專利名稱：酵母展示脂肪酶催化合成維生素a棕櫚酸酯的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種酵母展示脂肪酶催化合成維生素A 棕櫚酸酯的方法。
背景技術(shù)：
維生素A(視黃醇)是一種天然的脂溶性維生素，具有維持正常視覺反應(yīng)、骨骼發(fā)育、上皮組織功能，維護(hù)皮膚細(xì)胞功能、促進(jìn)生長發(fā)育及清除自由基、提高免疫能力等功效， 因此維生素A已經(jīng)廣泛應(yīng)用于化妝品、保健食品等行業(yè)。維生素A系列中最常用的是維生素A和維生素A醋酸酯，但它們在光、空氣、氧化劑和高溫的條件下極易被氧化，現(xiàn)在已經(jīng)有大量的研究集中于發(fā)展合成性質(zhì)穩(wěn)定的維生素A衍生物，尤其是維生素A棕櫚酸酯。目前市場上維生素A棕櫚酸酯(retinyl palmitate)是用化學(xué)合成制得，然而化學(xué)法合成不僅存在化學(xué)催化劑帶來的有毒物質(zhì)，而且高溫、高壓條件下很容易發(fā)生副反應(yīng)，產(chǎn)生有毒副作用的產(chǎn)物，同時還有能耗高、對設(shè)備和儀器要求高、對環(huán)境污染嚴(yán)重等問題，酶法合成可以避免這些問題。目前國內(nèi)外已有很多利用脂肪酶合成維生素A棕櫚酸酯的報道，但是由于脂肪酶(游離酶或固定化)制作復(fù)雜、生產(chǎn)成本高而限制了這一生物催化過程的商業(yè)化、規(guī)?；瘧?yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種酵母展示脂肪酶催化合成維生素A棕櫚酸酯的方法，可顯著降低維生素A棕櫚酸酯生產(chǎn)成本，同時達(dá)到較高的酯化反應(yīng)效率和產(chǎn)率。一種酵母展示脂肪酶催化合成維生素A棕櫚酸酯的方法，包括將維生素A醋酸酯和棕櫚酸溶于有機(jī)溶劑中，加入酵母展示脂肪酶，無氧條件下于50 60°C反應(yīng)10 14小時，分離、純化制得維生素A棕櫚酸酯。優(yōu)選的，所述的有機(jī)溶劑為正己烷。優(yōu)選的，每升有機(jī)溶劑中維生素A醋酸酯、棕櫚酸和酵母展示脂肪酶的加入量分別為 20 IOOg,50 150g、50 IOOgo攪拌速率為200 250轉(zhuǎn)/分鐘。所述的分離、純化為將反應(yīng)液離心，取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，水洗后溶于正己烷，重結(jié)晶。所述的酵母展示脂肪酶通過如下方法制備將經(jīng)線性化處理的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母(Pichia paStoriS)GS115，將所得轉(zhuǎn)化子接種于BMMY培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)培養(yǎng)72 144小時后離心收集菌體，菌體經(jīng)沖洗、生物印跡和冷凍干燥制得酵母展示脂肪酶；所述的重組質(zhì)粒由原始載體PPIC9K和依次插入原始載體PPIC9K中MF α 1信號肽下游的脂肪酶基因和畢赤酵母GS115的細(xì)胞壁α凝集素基因組成。所述的脂肪酶基因可選用Genbank號為AF229435的序列，畢赤酵母(PichiapaStoriS)GS115為商業(yè)化產(chǎn)品，可從^witrogen公司購得。它的細(xì)胞壁α凝集素基因序列的 Genbank 號為]\C8164。載體pPIC9K為商業(yè)化產(chǎn)品(如hvitrogen公司)，它存在MF α 1信號肽序列(Genbank號Μ17301)，同時該載體內(nèi)信號肽序列上游存在AOXl啟動子(Genbank號 Ζ46233)。重組質(zhì)粒線性化處理的目的是為了與胞內(nèi)基因組發(fā)生同源重組，提高表達(dá)穩(wěn)定性。優(yōu)選的，所述生物印跡所用配體為油酸，它可以誘導(dǎo)酶結(jié)構(gòu)改變，提高轉(zhuǎn)化率。本發(fā)明通過將脂肪酶基因和細(xì)胞壁α凝集素基因?qū)氘叧嘟湍讣?xì)胞GS115，畢赤酵母細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)后，脂肪酶表達(dá)并分泌到胞外，同時利用細(xì)胞壁α凝集素將該脂肪酶固定在細(xì)胞表面。利用該酵母展示脂肪酶對酯化反應(yīng)進(jìn)行催化，可有效提高操作穩(wěn)定性、耐熱性以及重復(fù)性，由于酶反應(yīng)的特異性該酶能大幅度抑制副反應(yīng)的發(fā)生，終轉(zhuǎn)化率(以維生素A計(jì))在90%以上。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1制備酵母展示脂肪酶通過人工合成的方法，合成米根霉(lihizopus oryzae)的脂肪酶基因(Genbank 號AF229435)和畢赤酵母GS115的細(xì)胞壁α凝集素基因(Genbank號為Μ28164)，同時在脂肪酶基因C端加上連接肽序列GSSGGSGGSGGSGGSGS (linker)，連接后得到核苷酸序列 pro-ROL-linker-α -agglutinin,同時在序列兩端添加EcoR I和Not I酶切位點(diǎn)，其中 pro-ROL為脂肪酶基因，α-agglutinin為細(xì)胞壁α凝集素基因。以上述人工合成序列為模板，利用下述引物對，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上游引物5，-AAGGAAAAAAGAATTCGTTCCAGTTTCTGG-3，；下游引物5，-TTTTCCTTTTGCGGCCGCTAATGAAACG-3，PCR反應(yīng)體系為模板DNA為1 μ 1，高保真DNA聚合酶0. 5 μ 1，dNTP (50mM) 0. 4 μ 1， 上下游引物各0. 5 μ 1，10XPCR緩沖液5 μ 1，加水至50 μ 1。PCR運(yùn)行條件為94°C 3分鐘，；35個循環(huán)(94°C 30秒，60°C 1分鐘，72°C 30秒)， 72 V 10分鐘。用EocR I和Not I同時酶切PCR產(chǎn)物和pPIC9K質(zhì)粒，并在T4連接酶的作用下過夜連接形成PPIC9K-R0L質(zhì)粒，通過電泳檢驗(yàn)并回收質(zhì)粒。為使目的基因與畢赤酵母GS115 發(fā)生His 4單位點(diǎn)置換重組，用Ml I對pPIC9K-R0L質(zhì)粒進(jìn)行酶切線性化處理。將酶切線性化處理好的目的基因約15 μ 1加入到事先準(zhǔn)備好的畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)杯中，冰浴15min，然后在1500V，400 Ω，25uF條件下電擊10ms，并加入約Iml預(yù)冷的山梨醇。將上述混勻的電轉(zhuǎn)產(chǎn)物約400μ 1涂于MD平板上，篩選陽性轉(zhuǎn)化子，然后將陽性轉(zhuǎn)化子涂于不同濃度的G418平板上，根據(jù)陽性轉(zhuǎn)化子對G418的抗性篩選出Mut表型的多拷貝陽性重組菌株。將多拷貝陽性重組菌株接種在BMGY培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)30h，離心收集細(xì)胞；再將細(xì)胞置于含有0.5% (體積百分比)甲醇的BMMY培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)144h，離心收集細(xì)胞， 用水沖洗后，接種至YGC培養(yǎng)基中30°C培養(yǎng)120h，然后3000g離心分鐘收集菌體，蒸餾水洗滌后再用50mM pH7. 0磷酸緩沖液洗滌，然后與2倍體積油酸混合，-80°C下預(yù)凍后再經(jīng)德國Christ真空冷凍干燥機(jī)干燥Mh，用己烷洗滌除去油酸，再進(jìn)行再真空干燥去除己烷，即得到經(jīng)生物印跡處理的酵母展示脂肪酶。實(shí)施例2酵母展示脂肪酶催化合成維生素A棕櫚酸酯實(shí)例1取維生素A醋酸酯0. 328g、棕櫚酸U82g，加入含有IOmL正己烷的磨口三角瓶，混合、預(yù)熱lOmin，然后加入酵母展示脂肪酶0. 5g，充隊(duì)密封，置于85_1型磁力攪拌器中攪拌開始反應(yīng)，轉(zhuǎn)速為250轉(zhuǎn)/分鐘，反應(yīng)溫度保持在45°C，反應(yīng)1 后停止攪拌，離心沉淀除去酵母展示脂肪酶，取上清液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，水洗3次后加入正己烷于4 °C結(jié)晶得維生素A棕櫚酸酯產(chǎn)品，烘干、粉碎即可。實(shí)例2取維生素A醋酸酯0.656g、棕櫚酸0. 7g，加入含有IOmL正己烷的磨口三角瓶，混合、預(yù)熱lOmin，然后加入酵母展示脂肪酶lg，充隊(duì)密封，置于85-1型磁力攪拌器中攪拌開始反應(yīng)，轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘，反應(yīng)溫度保持在50°C，反應(yīng)1 后停止攪拌，離心沉淀除去酵母展示脂肪酶，取上清液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，水洗3次后加入正己烷于4°C 結(jié)晶得維生素A棕櫚酸酯產(chǎn)品，烘干、粉碎即可。實(shí)施例3采用傳統(tǒng)化學(xué)法合成維生素A棕櫚酸酯取維生素A醋酸酯0. 328g、棕櫚酸1.282g，加入含有IOmL正己烷的磨口三角瓶， 混合、預(yù)熱lOmin，充N2密封，置于85_1型磁力攪拌器中攪拌開始反應(yīng)，轉(zhuǎn)速為250轉(zhuǎn)/分鐘，反應(yīng)溫度保持在45°C，反應(yīng)1 后停止攪拌，取上清液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，水洗3次后加入正己烷于4°C結(jié)晶得維生素A棕櫚酸酯產(chǎn)品，烘干、粉碎即可。實(shí)施例4測定轉(zhuǎn)化產(chǎn)率和轉(zhuǎn)化率取ImL未分離的反應(yīng)產(chǎn)物，離心去除催化劑，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶劑，用100%甲醇準(zhǔn)確定容至10mL，該溶液經(jīng)0. 22 μ m有機(jī)濾膜過濾后用高效液相色譜(HPLC)測定溶液各組分濃度。HPLC條件如下Agilent Technologies 1200系列高效液相色譜液，色譜柱: Grace Prevail Organic Acid 5ul50mmX4. 6mm，柱溫40 °C，流動相甲醇 / 水 / 磷酸 (85/15/0. 1)，流速lmL/min，進(jìn)樣量10 μ L，檢測波長:280nm。轉(zhuǎn)化率計(jì)算公式如下C retinyl acetate-C ester/C retinyl acetate κ 100%。式中C ester為HPLC測定樣品中維生素A棕櫚酸酯的濃度，C retinylacetate 為反應(yīng)前樣品中維生素A醋酸酯的濃度。通過上述方法檢測計(jì)算，實(shí)施例2中，實(shí)例1合成維生素A棕櫚酸酯的轉(zhuǎn)化率達(dá) 90%,實(shí)例2合成維生素A棕櫚酸酯的轉(zhuǎn)化率達(dá)89%。而實(shí)施例3采用傳統(tǒng)化學(xué)法合成維生素A棕櫚酸酯的轉(zhuǎn)化率僅為。
權(quán)利要求
1.一種酵母展示脂肪酶催化合成維生素A棕櫚酸酯的方法，包括將維生素A醋酸酯和棕櫚酸溶于有機(jī)溶劑中，加入酵母展示脂肪酶，無氧條件下于 50 60°C反應(yīng)10 14小時，分離、純化制得維生素A棕櫚酸酯； 所述的酵母展示脂肪酶通過如下方法制備將經(jīng)線性化處理的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母(Pichia paSt0riS)GS115，將所得轉(zhuǎn)化子接種于BMMY培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)培養(yǎng)72 144小時后離心收集菌體，菌體經(jīng)沖洗、生物印跡和冷凍干燥制得酵母展示脂肪酶；所述的重組質(zhì)粒由原始載體PPIC9K和依次插入原始載體PPIC9K中MF α 1信號肽下游的脂肪酶基因和畢赤酵母GS115的細(xì)胞壁α凝集素基因組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，以每升有機(jī)溶劑計(jì)，維生素A醋酸酯、棕櫚酸和酵母展示脂肪酶的加入量分別為20 100g、50 150g、50 100g。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的有機(jī)溶劑為正己烷。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的生物印跡中所用配體為油酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種酵母展示脂肪酶催化合成維生素A棕櫚酸酯的方法，包括將維生素A醋酸酯和棕櫚酸溶于有機(jī)溶劑中，加入酵母展示脂肪酶，無氧條件下于50～60℃反應(yīng)10～14小時，分離、純化制得維生素A棕櫚酸酯；將經(jīng)線性化處理的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115，將所得轉(zhuǎn)化子接種于BMMY培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)培養(yǎng)72～144小時后離心收集菌體，菌體經(jīng)沖洗、生物印跡和冷凍干燥制得酵母展示脂肪酶；本發(fā)明通過將脂肪酶展示在細(xì)胞外，利用該酶制劑催化合成維生素A棕櫚酸酯，不僅提高了轉(zhuǎn)化效率，而且縮短了反應(yīng)時間，降低了生產(chǎn)成本。
文檔編號C12N9/20GK102212601SQ201110110428
公開日2011年10月12日 申請日期2011年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月28日
發(fā)明者何國慶, 周陳偉, 地里熱巴, 徐娟, 林吉恒, 王睿之, 阮暉 申請人:浙江大學(xué)