專利名稱：兔小腸上皮細胞系及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬生物技術領域，確切地說是兔小腸上皮細胞系及其制備方法。
背景技術：
小腸是體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)選擇性消化吸收的重要部位，整個胃腸道的吸收90%發(fā)生在小腸。小腸粘膜上皮是高度動力學系統(tǒng)，反映了重要的生物學現(xiàn)象，如細胞的增殖、遷移、分化和凋亡等。小腸上皮細胞antestinal epithelial cells, IEC)是腸道消化吸收的專職細胞，維持著整個絨毛上皮的代謝更新。由于小腸粘膜上皮細胞表面密集大量的微絨毛， 有利于酶的活動及營養(yǎng)物質(zhì)的吸收；除此以外IEC還主要參與了腸道內(nèi)外分泌和免疫屏障等功能。腸上皮細胞是研究細胞增殖和分化調(diào)控機制及藥物的轉(zhuǎn)運和代謝的理想模型。因此，體外培養(yǎng)小腸上皮細胞對于研究IEC的生理功能、營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收機制、藥物作用下的病理及生理改變都具有重要意義。目前，盡管人和家禽小腸上皮細胞的培養(yǎng)已經(jīng)獲得成功，但是國內(nèi)未見有關兔腸道細胞培養(yǎng)的詳細報道，國外對兔腸上皮細胞分離培養(yǎng)的研究也較少，主要是關于結腸上皮細胞的培養(yǎng)，該細胞的轉(zhuǎn)運特性，酶的表達以及跨膜電阻等指標相對更能反映結腸細胞而非小腸細胞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供兔小腸上皮細胞系，建立兔小腸上皮細胞體外培養(yǎng)模型，用于體外研究兔小腸營養(yǎng)機制及抗營養(yǎng)機制的研究。兔小腸上皮細胞系，它來源于新生未哺乳日本大耳白仔兔回腸，保藏編號=CGMCC No.4784。兔小腸上皮細胞系的制備方法1)取新生未哺乳日本大耳白仔兔斷頸處死，置于75%酒精中浸泡消毒5min，無菌剖開腹腔，取出回腸段并去除周邊結締組織，PBS洗滌數(shù)次，以除去腸內(nèi)容物；縱向剖開腸道，用PBS洗滌數(shù)次，將腸段剪碎，400g離心5min。棄上清，膠原酶IV消化液重懸沉淀并轉(zhuǎn)移到6孔培養(yǎng)板內(nèi)，370C，飽和濕度，5% CO2環(huán)境孵育過夜，500g離心5min ；棄上清，PBS洗滌3次，細胞生長培養(yǎng)基(DMEM/F12+5% FBS)重懸細胞和組織，并移至6孔板中；37°C，5% CO2，飽和濕度環(huán)境培養(yǎng)；2)采用相差消化法和相差貼壁法相結合的方法，在細胞傳代時先用胰酶消化后在倒置顯微鏡下觀察，當大部分成纖維細胞變小漂浮上來，吸去培養(yǎng)液，用PBS清洗后再次用胰酶消化，此時消化下來的細胞大部分是小腸上皮細胞；在單細胞懸液接種后1. 5h后將上清轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)瓶中，此瓶中大部分為上皮細胞；如此反復幾次，以去除成纖維細胞， 得到純化的兔小腸上皮細胞；然后通過單克隆方式對上述純化細胞進一步純化。本發(fā)明提供的兔小腸上皮細胞系，取新生未哺乳仔兔回腸段，機械剪碎，膠原酶IV 消化，獲得原代培養(yǎng)的兔小腸上皮細胞，聯(lián)合應用相差消化法和相差貼壁法對兔小腸上皮細胞進行初步；然后應用單克隆方法進一步純化，得到的細胞株生長狀態(tài)良好，穩(wěn)定；細胞形狀規(guī)則，成鋪路石狀，角蛋白8鑒定結果為陽性；經(jīng)過繼代培養(yǎng)，篩選獲得的一株細胞系， 繼代培養(yǎng)一直穩(wěn)定。免小腸上皮細胞系，來源于新生未哺乳的日本大耳白兔回腸段，保藏編號CGMCCNo. 4784。小腸是營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的主要場所，小腸上皮細胞是吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要功能性細胞，兔小腸上皮細胞體外培養(yǎng)模型的建立，可用于腸道內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)吸收通路，抗營養(yǎng)物質(zhì)的作用，微生態(tài)營養(yǎng)，細胞間的信號轉(zhuǎn)導以及隱窩-絨毛系統(tǒng)中各種細胞增殖和分化機制等的研究。


圖1為膠原酶消化法分離得到的IEC照片(X 100)；圖2為成纖維細胞與上皮細胞混雜生長照片(X 100)；圖3為純化的兔IEC照片(X 100)；圖4為純化的兔IEC照片(X400)；圖5為角蛋白8抗體鑒定陽性照片(X400)；圖6為角蛋白8抗體陰性對照片(X400)；圖7為原代培養(yǎng)新生仔兔IEC生長曲線圖。
具體實施例方式實施例1實驗動物新生未哺乳的日本大耳白兔，購于吉林大學實驗動物中心。儀器及試劑 二氧化碳培養(yǎng)箱(SELECTA，西班牙)，倒置顯微鏡(Olympus，日本)，超凈臺 (SANYO,日本)，高壓蒸汽滅菌鍋(SANYO，日本)，鼓風干燥箱(上海申賢恒溫設備廠)，96 孔細胞培養(yǎng)板(COSTAR)DMEM/F12培養(yǎng)基(GIBC0)，胎牛血清(PAA)，細胞角蛋白8單克隆抗體，DAB顯色試劑盒購自武漢博士德公司，谷氨酰胺，胰蛋白酶均為AMRESC0產(chǎn)品，膠原酶 IV，青霉素，鏈霉素均為Sigma產(chǎn)品。1)兔IEC分離及培養(yǎng)新生未哺乳仔兔斷頸處死，置于75%酒精中浸泡消毒5min，無菌剖開腹腔，取出小腸回腸段并去除周邊結締組織，PBS洗滌數(shù)次，以除去腸內(nèi)容物；縱向剖開腸道，用PBS洗滌數(shù)次，將腸段剪碎，400g離心5min。棄上清，膠原酶IV消化液重懸沉淀并轉(zhuǎn)移到6孔培養(yǎng)板內(nèi)，370C，飽和濕度，5% CO2環(huán)境孵育過夜，500g離心5min，棄上清，PBS洗滌3次，細胞生長培養(yǎng)基(DMEM/F12+5% FBS)重懸細胞和組織，并移至6孔板中。37°C，5% C02，飽和濕度環(huán)境培養(yǎng)。成纖維細胞與上皮細胞混雜生長顯微鏡(X100)下照片，見圖2。2)兔IEC的純化采用相差消化法和相差貼壁法相結合的方法，在細胞傳代時先用胰酶消化后在倒置顯微鏡下觀察，當大部分成纖維細胞變小漂浮上來，吸去培養(yǎng)液，用PBS清洗后再次用胰酶消化，此時消化下來的細胞大部分是小腸上皮細胞；在單細胞懸液接種后1. 5h后將上清轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)瓶中，此瓶中大部分為上皮細胞。如此反復幾次，以去除成纖維細胞，得到純化的小腸上皮細胞。在倒置顯微鏡下觀察細胞在2-3d貼壁并有少量遷出，6-8d明顯增殖，見圖l，9-lld細胞匯合成片。純化的IEC生長狀態(tài)如圖3，上皮細胞呈多角形或卵圓形， 細胞緊密連接，邊界清晰。3)單克隆繼代篩選取初步純化的細胞，吸去培養(yǎng)液，用PBS清洗后再次用胰酶消化，細胞變圓時加入生長培養(yǎng)基，輕輕吹打，使細胞脫落。取適量細胞懸液進行細胞計數(shù)。調(diào)整細胞濃度為IO3 個/ml。并用有限稀釋法在96孔板中梯度稀釋。直到獲得單個細胞為止。37°C、5%C02、 飽和濕度培養(yǎng)并定期觀察。選擇單細胞生長的孔繼續(xù)培養(yǎng)。獲得一株單細胞生長集落，并進行繼代培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)基組成DMEM/F12+5%fetal bovine serum ；pH 7. 04 ；37°C。經(jīng)繼代培養(yǎng)后，獲得1株(RIEC-311)，經(jīng)傳代培養(yǎng)50代后生長狀態(tài)仍然良好、穩(wěn)定、分裂速度快，沒發(fā)現(xiàn)退化和癌變現(xiàn)象，照片如圖4，并于2011年04月沈日，送交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏中心登記入冊編號=CGMCC No. 4784。 保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所。實施例2采用MTT法進行生長曲線的測定。將生長狀況良好的IEC懸液接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，接種密度為1 X IO5個/ mL,每孔200 μ L，每天6個重復，連續(xù)測定7天。每天向待測的每孔細胞中加入20 μ LMTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h后終止培養(yǎng)，吸除培養(yǎng)液，每孔加入150 μ LDMSO震蕩lOmin，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定OD57tl值?？瞻渍{(diào)零孔中只加培養(yǎng)液，不加細胞。IEC生長曲線見圖7.實施例3細胞角蛋白8單克隆抗體鑒定將細胞爬片放入4%的多聚甲醛固定lh，然后PBST漂洗3次，每次5min。用檸檬酸修復液修復10min，95°C，3%過氧化氫的水溶液處理lOmin，以消除內(nèi)源性的過氧化物酶，BSA封閉30min，蒸餾水漂洗3次，每次5min，加入抗角蛋白抗體孵育30min。加入羊抗鼠 IgG抗體，37°C孵育30min。再加入顯色劑，顯色lOmin。其中每步驟結束后都用PBST漂洗 3次，每次5min。純化IEC用細胞角蛋白8單克隆抗體鑒定，結果呈現(xiàn)陽性，見圖5，細胞呈褐色排列，該結果顯示所獲得的細胞是小腸上皮細胞。陰性對照組IEC沒被染色，見圖6。
權利要求
1.兔小腸上皮細胞系，其特征在于它來源于新生未哺乳日本大耳白兔回腸，保藏編號CGMCC No. 4784。
2.兔小腸上皮細胞系的制備方法1)取新生未哺乳日本大耳白兔斷頸處死，置于75%酒精中浸泡消毒5min，無菌剖開腹腔，取出回腸段并去除周邊結締組織，PBS洗滌數(shù)次，以除去腸內(nèi)容物；縱向剖開腸道，用 PBS洗滌數(shù)次，將腸段剪碎，400g離心5min。棄上清，膠原酶IV消化液重懸沉淀并轉(zhuǎn)移到6 孔培養(yǎng)板內(nèi)，370C，飽和濕度，5% CO2環(huán)境孵育過夜，500g離心5min，棄上清，PBS洗滌3次， 細胞生長培養(yǎng)基(DMEM/F12+5% FBS)重懸細胞和組織，并移至6孔板中；37°C，5% CO2，飽和濕度環(huán)境培養(yǎng)；2)采用相差消化法和相差貼壁法相結合的方法，在細胞傳代時先用胰酶消化后在倒置顯微鏡下觀察，當大部分成纖維細胞變小漂浮上來，吸去培養(yǎng)液，用PBS清洗后再次用胰酶消化，此時消化下來的細胞大部分是小腸上皮細胞；在單細胞懸液接種后1. 5h后將上清轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)瓶中，此瓶中大部分為上皮細胞；如此反復幾次，以去除成纖維細胞，得到純化的兔小腸上皮細胞；3)通過單克隆方式對上述純化細胞進一步純化。
全文摘要
本發(fā)明提供的兔小腸上皮細胞系，取新生未哺乳仔兔回腸段，機械剪碎，膠原酶IV消化，獲得原代培養(yǎng)的兔小腸上皮細胞，聯(lián)合應用相差消化法和相差貼壁法對兔小腸上皮細胞進行初步；然后應用單克隆方法進一步純化，得到的細胞株生長狀態(tài)良好，穩(wěn)定；細胞形狀規(guī)則，成鋪路石狀，角蛋白8鑒定結果為陽性；經(jīng)過繼代培養(yǎng)，篩選獲得的一株細胞系，繼代培養(yǎng)一直穩(wěn)定。兔小腸上皮細胞系，來源于新生未哺乳的日本大耳白兔回腸段，保藏編號CGMCC No.4784；可用于腸道內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)吸收通路，抗營養(yǎng)物質(zhì)的作用，微生態(tài)營養(yǎng)，細胞間的信號轉(zhuǎn)導以及隱窩-絨毛系統(tǒng)中各種細胞增殖和分化機制等的研究。
文檔編號C12R1/91GK102212504SQ20111011492
公開日2011年10月12日 申請日期2011年5月5日 優(yōu)先權日2011年5月5日
發(fā)明者劉飛飛, 盧加成, 孫澤威, 張春, 張海全, 楊連玉, 秦貴信, 程傳鋒, 穆成龍, 趙元, 趙晗, 車東升, 鮑男 申請人:吉林農(nóng)業(yè)大學