè)，經(jīng)過Kon等的重新注釋后，一共有139個(gè)開放閱讀框用作下一步的分析。根據(jù)上述候選抗原的挑選原則，共挑選出13個(gè)基因作為下一步疫苗研究的靴標(biāo)。分別是0RF016、ORFO19, 0RF026、0RF036、0RF038、0RF039、0RF059、 0RF072、0RF083、0RF087、0RF088、0RF090 和 0RF101。3. 2 DNA疫苗載體的構(gòu)建
13個(gè)目的基因經(jīng)PCR擴(kuò)增，用1%的瓊脂糖凝膠做電泳作分析，結(jié)果如圖2，得到的片段大小與預(yù)測(cè)結(jié)果符合，證明目的條帶擴(kuò)增成功。將PCR產(chǎn)物純化后用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切，與經(jīng)同一對(duì)內(nèi)切酶酶切后的 pcDNA 3. 1質(zhì)粒按摩爾比1 :3-10 16°C連接過夜，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5 α，挑單克隆菌落 PCR鑒定后送測(cè)。通過BLAST搜索NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)果顯示測(cè)序結(jié)果序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的目標(biāo)序列完全匹配，證明重組載體構(gòu)建成功，構(gòu)建成功的重組載體命名策略為 pcDNA-加上相應(yīng)的ORF編號(hào)，如基因0RF016的重組質(zhì)粒命名為pcDNA_016。3. 3 DNA疫苗的體內(nèi)轉(zhuǎn)錄
注射DNA疫苗后第3天，取注射部位的肌肉組織，Trizol提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后用特異性引物PCR檢測(cè)各DNA疫苗的體外轉(zhuǎn)錄。結(jié)果顯示，在13個(gè)DNA疫苗接種的石斑魚肌肉組織中均檢測(cè)到了特異性條帶，說(shuō)明重組質(zhì)粒在石斑魚中得到了轉(zhuǎn)錄(圖3)。實(shí)驗(yàn)中以注射 pcDNA 3. 1質(zhì)粒組為對(duì)照，均沒有檢測(cè)到陽(yáng)性片段。3. 4 DNA疫苗免疫效果
不同DNA疫苗免疫第14天加強(qiáng)免疫一次，加強(qiáng)免疫21天后每尾石斑魚腹腔注射病毒， 每天統(tǒng)計(jì)死亡率。觀察統(tǒng)計(jì)表明，死亡主要發(fā)生在第3-12天，以后趨于穩(wěn)定，每組死亡魚數(shù)的20-30%取肝、脾和腎組織混合后提取DNA，PCR檢測(cè)MCP基因，確定是由病毒導(dǎo)致魚的死亡。各組的累積死亡率見圖4。以注射pcDNA3. 1組為對(duì)照組，根據(jù)統(tǒng)計(jì)出來(lái)的各組的死亡率，依下列公式計(jì)算相對(duì)保護(hù)率(Relative percentage survival, RPS)
相對(duì)保護(hù)率(RPQ = [1-(免疫組死亡率/對(duì)照組死亡率)]X 100% 應(yīng)用SPSS 10. 0進(jìn)行χ 2檢驗(yàn)。計(jì)算出來(lái)的結(jié)果見表3。質(zhì)粒pcDNA-072、pcDNA-036和 pcDNA-039免疫組的相對(duì)保護(hù)率分別為66. 67%、50%和66. 67%，與空質(zhì)粒pcDNA3. 1注射組相比差異顯著(P<0. 001)。此外，質(zhì)粒pcDNA-083和質(zhì)粒pcDNA-088免疫組與空質(zhì)粒注射組在統(tǒng)計(jì)學(xué)上其差異也具有顯著性。pcDNA-036的核苷酸序列如SEQ ID Nol所示；pcDNA-039 的核苷酸序列如SEQ ID No2所示；質(zhì)粒pcDNA-072的核苷酸序列如SEQ ID No3所示。
表1 SGIV DNA疫苗構(gòu)建用引物
權(quán)利要求
1.一種石斑魚虹彩病毒保護(hù)性抗原基因，其特征在于基因的核苷酸序列如SEQ ID Nol或2或3所示。
2.一種如權(quán)利要求1所述抗原基因的篩選方法，其特征在于包括以下步驟①在石斑魚虹彩病毒編碼基因中排除假的開放閱讀框及定位于胞質(zhì)和胞核中的蛋白和小于140個(gè)氨基酸的蛋白后，通過同源性分析、蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域分析及信號(hào)肽與跨膜區(qū)分析，篩選跨膜蛋白和分泌蛋白，得到疫苗候選基因；②將篩選出的疫苗候選基因PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)，構(gòu)建各個(gè)基因的DNA疫苗；③使用DNA疫苗免疫石斑魚幼魚，篩選出能產(chǎn)生明顯免疫保護(hù)作用的抗原。
3.—種如權(quán)利要求1所述的石斑魚虹彩病毒保護(hù)性DNA疫苗，其特征在于由以下方法獲得以SEQ ID :Nol或2或3為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pcDNA 3. 1載體獲得重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染大腸桿菌DH5 α后，培養(yǎng)12 16小時(shí)，提取質(zhì)粒DNA獲得所述的DNA疫苗。
4.如權(quán)利要求3所述的DNA疫苗的應(yīng)用方法，其特征在于將DNA疫苗進(jìn)行肌肉注射注入石斑魚體內(nèi)。
5.如權(quán)利要求4所述的DNA疫苗的應(yīng)用方法，其特征在于所述的每次注射DNA疫苗 50-100 μ L,所含質(zhì)粒 DNA 為 30-50 μ g。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種石斑魚虹彩病毒(SGIV)保護(hù)性抗原的篩選方法，具體為來(lái)自石斑魚虹彩病毒的具有疫苗開發(fā)前景的保護(hù)性抗原基因的鑒定，包括生物信息學(xué)分析、DNA疫苗的制備和免疫后攻毒篩選出保護(hù)性抗原。本發(fā)明提供了從SGIV162個(gè)病毒編碼基因中篩選出來(lái)的3個(gè)保護(hù)性抗原基因，并提供了分析和篩選病毒編碼基因中潛在的疫苗候選抗原的方法，有益于進(jìn)一步開發(fā)出新型的石斑魚虹彩病毒疫苗，有效地預(yù)防和控制石斑魚虹彩病毒病，提高養(yǎng)殖石斑魚的存活率和養(yǎng)殖效率。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102277361SQ201110110400
公開日2011年12月14日 申請(qǐng)日期2011年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月29日
發(fā)明者歐陽(yáng)征亮, 汪沛然, 秦啟偉, 黃曉紅 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所