專利名稱：用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的昆蟲感染方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于一種用于以桿狀病毒表達(dá)載體在昆蟲中產(chǎn)生蛋白質(zhì)的昆蟲感染方法。特定而言，所述感染方法用于感染昆蟲幼蟲或蛹。
背景技術(shù)：
基于生物反應(yīng)器生產(chǎn)蛋白質(zhì)的一種低成本替代方法是利用昆蟲幼蟲作為“微型生物反應(yīng)器”。此類方法主要利用昆蟲幼蟲作為制造蛋白質(zhì)的生物工廠。因?yàn)槔ハx幼蟲生長快速且成本廉價(jià)，已嘗試以遺傳工程改造它們(取代細(xì)胞)以表現(xiàn)蛋白質(zhì)。必須將基因?qū)胗紫x以表現(xiàn)蛋白質(zhì)，在此方面，桿狀病毒(Baculovirus)已用于將基因?qū)肜ハx或其幼蟲。桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)已廣泛用于昆蟲。桿狀病毒，為一種昆蟲病毒，僅感染昆蟲且用于作為轉(zhuǎn)殖基因在昆蟲中的大規(guī)模表現(xiàn)系統(tǒng)。桿狀病毒通常根據(jù)所源自的宿主來命名桿狀病毒。舉例而言，自苜蓿環(huán)紋夜蛾(alfalfa looper)分離的桿狀病毒被命名為加州苜蓿夜蛾(Autographa californica)，AcMNPV。然而，粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)、大蠟螟 (Galleria mellonella)及薄荷灰夜蛾(Rachiplusia ou)中亦發(fā)現(xiàn)與AcMNPV幾乎相同的桿狀病毒。其它的桿狀病毒表達(dá)載體亦為已知，例如源自家蠶(Bombyx mori L.)核多角體 BmNPV的表達(dá)載體。BmNPV載體系統(tǒng)尤其適用于在家蠶幼蟲中，用以產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)。桿狀病毒感染昆蟲幼蟲的最常見的方法為口服感染、注射感染及噴霧感染。然而， 當(dāng)實(shí)際且工業(yè)應(yīng)用于蠶時(shí)，卻存在許多瓶頸問題。US 5，288, 616揭示一種藉由使用蠶來產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，其包含用已插入目標(biāo)蛋白質(zhì)基因的病毒經(jīng)口感染蠶；喂養(yǎng)所述等蠶；及自所述等蠶收集所述目標(biāo)蛋白質(zhì)。EP 06381 提供用于口服感染的包埋前(pre-occluded)桿狀病毒粒子，所述病毒經(jīng)基因改造以使其缺乏功能性多角體蛋白或顆粒體蛋白基因。EP 1442658(及其對應(yīng)案CN 1599554、 US 2004241822、JP 2003111535、WO 03030637)提供一種制造以重組病毒感染蠶的飼料的方法及一種將重組病毒同時(shí)經(jīng)口接種于蠶體內(nèi)的方法。Toru Arakawa等人揭示藉由光學(xué)增亮劑Tinopal UNPA-GX協(xié)助核多角體病毒出芽粒子(nuclear polyhedrosis virus budded particle)經(jīng)口感染家蠶(Journal of Viorlogical Methods 88(2000)第 145-152 頁)。 所述等作者更研究出一種使用昆蟲生長調(diào)節(jié)劑，氟芬隆(f lufenoxuron)，以使BmNPV經(jīng)口感染家蠶的方法(Journal of Virological Methods 100(2002)第 141-147 頁)。然而，如何提高桿狀病毒對昆蟲的口服感染率仍然為此項(xiàng)技術(shù)中的一項(xiàng)難題，重組桿狀病毒通常去除多角體蛋白基因以用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)，因此經(jīng)由口服感染的此等重組桿狀病毒，容易被昆蟲消化分解，導(dǎo)致感染率較低。此外，在使用口服感染時(shí)難以控制病毒劑量。重組桿狀病毒可利用注射器經(jīng)由個(gè)別背側(cè)注射來感染幼蟲。舉例而言，CN 1974776使用含有重組桿狀病毒的脂質(zhì)體，藉由注射來感染家蠶。盡管注射感染具有較高的感染率，但其耗費(fèi)時(shí)間及人力。JP 9051742提供一種自動注射裝置來節(jié)省人力。然而，其仍需要大量時(shí)間且不能批處理家蠶。耗費(fèi)時(shí)間及人力已成為桿狀病毒表現(xiàn)系統(tǒng)在家蠶生物反應(yīng)器的實(shí)際及工業(yè)利用上的瓶頸。
US 7，261，886提供一種應(yīng)用于生產(chǎn)重組蛋白與桿狀病毒生物農(nóng)藥的蟲體噴霧感染方法，藉由芽體形式桿狀病毒(budding form baculovirus)的液體噴霧來感染昆蟲幼蟲。然而，所述專利的噴霧方法僅能用于三或四齡期的幼蟲，在所述專利中，使用1-4齡的擬尺蠖進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并建議對3及4齡幼蟲可獲得較高的桿狀病毒及蛋白質(zhì)產(chǎn)率，而其感染率為約88%。另所述專利亦使用三齡期的小菜蛾幼蟲進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，但感染率僅有三成。因此，噴霧感染方法的感染率在不同昆蟲差異相當(dāng)大。再者，所述等噴霧方法系以噴霧方式實(shí)施，無法均勻感染幼蟲。在無需大量時(shí)間及人力下，于昆蟲中獲得高桿狀病毒感染率為一難題；需要一種有效且能夠獲得高感染率的創(chuàng)新感染方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種用于以桿狀病毒表達(dá)載體在昆蟲中產(chǎn)生蛋白質(zhì)的昆蟲感染方法， 所述方法包含以下步驟(a)提供復(fù)數(shù)個(gè)昆蟲幼蟲或蛹；(b)提供一病毒溶液，所述病毒溶液包含野生型桿狀病毒或具有編碼蛋白質(zhì)的目標(biāo)基因的桿狀病毒表達(dá)載體；(c)使昆蟲幼蟲或蛹受到脅迫；(d)將所述等昆蟲幼蟲或蛹浸漬于所述溶液中持續(xù)一段適當(dāng)時(shí)間以使其感染所述野生型桿狀病毒或具有編碼蛋白質(zhì)的目標(biāo)基因的桿狀病毒表達(dá)載體；(e)培育經(jīng)感染的幼蟲或蛹以產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)；及(f)收集所述蛋白質(zhì)。本發(fā)明亦提供一種用于實(shí)施本發(fā)明的感染方法的裝置，其包含一用于承載病毒溶液的容器、一位于所述容器上方且用于支撐昆蟲幼蟲或蛹的第一網(wǎng)；及一具有用于調(diào)整網(wǎng)高度的榫的第二網(wǎng)。


圖1顯示用于實(shí)施本發(fā)明方法的裝置。1 容器；2 第一網(wǎng)；3 第二網(wǎng)；4 榫；5 病毒溶液；6 幼蟲。圖2顯示對在接種4天后蠶體液內(nèi)的CSFV E2累積的西方墨點(diǎn)分析結(jié)果。M =XP 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品；INF-15 進(jìn)行INF方法感染15分鐘的蠶；INF-0. 5 進(jìn)行INF方法感染0. 5 小時(shí)的蠶；INF-I 進(jìn)行INF方法感染1小時(shí)的蠶；INJ 以INJ方法感染的蠶；Std E2 :skE2 186ng ；CK 健康蠶。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供一種以桿狀病毒感染昆蟲幼蟲或蛹的方法。所述方法可一次性或批處理大量幼蟲或蛹。此外，本發(fā)明方法可節(jié)約時(shí)間及人力，并具高感染率，可均勻、有效地感染幼蟲或蛹。本發(fā)明提供一種用于以桿狀病毒表達(dá)載體在昆蟲中產(chǎn)生蛋白質(zhì)的昆蟲感染方法， 所述方法包含以下步驟
(a)提供復(fù)數(shù)個(gè)昆蟲幼蟲或蛹；(b)提供一病毒溶液，所述病毒溶液包含野生型桿狀病毒或具有編碼蛋白質(zhì)的目標(biāo)基因的桿狀病毒表達(dá)載體；(c)使昆蟲幼蟲或蛹受到脅迫；(d)將所述等昆蟲幼蟲或蛹浸漬于所述溶液中持續(xù)一段適當(dāng)時(shí)間以使其感染所述野生型桿狀病毒或具有編碼蛋白質(zhì)的目標(biāo)基因的桿狀病毒表達(dá)載體；(e)培育經(jīng)感染的幼蟲或蛹以產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)；及(f)收集所述蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語「感染」系指病毒感染，包括明顯的病變，或僅為病毒在感染后于動物體內(nèi)的復(fù)制及增殖。在一實(shí)施例中，檢測出來自嵌合病毒基因組的表現(xiàn)蛋白質(zhì)顯示病毒構(gòu)筑體具有感染性。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語「幼蟲」系指自昆蟲卵孵化成未成熟、無翅膀且常像蠕蟲一樣的昆蟲發(fā)育階段。經(jīng)過若干次蛻皮后，主要造成其大小的變化，且最終蛻變成蛹(pupa)，由此羽化出成蟲。術(shù)語「蛹」系指經(jīng)歷蛻變的昆蟲的發(fā)育階段。僅在彼等經(jīng)歷完全變態(tài)(complete metamorphosis)的全變態(tài)(holometabolous)昆蟲中存在蛹階段，全變態(tài)昆蟲經(jīng)歷四個(gè)生命階段胚胎、幼蟲、蛹及成蟲。在本發(fā)明的實(shí)施例中，昆蟲幼蟲或蛹為家蠶(Bombyx mori)、 粉紋夜蛾(Trichoplusia ni Hilbner，甘藍(lán)銀紋夜蛾(callage looper))、加州苜蓿夜蛾(苜蓿環(huán)紋夜蛾)或草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)等昆蟲的幼蟲或蛹。較佳地所述幼蟲為第三、第四或第五齡期的幼蟲。根據(jù)本發(fā)明，「野生型桿狀病毒」系指任何天然存在的桿狀病毒。最常應(yīng)用的桿狀病毒屬于核多角體病毒屬(Nucleopolyhedrovirus)。最常見桿狀病毒為加州苜蓿夜蛾核多角體病毒(AcMNPV)及家蠶核多角體病毒(BmNPV)。根據(jù)本發(fā)明，「桿狀病毒表達(dá)載體」系指包含內(nèi)源或外源基因或DNA的桿狀病毒。 桿狀病毒表達(dá)載體被廣泛用在培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞及昆蟲幼蟲中表現(xiàn)基因。用于外源基因表現(xiàn)的兩種最常見的分離株為加州苜蓿夜蛾多核型多角體病毒(Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus, AcMNPV)及家蠶核多角體病毒(BmNPV)。牛艮據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施例，病毒濃度為IO4 101Qpfu/ml，較佳為IO5 l(fpfu/ml?；蜉^佳為轉(zhuǎn)殖基因，其為擬表現(xiàn)于目標(biāo)宿主(昆蟲)的相關(guān)基因；或?yàn)闃?biāo)記基因 (報(bào)導(dǎo)基因)。較佳地，所述基因?yàn)橥庠崔D(zhuǎn)殖基因。此外，欲進(jìn)行重組的基因較佳具有允許基因高度表現(xiàn)于昆蟲細(xì)胞的啟動子。當(dāng)應(yīng)用于宿主的載體最終制備完成后，在細(xì)胞中表現(xiàn)的啟動子即作為轉(zhuǎn)殖基因的啟動子。此外，欲導(dǎo)入的基因不受特定限制，只要其可藉由以上提及的啟動子表現(xiàn)即可；但就可利用性而言，以下相關(guān)的基因較佳各種遺傳疾病、干擾素、 細(xì)胞激素、神經(jīng)營養(yǎng)因子、非自身抗原基因、編碼病毒(諸如流行性感冒病毒及肝炎病毒等)抗原的核苷酸序列、癌癥抑制基因、反義序列(諸如Ras)、癌癥基因、自殺基因(諸如胸苷激酶等)、抗生素基因、抗體基因或治療性蛋白質(zhì)基因。就此而言，以下文章以引用的方式 ^Λ^ Φ Journal of Clinical microbiology, 2009, % 3276-3282 M ；Appl Microbiol Biotechnol，2010，85 :459-470 ；PLoS ONE，2008 年 12 月，第 3 卷，第 12 期，e3933，第 1-7 頁； 及 Molecular and Cellular Biology，1983 年 12 月，第 2156-2165 頁。在一實(shí)施例中，家蠶桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)可成功表現(xiàn)相關(guān)內(nèi)源或外源基因。較佳地，外源基因可由各種原核及真核有機(jī)體及病毒分離得的。代表性實(shí)例包括許多人類基因在家蠶中表現(xiàn)，包括生長激素(hGH)、巨噬細(xì)胞群落刺激因子(hM-CSF)、β -干擾素(HuIF Ν-β)、人類α-干擾素的表現(xiàn)、及經(jīng)編碼表皮基因或脂動激素(adipokinetic hormone) 的昆蟲信號肽的信號DNA序列置換的CD4(T細(xì)胞表面蛋白質(zhì)T4)。蠶幼蟲亦已用于高度表現(xiàn)及分泌具有生物活性的小鼠介白素-3及嚙齒瘧蟲(Plasmodium berghei)的重組動合子(ookinete)表面抗原。重組全長角質(zhì)細(xì)胞生長因子(KGF)已表現(xiàn)于包括家蠶的昆蟲細(xì)胞宿主中(美國專利第5，863，767號、第5，843，883號及第5，773，586號)。另已使用家蠶核多角體病毒(BmNPV)將黃桿菌屬(FlavcAacterium)的原核脯胺?；逆渻?nèi)切酶 (prolylendopeptidase)表現(xiàn)于昆蟲細(xì)胞(美國專利第5，521，081號)。病毒成份亦可表現(xiàn)于家蠶桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)。此等包括典型豬瘟病毒 (classical swine fever virus)、豬環(huán)狀病毒(porcine circovirus)、豬流行性感冒病毒 (swine influenza virus)、假性狂犬病病毒(pseudorabies virus)、豬冠狀病毒(porcine coronavirus)、(foot-and-mouth disease virus)(NDV) ^D26的融合醣蛋白(F)；激酶活性v-erbB基因，即一種禽類紅血球母細(xì)胞增多癥病毒的致癌基因，其編碼為表皮生長因子受體的截短形式的蛋白質(zhì)；B型及C型肝炎病毒抗原；v-sis 蛋白質(zhì)的特征；I型人類T細(xì)胞白血病病毒(HTLV-I)的重組蛋白質(zhì)；及在昆蟲(中國種家蠶)細(xì)胞中具有DNA結(jié)合活性的6b型人類乳突狀瘤病毒CSFV E2基因產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語「脅迫」(stress)系指在不導(dǎo)致死亡下，使幼蟲或蛹處于情緒或身體性壓力下。在被脅迫的后，幼蟲或蛹將恢復(fù)并正常表現(xiàn)蛋白質(zhì)。本發(fā)明未預(yù)期地發(fā)現(xiàn)， 脅迫幼蟲或蛹結(jié)合浸漬所述幼蟲或蛹，可增進(jìn)感染率。在本發(fā)明的實(shí)施例中，可藉由單獨(dú)或組合使用以下手段來達(dá)成脅迫將幼蟲或蛹保持在低溫或高于正常生長溫度但低于耐受溫度的溫度下、使幼蟲或蛹饑餓、將幼蟲或蛹置放于低壓環(huán)境下、用輻射照射幼蟲或蛹或用化學(xué)試劑處理幼蟲或蛹。在一實(shí)施例中，幼蟲或蛹被保持在以下低溫下約2°C至約15°C、較佳約3°C至約15°C、更佳約4°C至約15°C、約4°C至約12°C、約5°C至約15°C、或約4°C至約 10°C、最佳約4°C至約6°C、約4°C至約8°C、或約4°C至約10°C。在另一實(shí)施例中，幼蟲或蛹被保持在以下較高溫度下約30 V至45 °C、較佳約32 °C至45 °C、約32 °C至42 °C、約32 °C至 40 V、約35 V至45°C、或約35°C至40°C。在另一實(shí)施例中，藉由用低劑量紫外線照射來處理幼蟲或蛹。在另一實(shí)施例中，藉由將幼蟲或蛹置放于低壓環(huán)境中來對其進(jìn)行處理。氣壓更佳被降低5%至50%。在另一實(shí)施例中，使幼蟲或蛹禁食至少兩天。較佳使幼蟲或蛹禁食兩天、三天或四天。根據(jù)本發(fā)明，「浸漬」昆蟲幼蟲或蛹系藉由將昆蟲幼蟲或蛹浸漬于桿狀病毒溶液， 使其在不死亡的情況下感染桿狀病毒來進(jìn)行。病毒將進(jìn)入幼蟲或蛹的氣孔(stoma)以進(jìn)行感染。對幼蟲或蛹的浸漬時(shí)間較佳為至少5分鐘。浸漬時(shí)間范圍較佳為5分鐘至6小時(shí)， 更佳為10分鐘至6小時(shí)、15分鐘至1小時(shí)、30分鐘至1小時(shí)、30分鐘至2小時(shí)、或30分鐘至3小時(shí)。具有此項(xiàng)技術(shù)的通常知識人員可基于物種、生理?xiàng)l件、異源基因種類等來調(diào)整浸漬時(shí)間及病毒濃度。根據(jù)本發(fā)明，培育幼蟲或蛹以產(chǎn)生蛋白質(zhì)。培育時(shí)間較佳為1. 5至5天、1. 5至6 天、1. 2至4天、1. 5至3天、或2至3天。有效培育條件及期間視此項(xiàng)技藝中已知的幼蟲或蛹的種類、培育溫度及蛋白質(zhì)而調(diào)整并改變。舉例而言，蠶的理想生長溫度為約25°C至約28°C。本發(fā)明亦提供一種用于實(shí)施本發(fā)明的感染方法的裝置，其包含一用于承載病毒溶液的容器、一位于所述容器上方且用于支撐昆蟲幼蟲或蛹的第一網(wǎng)；及一具有用于調(diào)整網(wǎng)高度的榫的第二網(wǎng)。較佳地，所述裝置進(jìn)一步包含一用于降低大氣濃度的真空構(gòu)件。圖1 為本發(fā)明裝置的代表圖式。所述裝置包含用于承載病毒溶液5的容器1。第一網(wǎng)2位于所述容器上方以用于支撐昆蟲幼蟲或蛹，且第二網(wǎng)3具有用于調(diào)整網(wǎng)高度的榫4，以便幼蟲或蛹6可位于第一網(wǎng)與第二網(wǎng)的間，并能適當(dāng)?shù)乇徊《救芤航n。網(wǎng)較佳為不銹鋼或塑料網(wǎng)。 本發(fā)明裝置可批處理大量幼蟲或蛹。本發(fā)明裝置的尺寸可根據(jù)幼蟲或蛹的量而調(diào)整。本發(fā)明的感染方法提供高感染率；感染率較佳高于85%、更佳高于90%。本發(fā)明的感染方法不需要大量人力且可同時(shí)感染大量幼蟲或蛹。實(shí)例實(shí)例1家蠶核多角體病毒(BmNPV)對蠶幼蟲的感染及感染率分析在第一天，藉由噴霧感染、注射感染、口服感染及本發(fā)明的感染方法，用具有紅熒光蛋白質(zhì)的重組家蠶核多角體病毒(BmNPV)接種五齡蠶幼蟲0J03*0J04。未感染的蠶充當(dāng)負(fù)對照組。在噴霧感染時(shí)，將2ml濃度為1 X 107pfu/ml的重組BmNPV溶液噴灑在蠶幼蟲及桑葉上若干次；注射感染乃將1 X 106pfu/ml的BmNPV溶液經(jīng)微量注射器注射至蠶幼蟲的氣孔中來進(jìn)行。至于口服感染，乃對蠶幼蟲喂養(yǎng)涂有l(wèi)X107pfu/ml的重組BmNPV溶液的桑葉。對于本發(fā)明的感染方法，使家蠶幼蟲處于4°C下15小時(shí)進(jìn)行前處理。取出后恢復(fù) 1小時(shí)，再將幼蟲浸漬于IXlOWml的BmNPV溶液中1小時(shí)。浸漬完成的家蠶置于含桑葉的飼育箱中，以慣行方式進(jìn)行喂飼。在高濕度下，于25+/-2 V下培育感染后的家蠶。接種4天的后，測定各種感染方法的感染率(表現(xiàn)紅熒光蛋白的幼蟲數(shù)/全體經(jīng)感染的幼蟲數(shù))，如下表1所示表1.家蠶以不同方法感染重組桿狀病毒的感染率
權(quán)利要求
1.一種用于以桿狀病毒表達(dá)載體在昆蟲中產(chǎn)生蛋白質(zhì)的昆蟲感染方法，所述方法包含以下步驟(a)提供復(fù)數(shù)個(gè)昆蟲幼蟲或蛹；(b)提供一病毒溶液，所述病毒溶液包含野生型桿狀病毒或具有編碼蛋白質(zhì)的目標(biāo)基因的桿狀病毒表達(dá)載體；(c)使昆蟲幼蟲或蛹受到脅迫；(d)將所述昆蟲幼蟲或蛹浸漬于所述溶液中持續(xù)一段適當(dāng)時(shí)間以使其感染所述野生型桿狀病毒或具有編碼蛋白質(zhì)的目標(biāo)基因的桿狀病毒表達(dá)載體；(e)培育經(jīng)感染的幼蟲或蛹以產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)；及(f)收集所述蛋白質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1所述的感染方法，其中所述昆蟲為家蠶(Bombyxmori L.)、粉紋夜蛾 CTrichoplusia ni Hiibner)、加州苜蓿夜蛾(Autographa californica，苜蓿環(huán)紋夜蛾 (alfalfa looper)) 5 ^ ^ (Spodoptera frugiperda)。
3.如權(quán)利要求1所述的感染方法，其中所述昆蟲為家蠶(蠶)或粉紋夜蛾。
4.如權(quán)利要求1所述的感染方法，其中所述幼蟲處于三、四或五齡期。
5.如權(quán)利要求1所述的感染方法，其中所述桿狀病毒為加州苜蓿夜蛾多核型多角體病毒(AcMNPV)或家蠶(蠶)核多角體病毒(BmNPV)。
6.如權(quán)利要求1所述的感染方法，其中所述基因?yàn)閮?nèi)源基因或外源轉(zhuǎn)基因。
7.如權(quán)利要求1所述的感染方法，其中所述基因與以下相關(guān)疫苗蛋白質(zhì)、抗細(xì)菌蛋白質(zhì)、各種遺傳疾病、干擾素、細(xì)胞因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子、非自身抗原基因、編碼病毒(諸如流行性感冒病毒及肝炎病毒等)抗原的核苷酸序列、癌癥抑制基因、反義序列(諸如Ras)、癌癥基因、自殺基因(諸如胸苷激酶等)、抗生素基因、抗體基因或治療性蛋白質(zhì)基因。
8.如權(quán)利要求1所述的感染方法，其中步驟(c)中的所述脅迫是藉由單獨(dú)或組合使用以下手段來進(jìn)行將幼蟲或蛹保持在低溫或高于正常生長溫度但低于耐受溫度的溫度下、 使幼蟲或蛹饑餓、將幼蟲或蛹放置于低壓環(huán)境下、用輻射照射幼蟲或蛹，或用化學(xué)試劑處理幼蟲或蛹。
9.如權(quán)利要求1所述的感染方法，其中步驟(c)中的所述脅迫是藉由將所述幼蟲或蛹保持在約2°C至約15°C的低溫下來進(jìn)行。
10.如權(quán)利要求9所述的感染方法，其中所述溫度為約；TC至約15°C、更佳約4°C至約 15°C、約4°C至約12°C、約5°C至約15°C、或約4°C至約10°C、最佳約4°C至約6°C、約4°C至約8°C、或約4°C至約10°C。
11.如權(quán)利要求9所述的感染方法，其中所述溫度為約4°C。
12.如權(quán)利要求1所述的感染方法，其中步驟(c)中的所述脅迫是藉由將所述幼蟲或蛹保持在約30°C至45°C的高溫下進(jìn)行。
13.如權(quán)利要求12所述的感染方法，其中步驟(c)中的所述脅迫是藉由將所述幼蟲或蛹保持在以下高溫下來進(jìn)行約32V至45°C、約32V至42°C、約32V至40°C、約35V至 45°C、或約;35°C至 40°C。
14.如權(quán)利要求1所述的感染方法，其中步驟(c)中的所述脅迫是藉由以低劑量紫外線照射所述幼蟲或蛹來進(jìn)行。
15.如權(quán)利要求1所述的感染方法，其中對所述幼蟲或蛹的浸漬時(shí)間為至少5分鐘。
16.如權(quán)利要求1所述的感染方法，其中對所述幼蟲或蛹的浸漬時(shí)間在5分鐘至6小時(shí)范圍內(nèi)。
17.如權(quán)利要求1所述的感染方法，其中對所述幼蟲或蛹的浸漬時(shí)間在以下范圍內(nèi)10 分鐘至6小時(shí)、15分鐘至1小時(shí)、30分鐘至1小時(shí)、30分鐘至2小時(shí)、或30分鐘至3小時(shí)。
18.如權(quán)利要求1所述的感染方法，其中步驟(c)中的所述脅迫是藉由將幼蟲或蛹置于具有降低氣壓的環(huán)境中來對其進(jìn)行處理。
19.如權(quán)利要求18所述的感染方法，其中所述氣壓被降低5%至50%。
20.如權(quán)利要求1所述的感染方法，其中步驟(c)中的所述脅迫是藉由使所述幼蟲或蛹禁食至少2天來進(jìn)行。
21.如權(quán)利要求1所述的感染方法，其中步驟(c)中的所述脅迫是藉由使所述幼蟲或蛹禁食兩天、三天或四天來進(jìn)行。
22.如權(quán)利要求1所述的感染方法，其中所述病毒的濃度為IO4 KTpfu/ml。
23.如權(quán)利要求1所述的感染方法，其中所述病毒的濃度為IO5 l(fpfu/ml。
24.一種用于實(shí)施如權(quán)利要求1所述的感染方法的裝置，其包含一用于承載病毒溶液的容器、一位于所述容器上方且用于支撐昆蟲幼蟲或蛹的第一網(wǎng)；及一具有用于調(diào)整網(wǎng)高度的榫的第二網(wǎng)。
25.如權(quán)利要求M所述的裝置，其中所述第一或第二網(wǎng)為不銹鋼或塑料網(wǎng)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于以桿狀病毒表達(dá)載體在昆蟲中產(chǎn)生蛋白質(zhì)的昆蟲感染方法，所述方法包含以下步驟(a)提供復(fù)數(shù)個(gè)昆蟲幼蟲或蛹；(b)提供一病毒溶液，所述病毒溶液包含野生型桿狀病毒或具有編碼蛋白質(zhì)的目標(biāo)基因的桿狀病毒表達(dá)載體；(c)使昆蟲幼蟲或蛹受到脅迫；(d)將所述昆蟲幼蟲或蛹浸漬于所述溶液中持續(xù)一段適當(dāng)時(shí)間以使其感染所述野生型桿狀病毒或具有編碼蛋白質(zhì)的目標(biāo)基因的桿狀病毒表達(dá)載體；(e)培育經(jīng)感染的幼蟲或蛹以產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)；及(f)收集所述蛋白質(zhì)。所述方法可同時(shí)處理大量的幼蟲或蛹，達(dá)到批次感染，節(jié)省人力及高感染率的目標(biāo)。
文檔編號C12M1/00GK102286533SQ20111011332
公開日2011年12月21日 申請日期2011年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月18日
發(fā)明者余錫金, 盧美君, 廖久薰 申請人:財(cái)團(tuán)法人工業(yè)技術(shù)研究院