專利名稱：一株耐酸酵母及其代謝工程構(gòu)建產(chǎn)l-乳酸重組菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株耐酸酵母的篩選，以及產(chǎn)L-乳酸重組菌的構(gòu)建方法，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
乳酸(Lactic acid)是一種重要的有機(jī)酸，廣泛地存在于人體、動(dòng)物、植物和微生物中。乳酸因其安全性、光學(xué)特性及其特殊的分子結(jié)構(gòu)被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化妝品等工業(yè)。乳酸分子內(nèi)含有一個(gè)不對(duì)稱的C原子，存在光學(xué)異構(gòu)現(xiàn)象，具有D-型和L-型兩種。由于人體只能利用L (+)-乳酸，因此世界衛(wèi)生組織提倡在食品及醫(yī)藥行業(yè)使用L (+)-乳酸取代目前普遍使用的DL (+)-乳酸；另外L-乳酸的一個(gè)重要用途為合成聚乳酸，聚乳酸因可以由可再生資源生產(chǎn)并能被生物所降解而被認(rèn)為是最有發(fā)展前景的聚合物之一。L-乳酸的主要生產(chǎn)方法為微生物發(fā)酵法?，F(xiàn)國(guó)內(nèi)外研究的L-乳酸生產(chǎn)菌主要集中在乳桿菌、Lac tobacillus )、芽孢桿菌(Macillus )、乳球菌Uac tococcus )和根霉 0%辦0/7狀)。在乳酸發(fā)酵過程中，pH值會(huì)隨著乳酸的生成而逐漸降低，由于細(xì)菌和根霉菌耐酸性較差，當(dāng)發(fā)酵液處于酸性時(shí)將影響菌株的生長(zhǎng)和發(fā)酵能力。因此，工業(yè)上乳酸發(fā)酵過程常采用CaCO3作為中和劑，以維持最適pH值。但是乳酸鈣結(jié)晶細(xì)小，結(jié)晶過程不易控制， 30%乳酸鈣殘留在結(jié)晶母液中，不能結(jié)晶出來，大量的副產(chǎn)物(石膏)會(huì)造成環(huán)境污染，成為乳酸生產(chǎn)企業(yè)三廢處理的關(guān)鍵點(diǎn)和難點(diǎn)。相對(duì)于細(xì)菌和霉菌，酵母菌具有更好的耐酸特性，因此國(guó)內(nèi)外研究者將研究重點(diǎn)逐漸轉(zhuǎn)為利用基因工程方法改造遺傳背景清晰的釀酒酵母，使其能夠生產(chǎn)乳酸。雖然重組菌株在較高的酸性條件下能夠生存和生長(zhǎng)，但產(chǎn)乳酸能力普遍不強(qiáng)。Adachi E等人研究的重組產(chǎn)乳酸酵母在PH 3. 5時(shí)乳酸的最終產(chǎn)量?jī)H為在pH 4. 5時(shí)的60%(Adachi Ε, Torigoe Μ, Sugiyama Μ, et al. Modification of metabolic pathways of Saccharotnyces cerevisiae by the expression of lactate dehydrogenase and deletion of pyruvate decarboxylase genes for the lactic acid fermentation at low pH value. J Ferment Bioeng, 1998，86(3) : 284-289. )0之后，Skory CD所研究構(gòu)建的重組產(chǎn)乳酸酵母的最適PH值為5.0，當(dāng)發(fā)酵液pH值低于5. O時(shí)，乳酸產(chǎn)量將有所降低(Skory CD. Lactic acid production by Saccharomyces cerevisiae expressing a Rhizopus oryzae lactate dehydrogenase gene. J Ind Microbiol Biotechnol (2003) 30: 22 - 27.)。因此后來研究者在利用重組產(chǎn)乳酸酵母進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，在發(fā)酵液中還是需要加入一定量的中和劑調(diào)節(jié)發(fā)酵液PH值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為克服上述乳酸生產(chǎn)菌耐酸性不強(qiáng)的缺點(diǎn)，篩選出一株耐高濃乳酸且不利用乳酸的耐酸酵母菌株，在此基礎(chǔ)上通過代謝工程改造，增加該菌株的乳酸代謝途徑，使其能夠在較低PH值下正常發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸。
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為
一株能夠在以乳酸調(diào)節(jié)PH到2. 5的培養(yǎng)環(huán)境中生長(zhǎng)但不利用乳酸的菌株，命名為木蘭假絲酵母C4 {Candida magnoliae C4)，已在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號(hào)為 CCTCC NO :M2010362。一株木蘭假絲酵母C42 {Candida magnoliae C42)，其為對(duì)所述的木蘭假絲酵母 C4進(jìn)行基因重組，獲得木蘭假絲酵母C42具有在低pH條件下發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的性能。所述的木蘭假絲酵母C42，在于將來源于米根霉As3. 819的乳酸脫氫酶編碼基因 IdhA插入含有G418抗性基因的酵母穿梭載體，構(gòu)建了重組質(zhì)粒p^(212-h/7MX-A/AA，并電轉(zhuǎn)化入木蘭假絲酵母C4中，得到木蘭假絲酵母C42。( 1)耐酸酵母菌株的篩選
稱取5 g自然樣品(采集自無錫市太湖邊的土樣)，加至含100 mL無菌生理鹽水及玻璃珠的三角瓶中，在30°C下，150 r/min振蕩打散30 min ；樣品懸液用無菌生理鹽水進(jìn)行系列稀釋，選擇適合的稀釋度，分別涂布于YEPD平板，30°C培養(yǎng)5 7 d，觀察菌落生長(zhǎng)情況，并將新長(zhǎng)出的形態(tài)上有差異的單菌落挑出。從分離得到的單菌落中挑取典型的酵母菌落分別接種于以乳酸調(diào)節(jié)PH值至4的YEPD液體培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)48 h。選擇生長(zhǎng)較好的酵母菌株依次接入含有93.5 g/L乳酸的篩選培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h，選擇出長(zhǎng)勢(shì)最好一株耐酸酵母，命名為C4。通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，此耐酸酵母的分類地位屬于木蘭假絲酵母 Candida magnoliae {C. magnoliae)，在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號(hào)為CCTCC NO :M 2010362。(2)米根霉As3. 819的乳酸脫氫酶編碼基因、lcM)的獲得
提取米根霉As3. 819的染色體DNA，以其為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所用引物如下 Rl 5' -CGCGGATCCATGGTATT ACACTCA-3‘ R2 5' -CCGAAGCTTTCAACAGCTACTTTTA-3‘
PCR方法如下50 “1^反應(yīng)體系中加入1011111101/1的引物1 1和1 2各1 yL，2mmol/ L 的 dNTP 5 μ L, 10 XExTaq Buffer 5 μ L，5 U/ μ L 的 ExTaq DNA 聚合酶 0.5 μ L,模板 1 μ L，加雙蒸水補(bǔ)齊50 μ L ;PCR擴(kuò)增條件95°C預(yù)變性5 min ;94°C變性30 s、55°C退火60 s、72°C延伸60 s，共30個(gè)循環(huán)最后72°C延伸10 min。通過瓊脂糖凝膠電泳分析純化反應(yīng)產(chǎn)物，在加樣泳道出現(xiàn)目標(biāo)條帶，用PCR片段回收試劑盒回收出1.01Λ的目標(biāo)片段；純化好的目標(biāo)片段經(jīng)I和歷^d III雙酶切，用 PCR片段回收試劑盒回收；p^(212-h/7MX經(jīng)過I和歷/ d III雙酶切，用PCR片段回收試劑盒回收；用T4連接酶連接兩酶切純化好的片段，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后涂布含30 μ g/mL卡那霉素的LB瓊脂平板，37°C培養(yǎng)過夜；隨機(jī)挑選6個(gè)菌落， 接種于30mL含30 μ g/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，通過及I和 HinA III雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽(yáng)性克隆，陽(yáng)性重組子保存在含有15%甘油的LB培養(yǎng)基中，冷凍保存于_70°C ；重組質(zhì)粒命名為兒陽(yáng)性重組子命名為JM109/
兒重組耐酸酵母命名為C42 ； (3)重組耐酸酵母C42的構(gòu)建
取一支冷凍保存的JM109/pYX212-h/ MX-A/A兒接種于30 mL含30 μ g/mL卡那霉素的 LB培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化野生型耐酸酵母C magnoliae,堵化子涂布于含800 μ g/mL G418抗生素的YEPD平板(G418抗性平板)，于30°C、培養(yǎng)2天； 長(zhǎng)出的菌落重新劃線至G418抗性平板，長(zhǎng)出菌落初步確定為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，再通過菌落PCR， 驗(yàn)證重組質(zhì)粒miU-karm-ldhA已經(jīng)轉(zhuǎn)化入耐酸酵母C ffl^/^/iae，再將此重組菌進(jìn)行細(xì)胞破碎，細(xì)胞破碎液稀釋適當(dāng)濃度后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，驗(yàn)證外源乳酸脫氫酶基因已經(jīng)在耐酸酵母C ffl^T^/iae中得到表達(dá)。G418是一種與慶大霉素相關(guān)的氨基糖苷，是一種硫酸新霉素的類似物，其會(huì)干擾 80 S核糖體的功能以及真核細(xì)胞中的蛋白質(zhì)合成，通常用作真核細(xì)胞(酵母菌)的選擇試劑。為高效挑選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，本發(fā)明將編碼G418抗性的插入載體ρ (212，構(gòu)建了載體 p^(212-々a/7MX。游離型表達(dá)載體諷2\2-kanWk-ldhA是將IdhA插入至載體ρ (212上啟動(dòng)子TPI 的下游，使其在載體12-kanWk上進(jìn)行表達(dá)?；騃dhA的獲得，載體12~kanWk-ldhA 的構(gòu)建，基因IdhA在耐酸酵母中的表達(dá)詳見實(shí)施例。該重組耐酸酵母能檢測(cè)到乳酸脫氫酶(LDH)酶活，成功將A/似在耐酸酵母中表達(dá)，且異源基因的表達(dá)對(duì)酵母的生長(zhǎng)沒有影響，能以葡萄糖為底物進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵48 h后， 發(fā)酵液中能檢測(cè)到L-乳酸。(4)用構(gòu)建的重組耐酸酵母C42發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸以葡萄糖為底物的發(fā)酵詳見實(shí)施例。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明為在自然界樣品中篩選具有耐乳酸能力的酵母菌株， 通過代謝工程改造使其在低PH條件下具有較強(qiáng)的L-乳酸生產(chǎn)能力，L-乳酸產(chǎn)量達(dá)到42 g/L以降低產(chǎn)酸時(shí)中和劑的用量，節(jié)約成本，此研究結(jié)果在國(guó)內(nèi)外尚無報(bào)道。利用G418抗性平板選擇有本發(fā)明構(gòu)建的載體m2\2-hmWl-ldM的耐酸酵母，即重組耐酸酵母。通過培養(yǎng)重組耐酸酵母，來檢測(cè)發(fā)酵液中L-乳酸的含量。培養(yǎng)選擇在250 mL搖瓶上進(jìn)行，培養(yǎng)分兩階段，第一階段主要用于酵母的生長(zhǎng)，第二階段主要用于產(chǎn)物合成；可以用高效液相色譜來檢測(cè)L-乳酸，可以用SDS-PAGE檢測(cè)異源蛋白的表達(dá)情況。依次對(duì)重組菌C42發(fā)酵條件發(fā)酵培養(yǎng)基初始糖濃度、發(fā)酵培養(yǎng)基初始PH值、發(fā)酵培養(yǎng)前期不同靜置時(shí)間、發(fā)酵時(shí)不同接種量進(jìn)行初步優(yōu)化，獲得L-乳酸產(chǎn)量達(dá)到42 g/L。生物材料樣品保藏一株能夠在以乳酸調(diào)節(jié)PH到2. 5的培養(yǎng)環(huán)境中生長(zhǎng)但不利用乳酸的菌株，命名為木蘭假絲酵母C4 (.Candida magnoliae C4)，已在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心簡(jiǎn)寫CCTCC，地址中國(guó)武漢武漢大學(xué)，保藏日期為 2010 年 12 月 22 日，保藏編號(hào)為 CCTCC NO :M2010362。


圖1 DNAman軟件繪制耐酸酵母菌株的同源樹圖 2 質(zhì)粒 pYX212-h/7MX
圖 3 質(zhì)粒 pYX212-h/7MX-A/似
圖4質(zhì)粒pYX212-h/7MX-A/似的驗(yàn)證
Lanel 載體 pYX212-h/7MXI 酶切；
Lane2重組質(zhì)粒》TL2\2-kanm-ldhA PCR擴(kuò)增A/似驗(yàn)證；
Lane3 重組質(zhì)粒pYX212-h/7MX-A/似及I和歷/ d III雙酶切；Lane4 重組質(zhì)粒 pYX212-h/7MX-A/似及I 酶切； λ DNA/Ai I marker。圖5重組耐酸酵母的SDS-PAGE分析 Lanel耐酸酵母C magnoliae ；Lane2, Lane3重組耐酸酵母；Lane4蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)
圖6不同初始糖濃度對(duì)重組耐酸酵母C42發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的影響20 g/ L( ■ ) ；60 g/L( · ) ；100 g/L( ▲ ) ；140 g/L ( ) ；180 g/L ( * ) ；200 g/L(
.·圖7不同初始pH值對(duì)重組耐酸酵母C42發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的影響pH2.5( ■)； ρΗ3· 0 ( · ) ；ρΗ3· 5( A ) ；ρΗ4· 0 ( ) ；ρΗ7· ()(★)。圖8不同靜置培養(yǎng)時(shí)間對(duì)重組耐酸酵母C42發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的影響用于生長(zhǎng)菌體的通風(fēng)培養(yǎng)時(shí)間 0 h(_) ;8 h(·) ；16 h( A) ；24 h( ) ；32 h(*) ； 40 h( ·')
圖9不同接種量對(duì)重組耐酸酵母C42發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的影響以接種后發(fā)酵液菌濃為標(biāo)記 OD600=S、舊)',OD600=IQ ( · ) -,OD600=lh{ L· ) ’ 0 _=20(· ) ’ Ο _=25( ·)
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 耐酸酵母菌株C4的篩選
稱取5 g自然樣品(采集自無錫市太湖邊的土樣)，加至含100 mL無菌生理鹽水及玻璃珠的三角瓶中，在30°C下，150 r/min振蕩打散30 min ；樣品懸液用無菌生理鹽水進(jìn)行系列稀釋，將稀釋倍數(shù)為10_7的稀釋液涂布于YEPD平板，30°C培養(yǎng)5 7 d，觀察菌落生長(zhǎng)情況， 并將新長(zhǎng)出的形態(tài)上有差異的單菌落挑出。從分離得到的單菌落中挑取典型的酵母菌落分別接種于以乳酸調(diào)節(jié)PH值至4的YEPD液體培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)48 h。選擇生長(zhǎng)較好的酵母菌株依次接入含有93. 5g/L乳酸的篩選培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h，選擇出長(zhǎng)勢(shì)最好一株耐酸酵母，命名為C4。實(shí)施例2 耐酸酵母菌株C4的鑒定 1)形態(tài)特征
細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察取耐酸菌株培養(yǎng)至平衡期后分別移接于YEPD培養(yǎng)基中，25°C下培養(yǎng) 3天后進(jìn)行其細(xì)胞形態(tài)特征和繁殖方式觀察。酵母群體形態(tài)觀察取待鑒定菌株培養(yǎng)至平衡期后分別移接于YEPD培養(yǎng)基中，25°C下培養(yǎng)3天后進(jìn)行平板菌落形態(tài)觀察。耐酸酵母的菌落形態(tài)特征為單菌落直徑2 mm，呈白色不透明乳脂狀，飽滿，邊緣光滑，有光澤，表面凸起，較粘稠，菌落顏色和質(zhì)地都比較均一；細(xì)胞形態(tài)特征為細(xì)胞呈卵形或球形，多邊芽殖。2)分子生物學(xué)鑒定
酵母DNA的提取方法參照分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，所用引物為真菌ITS通用引物， 上游 ITS1:5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3‘， 下游 ITS4:5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3‘； PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如下
AACCTGCGGA AGGATCATTT CTGAACAACC TTTGCATAGT GAACAACCTC TACGGGGGTG 60 AATGCTTCCG GTTCGCCGGA CAACAACTAG TAATTTTGAA TCTGATACGT TAAAGAAAAA 120 CTTTCAACAA CGGATCTCTT GGTTCTCGCA TCGATGAAGA ACGCAGCAAA GCGCGATAGG 180TAATGCGAAT TGCAGACGTG AGTCATTGAA TCTTTGAACG CACATTGCGC CAGTTTACTG 240 GCATACTGCG TTGAGCGTCG GCCTTCCTCC ACAGGTATTG CTGTTTGCAA CAGTCAAAGG 300 CATGGAAGCG CACCCGTTAG TAAAACGGTG CAAAACCACA340
將所得序列在核酸序列數(shù)據(jù)(GenBank)中進(jìn)行同源序列搜索，將相關(guān)酵母菌種的ITS 區(qū)域序列與待測(cè)菌株序列一起，繪制同源樹(homology trees)，顯示供試菌株與序列數(shù)據(jù)庫(kù)中已知酵母菌的親源關(guān)系，如附圖1所示。3)生理生化鑒定
同化氮(碳)源試驗(yàn)將新鮮的待測(cè)酵母菌株用無菌水洗滌后，涂布于同化氮(碳)源固體培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)2-3 d，觀察菌落生長(zhǎng)情況，結(jié)果如表1所示。表1菌株C4的生理生化特征
權(quán)利要求
1.一株能夠在以乳酸調(diào)節(jié)PH到2. 5的培養(yǎng)環(huán)境中生長(zhǎng)但不利用乳酸的菌株，命名為木蘭假絲酵母C4 {Candida magnoliae C4)，已在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號(hào)為 CCTCC NO :M2010362。
2.一株木蘭假絲酵母magnoliae C42)，其特征在于對(duì)權(quán)利要求1所述的木蘭假絲酵母C4進(jìn)行基因重組，獲得木蘭假絲酵母C42具有在低pH條件下發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的性能。
3.權(quán)利要求2所述的木蘭假絲酵母C42，其特征在于將來源于米根霉As3.819的乳酸脫氫酶編碼基因7^/似插入含有G418抗性基因的酵母穿梭載體，構(gòu)建了重組質(zhì)粒 p^(212-h/7MX-A/AA，并電轉(zhuǎn)化入木蘭假絲酵母C4中，得到木蘭假絲酵母C42。
全文摘要
一株耐酸酵母及其代謝工程構(gòu)建產(chǎn)L-乳酸重組菌的方法，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明篩選分離得到一株能在pH2.5條件下生長(zhǎng)且不利用乳酸的酵母，鑒定為木蘭假絲酵母C4(CandidamagnoliaeC4)，在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號(hào)為CCTCCNOM2010362；將來源于米根霉As3.819的乳酸脫氫酶編碼基因(ldhA)插入含有G418抗性基因的酵母穿梭載體，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pYX212-kanMX-ldhA；電轉(zhuǎn)化入木蘭假絲酵母C4中，得到一株具有產(chǎn)L-乳酸能力的重組菌株木蘭假絲酵母C42，其產(chǎn)乳酸量達(dá)到42g/L。本發(fā)明所構(gòu)建的木蘭假絲酵母C42具有耐乳酸的明顯優(yōu)勢(shì)，在生產(chǎn)中可以大幅度降低中和劑CaCO3的用量，減少環(huán)境污染。
文檔編號(hào)C12N15/81GK102199553SQ20111011678
公開日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2011年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月6日
發(fā)明者丁重陽(yáng), 張勤, 張梁, 李由然, 王正祥, 石貴陽(yáng), 顧正華 申請(qǐng)人:江南大學(xué)