專利名稱：一種用于病毒噬斑純化和克隆混合膠溶液配制的新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒噬斑純化和克隆混合膠液的配制，采用的新方法與常規(guī)方法相比，提高了單位面積的細(xì)胞數(shù)量和單克隆純化病毒粒子的數(shù)量，降低了實(shí)驗(yàn)成本，提高實(shí)驗(yàn)功效。
背景技術(shù)：
常規(guī)的病毒噬斑、純化和(細(xì)胞)克隆方法是使用(2 10)X培養(yǎng)基與低熔點(diǎn)膠按相應(yīng)比例混合后，覆蓋于接毒后的單層細(xì)胞，但是使用(2 10)X培養(yǎng)基用于病毒噬斑、純化和(細(xì)胞)克隆，需要提前將(2 10) X培養(yǎng)基配制好，低熔點(diǎn)膠提前高壓滅菌后備用； 此方法程序煩瑣，且培養(yǎng)基與膠混合后溶液的PH值、滲透壓將會(huì)發(fā)生改變，影響了細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，進(jìn)而影響病毒克隆的效果。文獻(xiàn)檢索披露的病毒克隆純化SOP 2%膠的配制；稱取2克膠，加入100 ml去離子水，0. 112MPa高壓滅菌30分鐘，置于4°C保存，使用前充分熔化，置于40 — 45°C水浴備用；2X培養(yǎng)基的配置=IOgMEM干粉培養(yǎng)基、45ml注射用水、胎牛血清20ml、0. 238克的 HEPES、0.06克的L-谷氨酰氨，1克的水解乳蛋白、3%碳酸氫的aiil、0. 5%中性紅1.2ml 配制而成，PH值調(diào)至7. 3;使用時(shí)需將預(yù)先高壓滅菌好的膠溶液與2X培養(yǎng)基1 :1混合，待混合膠溶液降至37°C左右覆蓋細(xì)胞。本發(fā)明構(gòu)思將IX培養(yǎng)基(培養(yǎng)細(xì)胞常規(guī)液體)、(2 10) X培養(yǎng)基分別與低熔點(diǎn)膠混合，在初始細(xì)胞數(shù)量相等的情況下在細(xì)胞表面覆蓋低熔點(diǎn)膠培養(yǎng)細(xì)胞；和在初始細(xì)胞數(shù)量相等的情況下同時(shí)接種等量稀釋的病毒后覆蓋低熔點(diǎn)膠培養(yǎng)病毒，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和毒價(jià)測(cè)定，結(jié)果表明前者可有效提高單位面積的細(xì)胞數(shù)量和單克隆和純化病毒粒子的數(shù)量，簡(jiǎn)單實(shí)用，達(dá)到了設(shè)計(jì)要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供的用于病毒噬斑純化和克隆混合膠溶液配制的新方法， 替代(2 10) X培養(yǎng)基用于病毒噬斑、純化和(細(xì)胞)克隆常規(guī)方法。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的一種用于病毒噬斑純化和克隆混合膠溶液配制的新方法， 包括IX細(xì)胞培養(yǎng)基的制備、低熔點(diǎn)膠的制備、混合膠溶液的制備與鋪膠；
其中IX細(xì)胞培養(yǎng)基的制備由4-6克MEM干粉培養(yǎng)基，0. 02-0. 04克的L-谷氨酰氨，0. 4-0. 6克的水解乳蛋白，94-98ml注射用水和胎牛血清3_5ml混合均勻，pH值調(diào)至 7. 2-7. 3 備用；
其中低熔點(diǎn)膠的制備取0. 6克的低熔點(diǎn)膠粉，倒入三角瓶中，加入40ml去離子水，將瓶口用硫酸紙和牛皮紙?jiān)o，在微波爐上煮沸細(xì)in，呈半固體狀時(shí)備用； 其中含1%的低熔點(diǎn)膠的混合膠溶液的制備與鋪膠
將上步的IX細(xì)胞培養(yǎng)基，加溫38°C，取60ml與上步制備的全量低熔點(diǎn)膠混合均勻， 用無菌的吸管輕輕吹打，使膠充分溶解并無氣泡產(chǎn)生；取出預(yù)先制備好的培養(yǎng)成單層并接種產(chǎn)生細(xì)胞病變的病毒，即為原代細(xì)胞和傳代細(xì)胞的細(xì)胞板；用移液器將細(xì)胞板里的培養(yǎng)基吸盡，然后將制備的膠溶液吸出，沿培養(yǎng)板壁將膠緩緩鋪在細(xì)胞表面，鋪完后在室溫放置 IOmin使其充分凝固，然后放入37°C、5%的(X)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞病變3_5天，挑取單個(gè)病毒克隆。所述的方法，能使常規(guī)的細(xì)胞數(shù)量提高了 1. 5倍，使單克隆病毒傳3代后的毒價(jià)提高了 8. 6倍(以10為底數(shù))。本發(fā)明的新方法，使用IX培養(yǎng)基方法培養(yǎng)細(xì)胞每孔細(xì)胞數(shù)量為8. 5X105是常規(guī)方法(細(xì)胞數(shù)為5. 6X IO5 )的1. 5倍，用IX培養(yǎng)基方法克隆出的病毒TCID5tl的平均值為 ΙΟ7'2 ；而用2X培養(yǎng)基方法克隆出的病毒TCID5tl的平均值為10 6 55，前者是后者的3. 55倍； 該方法不僅提高了細(xì)胞的數(shù)量，同時(shí)提高了單克隆病毒的毒價(jià)，簡(jiǎn)化了程序，縮短時(shí)間，彰顯技術(shù)進(jìn)步。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)發(fā)明作進(jìn)一步說明。采用IX培養(yǎng)基與低熔點(diǎn)膠混合進(jìn)行病毒的克隆和純化； 其中細(xì)胞的制備(以Marc-145細(xì)胞為例)
將生長(zhǎng)致密的Marc-145單層細(xì)胞用D Hanks洗2次，加入濃度為0. 25%的EDTA 胰酶消化細(xì)胞，消化完畢后，加入適量的培養(yǎng)基用吸管輕輕吹打，使細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞； 取其中ΙΟΟμΙ，加900μ1的Hanks液，混勻后滴于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，按白細(xì)胞計(jì)數(shù)法，于低倍鏡下計(jì)數(shù)四角的4個(gè)大方格內(nèi)的細(xì)胞；計(jì)數(shù)完畢后將細(xì)胞稀釋到2. OX 104/ml，鋪入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，使每孔細(xì)胞數(shù)均為4. OX IO4個(gè)，然后置于37°C、5%的(X)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng) M小時(shí)后備用；
其中病毒的接種，不同方法低熔點(diǎn)膠的配制使用[以豬繁殖與呼吸綜合征(PRRSV)活疫苗為例]
抽取IOOPIPRRSV活疫苗，用細(xì)胞培養(yǎng)基作10倍的梯度稀釋，取10 6 10 7的滴度樣， 分別加入上述的致密單層中，每孔500μ1，同時(shí)設(shè)對(duì)照每孔加細(xì)胞培養(yǎng)基，放入37°C、5%的 CO2培養(yǎng)箱中靜置1小時(shí)；
IX培養(yǎng)基與低熔點(diǎn)膠混合
1小時(shí)后棄取細(xì)胞培養(yǎng)基，首先將ι χ培養(yǎng)基預(yù)熱達(dá)到38°c后，稱取0. 4克低熔點(diǎn)膠粉，將膠粉倒入三角瓶中，加入40ml去離子水，用硫酸紙和牛皮紙將三角瓶口扎緊，在微波爐上用高溫檔煮沸細(xì)in后，此時(shí)膠是無菌的呈半固體狀(水已蒸發(fā)完畢)，取預(yù)熱的IX培養(yǎng)基60ml與上步制備的全量低熔點(diǎn)膠混合均勻，用無菌的吸管輕輕吹打，使膠充分溶解同時(shí)避免氣泡的產(chǎn)生；然后用移液器把細(xì)胞板里的液體吸盡，用吸管將將膠溶液快速吸取，沿培養(yǎng)板壁將膠緩緩鋪在細(xì)胞表面，鋪完后在室溫放置IOmin使其充分凝固，然后放入37°C、 5%的(X)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞狀態(tài)和病毒病變情況，觀察細(xì)胞病變5天，挑取單個(gè)病毒克隆，將挑取的單克隆病毒凍融3次接種Marc-145單層細(xì)胞，傳3代分別測(cè)TCID50 ； 2X培養(yǎng)基與低熔點(diǎn)膠混合
接毒方法同上；洲膠的配制稱取2克膠粉，加入100 ml去離子水，0. 112MPa高壓滅菌30分鐘，置于4°C保存，使用前充分熔化，置于45°C水浴備用；2X培養(yǎng)基的配置IOgMEM 干粉培養(yǎng)基、45ml注射用水、胎牛血清20ml、0. 238克的HEPES、0. 06克的L 谷氨酰氨，1 克的水解乳蛋白、3%碳酸氫的aiil、0. 5%中性紅1. 2ml配制而成，pH值調(diào)至7. 3，使用時(shí)將預(yù)先高壓滅菌好的低熔點(diǎn)膠溶液與2X培養(yǎng)基體積比1 :1混合。本方法所用細(xì)胞培養(yǎng)液由5gMEM干粉培養(yǎng)基，90ml注射用水，胎牛血清IOml配制而成，PH值調(diào)至7. 3。本方法所用細(xì)胞培養(yǎng)基由5gMEM干粉培養(yǎng)基，98ml注射用水，胎牛血清2ml配制而成，PH值調(diào)至7. 3。本方法所用IX培養(yǎng)基由5gMEM干粉培養(yǎng)基，0.03克的L 谷氨酰氨，0.5克的水解乳蛋白，96ml注射用水，胎牛血清配制而成，pH值調(diào)至7. 3。實(shí)驗(yàn)選用的Marc-145細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；MEM培養(yǎng)基為Hyclone公司生產(chǎn)，貨號(hào):SH30024. OlB ；胎牛血清為Hyclone公司生產(chǎn)，貨號(hào):SV30087. 02 ；EDTA 胰酶消化液為蘭州百靈公司生產(chǎn)；低熔點(diǎn)膠粉為irwitrogen公司生產(chǎn)，貨號(hào)Cat. no.16520-050。實(shí)驗(yàn)選用的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征(HPRRSV)活疫苗是新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)的產(chǎn)品，農(nóng)業(yè)部核發(fā)的產(chǎn)品生產(chǎn)批準(zhǔn)文號(hào)為農(nóng)醫(yī)藥便函[2010] 號(hào)。上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，見表1、2、3。
權(quán)利要求
1.一種用于病毒噬斑純化和克隆混合膠溶液配制的新方法，其特征在于包括IX細(xì)胞培養(yǎng)基的制備、低熔點(diǎn)膠的制備、混合膠溶液的制備與鋪膠；其中IX細(xì)胞培養(yǎng)基的制備由4-6克MEM干粉培養(yǎng)基，0. 02-0. 04克的L-谷氨酰氨，0. 4-0. 6克的水解乳蛋白，94-98ml注射用水和胎牛血清3_5ml混合均勻，pH值調(diào)至 7. 2-7. 3 備用；其中低熔點(diǎn)膠的制備取0. 6克的低熔點(diǎn)膠粉，倒入三角瓶中，加入40ml去離子水，將瓶口用硫酸紙和牛皮紙?jiān)o，在微波爐上煮沸細(xì)in，呈半固體狀時(shí)備用；其中含1%的低熔點(diǎn)膠的混合膠溶液的制備與鋪膠將上步的IX細(xì)胞培養(yǎng)基，加溫38°C，取60ml與上步制備的全量低熔點(diǎn)膠混合均勻， 用無菌的吸管輕輕吹打，使膠充分溶解并無氣泡產(chǎn)生；取出預(yù)先制備好的培養(yǎng)成單層并接種產(chǎn)生細(xì)胞病變的病毒，即為原代細(xì)胞和傳代細(xì)胞的細(xì)胞板；用移液器將細(xì)胞板里的培養(yǎng)基吸盡，然后將制備的膠溶液吸出，沿培養(yǎng)板壁將膠緩緩鋪在細(xì)胞表面，鋪完后在室溫放置 IOmin使其充分凝固，然后放入37°C、5%的(X)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞病變3_5天，挑取單個(gè)病毒克隆。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于該方法使常規(guī)的細(xì)胞數(shù)量提高了1. 5倍， 使單克隆病毒傳3代后的毒價(jià)提高了 8. 6倍。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于MEM干粉培養(yǎng)基為Hyclone公司生產(chǎn)， 貨號(hào)SH30024. OlB ；胎牛血清為Hyclone公司生產(chǎn)，貨號(hào)SV30087. 02 ；低熔點(diǎn)膠粉為 invitrogen 公司生產(chǎn)，貨號(hào):Cat. no. 16520-050。
全文摘要
本發(fā)明提供的一種用于病毒噬斑純化和克隆混合膠溶液配制的新方法，其中1×細(xì)胞培養(yǎng)基的制備由4-6克MEM干粉培養(yǎng)基，0.02-0.04克的L-谷氨酰氨，0.4-0.6克的水解乳蛋白，94-98ml注射用水和胎牛血清3-5ml混合均勻，pH值調(diào)至7.2-7.3備用；其中低熔點(diǎn)膠的制備取0.6克的低熔點(diǎn)膠粉，倒入三角瓶中，加入40ml去離子水，將瓶口用硫酸紙和牛皮紙?jiān)o，在微波爐上煮沸4min，呈半固體狀時(shí)備用；其中含1%的低熔點(diǎn)膠的混合膠溶液的制備與鋪膠；用移液器將細(xì)胞板里的培養(yǎng)基吸盡，然后將制備的膠溶液吸出，沿培養(yǎng)板壁將膠緩緩鋪在細(xì)胞表面，鋪完后在室溫放置10min使其充分凝固，然后放入37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞病變3-5天，挑取單個(gè)病毒克隆。該方法使常規(guī)的細(xì)胞數(shù)量提高了1.5倍，使單克隆病毒傳3代后的毒價(jià)提高了8.6倍。
文檔編號(hào)C12N7/02GK102206614SQ201110114800
公開日2011年10月5日 申請(qǐng)日期2011年5月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月5日
發(fā)明者李俊輝, 李延濤, 杜久斌, 賀筍 申請(qǐng)人:新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司