專利名稱：一種表達(dá)載體及其構(gòu)建和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子遺傳學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是一種表達(dá)載體及其構(gòu)建和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
具有優(yōu)良性狀的良種家畜一直是畜牧業(yè)的重要資源，但是優(yōu)良性狀的培育是一個(gè)漫長(zhǎng)的過(guò)程，而且不確定因素還很多。通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以定向、快速的培育良種家畜的優(yōu)良性狀，2006年8月，世界第一個(gè)利用轉(zhuǎn)基因羊乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)的人藥重組蛋白在歐洲獲得上市，它標(biāo)志著轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是可以為人類服務(wù)的。目前，世界各國(guó)紛紛加大投資和研發(fā)力度，力求在轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)的激烈國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)中取得領(lǐng)先，中國(guó)也啟動(dòng)了“轉(zhuǎn)基因重大專項(xiàng)”，可見轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)成為我國(guó)和世界研究和發(fā)展的熱點(diǎn)。轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)需要通過(guò)載體來(lái)導(dǎo)入外源DNA，為了從眾多的非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中篩選出轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，幾乎所有的導(dǎo)入載體都帶有標(biāo)記基因，對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)的應(yīng)用等方面存在潛在的安全隱患，限制了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物安全證書的申請(qǐng)。Cre酶可以識(shí)別兩段Loxp序列，如果同一段DNA上兩個(gè)Loxp序列方向一致，Cre 酶會(huì)將兩個(gè)Loxp序列間的DNA切除。目前將cre-loxp系統(tǒng)應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因的方式，是將Cre 酶和Ioxp系統(tǒng)分開轉(zhuǎn)染，增加了工作量，同時(shí)，由于Cre/Loxp系統(tǒng)的可逆性，降低了細(xì)胞轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的成功率。由此可見，上述現(xiàn)有的表達(dá)載體在結(jié)構(gòu)與使用上，顯然仍存在有不便與缺陷，而亟待加以進(jìn)一步改進(jìn)。為了解決現(xiàn)有的表達(dá)載體存在的問(wèn)題，本發(fā)明人基于從事此類技術(shù)研究多年豐富的實(shí)務(wù)經(jīng)驗(yàn)及專業(yè)知識(shí)，并配合學(xué)理的運(yùn)用，積極加以研究創(chuàng)新，以創(chuàng)設(shè)一種新型結(jié)構(gòu)的表達(dá)載體，以改進(jìn)一般現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體存在的缺陷，使其更具有實(shí)用性。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種表達(dá)載體，增加了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的安全性。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案一種表達(dá)載體，在線性化載體的非目的基因的兩端加入Loxp序列，同時(shí)引入誘導(dǎo)表達(dá)啟動(dòng)子組分，啟動(dòng)Cre酶的表達(dá)。進(jìn)一步，所述表達(dá)載體包括Ptight (bp 33-348)選擇性啟動(dòng)子，由Tet-On Advanced蛋白亞基與四環(huán)素類似物共同啟動(dòng)；Cre (bp 371-1402)表達(dá)Cre酶，識(shí)別兩段Loxp序列，并發(fā)生同源重組；SV40 PolyA (bp 1403-1603)多聚腺苷酸信號(hào)；LoxP (bp 1619-1652)、(bp 1690-1723)，Cre 酶識(shí)別序列；MCS(bp 1654-1689)多克隆位點(diǎn)，用于插入目的基因；CMV 啟動(dòng)子(bp 1829-2429)，啟動(dòng) Tet-On Advanced、TK、DsRed 的表達(dá)；
Tet-On Advanced (bp 2381-3124)表達(dá)Tet-On Advanced蛋白亞基，在四環(huán)素的共同作用下，可以激活Ptight啟動(dòng)子，啟動(dòng)Cre酶轉(zhuǎn)錄和表達(dá)；T2A 序列(bp 3134-3193)； TK胸苷激酶(bp 3194-4324)，使丙氧鳥苷三磷酸化，抑制DNA聚合酶活性；IRES 序列(bp 4357-4941)；DsRed2 (bp 4961-5638)紅色熒光蛋白基因，選擇標(biāo)記基因；Psv40啟動(dòng)子(bp 65514-6784)，啟動(dòng)抗性基因的表達(dá)；KanR/NeoR(bp 6867-7661)是卡那霉素和新霉素的抗性基因；HSV TK PolyA (bp 7897-7915)多聚腺苷酸信號(hào)。進(jìn)一步，所述表達(dá)載體的序列如序列表SEQ =ID NO 1所示。本發(fā)明的另一目的為提供一種上述表達(dá)載體的構(gòu)建方法。其技術(shù)方案如下一種表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟1)合成IoxP-MCS-IoxP序列，并通過(guò)EcoRI和SalI酶切連接到pDsRed2_l質(zhì)粒， 得到的質(zhì)粒命名為pDsRed-LoxP ；2)從pIRES2-EGFP上通過(guò)PCR得到CMV啟動(dòng)子，在引物的兩端引物Sal I和Asp 718 I酶切位點(diǎn)，命名為Pcmv;3)將PCR所得片段經(jīng)酶切后連接到pDsRed-LoxP質(zhì)粒中，得到pDsRed-LoxP-CMV 質(zhì)粒；4)對(duì)已知質(zhì)粒查詢，獲得Tet-On Advanced組件、TK基因和IRES序列，并在Tet-On Advanced和TK基因之間引入T2A多肽，并在整體片段的兩端設(shè)計(jì)Asp718 I和BamH I酶切位點(diǎn)，命名為Tet-On TK ；5)將步驟4中所合成基因片段雙酶切后連接到pDsRed-Loxp-CMV質(zhì)粒中，命名為 pTet-On RL 質(zhì)粒；6)查詢GeneBank中Cre酶基因，通過(guò)密碼子優(yōu)化后并在兩端加入EcoR I和Xba I酶切位點(diǎn)，合成后命名為Cre ；7)將步驟6合成的Cre酶基因經(jīng)EcoR I和Xba I雙酶切，連接到pTRE_Tight質(zhì)粒中，經(jīng)Xho I單酶切后得到的片段命名為Ptight-Cre ；8)將質(zhì)粒pTet-On RL用Xho I單酶切后，與Ptight-Cre片段連接，得到名稱為 pTRE Tet-On RL 的質(zhì)粒。本發(fā)明還提供了一種上述表達(dá)載體的應(yīng)用。增加了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的安全性。其技術(shù)方案如下上述載體在制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的應(yīng)用。進(jìn)一步，所述表達(dá)載體在制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的應(yīng)用包括如下步驟a.基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞，表達(dá)載體連接目的基因并線性化后，轉(zhuǎn)染細(xì)胞并插入到細(xì)胞基因組中，啟動(dòng)子同時(shí)驅(qū)動(dòng)Tet-On Advanced蛋白亞基、胸苷激酶和紅色熒光蛋白基因的表達(dá)；b.轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的富集，基因轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，添加G418(氨基糖苷類抗生素)篩選；c.紅色熒光蛋白進(jìn)行二次篩選；d.轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中外源標(biāo)記基因的刪除，經(jīng)12-15天培養(yǎng)后，挑選穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光蛋白的細(xì)胞團(tuán)，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后，在培養(yǎng)液中添加強(qiáng)力霉素，強(qiáng)力霉素與Tet-On Advanced 蛋白亞基的共同作用下激活Ptight啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄表達(dá)Cre酶，Cre酶識(shí)別兩個(gè)同向Loxp序列并引起同源重組，刪除載體中非目的基因的序列，而原位點(diǎn)只保留了目的基因；e.同源重組細(xì)胞的富集，由于TK基因單獨(dú)表達(dá)不會(huì)表現(xiàn)出細(xì)胞毒性，在丙氧鳥苷 (GCV)的作用下，阻止DNA合成而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，細(xì)胞培養(yǎng)液中添加強(qiáng)力霉素后，經(jīng)傳代培養(yǎng)1-2代后加入GCV，在TK基因的作用下，未發(fā)生重組和重組刪除后又重新連接到基因組中的細(xì)胞因DNA合成受阻而死亡，得到成功轉(zhuǎn)染目的基因，同時(shí)又能成功刪除熒光蛋白和抗性基因等存在生物安全隱患的外源基因的細(xì)胞；f.然后再利用步驟e得到的外源基因的細(xì)胞用于核移植供體，從而得到無(wú)外源標(biāo)記基因的安全型轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明的表達(dá)載體，可以通過(guò)一次轉(zhuǎn)染成功之后實(shí)現(xiàn)標(biāo)記基因與抗性基因等DNA 序列的切除，同時(shí)利用TK基因的特點(diǎn)，可以將重新連接的細(xì)胞以及未發(fā)生重組刪除的細(xì)胞殺死，實(shí)現(xiàn)目的基因轉(zhuǎn)入，從而增加了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的安全性。


圖1為本發(fā)明的表達(dá)載體的構(gòu)造圖，圖中標(biāo)示了各元件的名稱和位置；圖2為本發(fā)明的表達(dá)載體連接目的基因線性化后的構(gòu)造圖；圖3為本發(fā)明的表達(dá)載體構(gòu)建過(guò)程中利用的pDsRed2-l質(zhì)粒的圖譜；圖4為本發(fā)明的表達(dá)載體構(gòu)建過(guò)程中得到的pDsRed-LoxP的圖譜；圖5為本發(fā)明的表達(dá)載體構(gòu)建過(guò)程中得到Pcmv的DNA片段圖；圖6為本發(fā)明的表達(dá)載體構(gòu)建過(guò)程中得到Tet-On TK的DNA片段圖；圖7為本發(fā)明的表達(dá)載體構(gòu)建過(guò)程中得到的pTet-On RL質(zhì)粒的圖譜；圖8為本發(fā)明的表達(dá)載體構(gòu)建過(guò)程中設(shè)計(jì)的Cre酶及酶切位點(diǎn)的DNA片段圖；圖9為本發(fā)明的表達(dá)載體構(gòu)建過(guò)程中Cre酶基因經(jīng)雙酶切后連接到pTRE_Tight 質(zhì)粒中的示意圖；圖10為本發(fā)明的表達(dá)載體構(gòu)建過(guò)程中得到的Ptight-Cre的DNA片段圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述，但不作為對(duì)本發(fā)明的限定。圖1為本發(fā)明的表達(dá)載體的構(gòu)造圖，圖中標(biāo)示了各元件的 名稱和位置；圖2為本發(fā)明的表達(dá)載體連接目的基因線性化后的構(gòu)造圖。如圖1和圖2所示，一種表達(dá)載體，在線性化載體的標(biāo)記基因和抗性基因的非目的基因的兩端加入Loxp序列，同時(shí)引入誘導(dǎo)表達(dá)啟動(dòng)子和TK基因組分。本發(fā)明的表達(dá)載體具體包括如下部分Ptight (bp 33-348)選擇性啟動(dòng)子，由Tet-On Advanced蛋白亞基與四環(huán)素類似物共同啟動(dòng)；Cre (bp 371-1402)表達(dá)Cre酶，識(shí)別兩段Loxp序列，并發(fā)生同源重組；SV40 PolyA (bp 1403-1603)多聚腺苷酸信號(hào)；
LoxP (bp 1619-1652 )、(bp 1690-1723)，Cre 酶識(shí)別序列；MCS(bp 1654-1689)多克隆位點(diǎn)，用于插入目的基因；CMV 啟動(dòng)子(bp 1829-2429)，啟動(dòng) Tet-On Advanced、TK、DsRed 的表達(dá)；Tet-On Advanced (bp 2381-3124)表達(dá)Tet-On Advanced蛋白亞基，在四環(huán)素的共同作用下，可以激活Ptight啟動(dòng)子，啟動(dòng)Cre酶轉(zhuǎn)錄和表達(dá)；T2A 序列(bp 3134-3193)；TK胸苷激酶(bp 3194-4324)，使丙氧鳥苷三磷酸化，抑制DNA聚合酶活性；IRES 序歹Ij (bp 4357-4941)；DsRed2 (bp 4961-5638)紅色熒光蛋白基因，選擇標(biāo)記基因；Psv40啟動(dòng)子(bp 65514-6784)，啟動(dòng)抗性基因的表達(dá)；KanR/NeoR(bp 6867-7661)是卡那霉素和新霉素的抗性基因；HSV TK PolyA (bp 7897-7915)多聚腺苷酸信號(hào)。本發(fā)明的表達(dá)載體的序列如序列表SEQ =ID NO 1所示。本發(fā)明的表達(dá)載體的構(gòu)建包括如下步驟1)合成 ioxp-MCS-ioxp 序列GAATTC 5' -ATAACTTCGTATA-ATGTATGC-TATACGAAGTTAT-3‘EcoRIACGCGT CGATCG CCCGGG CGGGCC CCGCGG GATATCMluI PVUI SmaI ApaI SacII EcoR V5' -ATAACTTCGTATA-ATGTATGC-TATACGAAGTTAT-3 GTCGACSal 1通過(guò)EcoRI和SalI酶切連接到pDsRed2-l質(zhì)粒(如圖3)，得到的質(zhì)粒命名為 pDsRed-LoxP，其圖譜如圖4所示。2)參見圖5，從pIRES2-EGFP上通過(guò)PCR得到CMV啟動(dòng)子，在引物的兩端引物Sal I和Asp718 I酶切位點(diǎn)，命名為Pcmv CMF primer :5，-CGG GTCGAC TCTTTCCTGCGTTATCCC-3，(F-Sal I)CMR primer :5，-CGC GGTACC GATCTGACGGTTCACTAAA-3，(R_Asp718I)3)將PCR所得片段經(jīng)酶切后連接到pDsRed-LoxP質(zhì)粒中，得到pDsRed-LoxP-CMV 質(zhì)粒。4)如圖6所示，經(jīng)過(guò)對(duì)已知質(zhì)粒查詢，獲得Tet-On Advanced組件、TK基因和 IRES序列，并在Tet-On Advanced和TK基因之間引入T2A多肽，并在整體片段的兩端設(shè)計(jì) Asp718I和BamH I酶切位點(diǎn)，命名為Tet-On TK，其序列如下GGTACCACCA TGTCTAGGCT GGACAAATCT AAAGTGATCA ACGGTGCTCTGGAACTCCTG AACGGTGTGG GAATCGAGGG ACTGACCACC CGCAAACTGGCCCAGAAGCT CGGTGTGGAA CAGCCCACCC TGTACTGGCA TGTGAAGAACAAACGCGCCC TGCTCGACGC TCTGCCTATC GAGATGCTCG ACAGACATCACACCCACTTT TGCCCACTCG AGGGCGAAAG CTGGCAGGAC TTCCTGAGAAACAACGCTAA ATCCTTTCGA TGTGCACTGC TCTCTCATCG AGACGGAGCTAAGGTGCACC TCGGAACCCG ACCTACCGAG AAACAGTACG AGACCCTGGA
AAACCAGCTG GCCTTCCTCT GCCAGCAGGG ATTTTCCCTG GAGAACGCACTGTATGCCCT CTCTGCTGTG GGGCATTTTA CCCTGGGCTG TGTGCTCGAGGAACAGGAAC ACCAGGTGGC TAAGGAGGAA CGGGAGACCC CCACCACCGACAGTATGCCC CCTCTGCTCC GTCAGGCCAT CGAGCTCTTC GACAGGCAGGGTGCAGAACC TGCCTTCCTG TTTGGACTGG AGCTCATCAT CTGCGGTCTGGAGAAGCAGC TCAAATGTGA ATCCGGCGGA CCAGCTGACG CACTCGACGACTTCGACCTG GACATGCTCC CTGCCGACGC TCTGGACGAC TTTGACCTGGACATGCTCCC AGCAGACGCC CTGGATGATT TCGACCTGGA CATGCTGCCTGGTGGGAGCG GAGAAGGACG AGGTAGTCTG CTCACCTGCG GGGACGTGGAGGAAAACCCA GGACCTCTGG AGATGGCAAG CTACCCAGGG CATCAGCACGCTAGTGCATT CGACCAGGCA GCTAGGTCCC GAGGACATTC TAACAGGCGAACCGCACTGA GACCAAGACG ACAGCAGGAG GCTACCGAAG TGCGACCCGAGCAGAAGATG CCTACCCTGC TCCGGGTGTA CATCGACGGG CCTCACGGGATGGGCAAAAC CACCACCACC CAGCTGCTCG TGGCACTGGG TTCCCGTGACGACATCGTGT ACGTGCCAGA ACCCATGACC TATTGGAGGG TGCTGGGAGCTAGCGAGACC ATCGCAAACA TCTACACCAC CCAGCATCGC CTGGACCAGGGAGAGATCTC CGCTGGTGAC GCAGCCGTGG TCATGACCTC TGCACAGATCACCATGGGAA TGCCCTATGC CGTGACCGAC GCTGTGCTGG CACCTCATATCGGTGGGGAG GCAGGTAGCA GTCACGCACC ACCCCCTGCA CTGACCCTCATCTTTGACCG ACATCCTATC GCTGCACTGC TCTGCTACCC AGCCGCTCGGTATCTGATGG GAAGCATGAC CCCACAGGCA GTGCTGGCTT TCGTGGCACTCATCCCACCC ACCCTGCCAG GAACCAACAT CGTGCTGGGT GCTCTCCCCGAAGACAGGCA CATCGACCGC CTGGCCAAGA GACAGCGACC TGGAGAGAGGCTGGACCTCG CTATGCTCGC AGCCATCCGG CGTGTGTACG GTCTGCTCGCCAACACCGTG CGCTATCTGC AGTGTGGCGG AAGCTGGAGA GAAGACTGGGGACAGCTCAG TGGAACCGCA GTGCCTCCAC AGGGAGCTGA GCCACAGAGTAACGCAGGAC CTCGTCCACA CATCGGCGAC ACCCTGTTCA CCCTCTTTAGGGCACCAGAG CTGCTCGCTC CAAACGGAGA CCTGTACAAC GTGTTTGCATGGGCTCTGGA CGTGCTCGCA AAGCGACTCC GTAGCATGCA TGTGTTCATCCTGGACTATG ACCAGAGTCC TGCAGGATGC AGGGACGCAC TGCTCCAGCTGACCTCCGGA ATGGTGCAGA CCCACGTGAC CACCCCAGGT TCTATCCCTACCATCTGTGA CCTCGCTCGT ACCTTTGCTC GTGAAATGGG TGAAGCCAACTAGGAATTCT GCAGATATCC ATCACACTGG CGGCCGCCCC TCTCCCTCCCCCCCCCCTAA CGTTACTGGC CGAAGCCGCT TGGAATAAGG CCGGTGTGCGTTTGTCTATA TGTTATTTTC CACCATATTG CCGTCTTTTG GCAATGTGAGGGCCCGGAAA CCTGGCCCTG TCTTCTTGAC GAGCATTCCT AGAGGAAGCAGTTCCTCTGG AAGCTTCTTG AAGACAAACA ACGTCTGTAG CGACCCTTTG CAGGCAGCGG AACCCCCCAC CTGGCGACAG GTGCCTCTGC GGCCAAAAGCCACGTGTATA AGATACACCT GCAAAGGCGG CACAACCCCA GTGCCACGTT
GTGAGTTGGA TAGTTGTGGA AAGAGTCAAA TGGCTCTCCT CAAGCGTATTCAACAAGGGG CTGAAGGATG CCCAGAAGGT ACCCCATTGT ATGGGATCTGATCTGGGGCC TCGGTGCACA TGCTTTACAT GTGTTTAGTC GAGGTTAAAAAAACGTCTAG GCCCCCCGAA CCACGGGGAC GTGGTTTTCC TTTGAAAAACACGATGATAA TATGGCCACA GGATCC 5)將步驟4中所合成基因片段雙酶切后連接到pDsRed-Loxp-CMV質(zhì)粒中，命名為 pTet-OnRL質(zhì)粒。pTet-On RL質(zhì)粒的圖譜如圖7所示。6)查詢GeneBank中Cre酶基因，通過(guò)密碼子優(yōu)化后并在兩端加入EcoR I和Xba I酶切位點(diǎn)，如下圖8所示。合成后命名為Cre，其序列如下GAATTCAGGA GGGTCTCAAT GTCTAACCTG CTCACCGTGC ATCAGAACCTGCCCGCTCTC CCCGTGGACG CTACCTCCGA CGAAGTGCGT AAAAACCTCATGGACATGTT CCGGGACCGT CAGGCCTTTA GTGAGCATAC CTGGAAGATGCTGCTCAGTG TGTGCAGGTC CTGGGCCGCT TGGTGTAAGC TGAACAACCGCAAATGGTTC CCAGCTGAGC CCGAAGACGT GAGGGACTAC CTGCTCTATCTCCAGGCCCG CGGTCTGGCT GTGAAGACCA TCCAGCAGCA TCTGGGTCAGCTCAACATGC TGCACAGGCG ATCTGGACTC CCAAGACCTA GCGACAGTAACGCCGTGAGT CTGGTGATGA GACGAATCAG AAAGGAGAAC GTGGACGCAGGCGAACGAGC CAAACAGGCC CTCGCTTTCG AGCGGACCGA CTTTGACCAAGTGCGTTCTC TGATGGAAAA CAGCGACAGG TGCCAGGACA TCCGCAACCTCGCTTTTCTG GGGATCGCAT ACAACACCCT GCTCAGGATC GCTGAGATCGCAAGGATCCG CGTGAAGGAC ATCAGCAGAA CCGACGGCGG ACGAATGCTCATCCACATCG GAAGGACCAA AACCCTCGTG AGTACCGCAG GAGTGGAGAAGGCTCTGTCC CTCGGAGTGA CCAAACTGGT GGAACGGTGG ATCTCCGTGTCTGGCGTGGC CGACGACCCT AACAACTATC TGTTCTGTAG AGTGCGAAAGAACGGAGTGG CAGCCCCAAG CGCTACCAGT CAGCTCTCCA CCAGAGCTCTGGAGGGTATC TTTGAAGCAA CCCATCGACT CATCTACGGC GCCAAAGACGACTCCGGACA GCGGTATCTG GCATGGTCTG GTCACAGCGC ACGTGTGGGAGCTGCACGAG ACATGGCACG TGCAGGAGTG AGCATCCCCG AGATCATGCAGGCTGGTGGG TGGACCAACG TGAACATCGT GATGAACTAC ATCAGAAACCTGGACAGTGA AACCGGGGCT ATGGTGCGAC TCCTGGAAGA CGGCGACTAG TCTAGA7)如圖9所示，將步驟6合成的Cre酶基因經(jīng)EcoR I和Xba I雙酶切，連接到 pTRE-Tight質(zhì)粒中，經(jīng)Xho I單酶切后得到如圖10所示的片段，命名為Ptight-Cre。8)將質(zhì)粒pTet-On RL用Xho I單酶切后，與Ptight-Cre片段連接，得到正反兩種情況的pTRE Tet-On RL質(zhì)粒，以其中一種為例，產(chǎn)物的圖譜如圖1所示。本發(fā)明的表達(dá)載體的序列如序列表SEQ =ID NO 1所示。上述表達(dá)載體在轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用，具體包括如下步驟a.基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞。載體連接目的基因并線性化后(如圖2所示)，采用 Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染細(xì)胞，6小時(shí)后換到10%血清加10ng/mlEGF和IGF生長(zhǎng)因子的培
養(yǎng)液中。
b.轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的富集?；蜣D(zhuǎn)染48小時(shí)后，添加800 μ g/ml的G418，培養(yǎng)1周后， 降低為300 μ g/ml繼續(xù)培養(yǎng)5-7天。G418會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，將未轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞殺死，轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞對(duì)G418具有抗性，能夠正常存活。c.紅色熒光蛋白二次篩選。由于Neo抗性基因的產(chǎn)物會(huì)有旁側(cè)效應(yīng)，B比鄰未轉(zhuǎn)染成功細(xì)胞也會(huì)繼續(xù)生存而影響轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的富集，在熒光顯微鏡下，挑選帶紅色熒光的細(xì)胞團(tuán)用于擴(kuò)大培養(yǎng)，從而進(jìn)一步篩選基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。d.轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中外源標(biāo)記基因的刪除。篩選得到既表達(dá)G418抗性，又能 穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光蛋白的細(xì)胞團(tuán)，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后，在培養(yǎng)液中添加1 μ g/ml強(qiáng)力霉素，在強(qiáng)力霉素與 Tet-On Advanced蛋白亞基的共同作用下激活Ptight啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄表達(dá)Cre酶，引發(fā)兩個(gè)同向Loxp序列發(fā)生同源重組，而原位點(diǎn)保留了目的基因。e.同源重組細(xì)胞的富集。在培養(yǎng)液中加入強(qiáng)力霉素后，細(xì)胞經(jīng)傳代培養(yǎng)1-2代，， 培養(yǎng)液中添加20 μ g/ml丙氧鳥苷(GCV)，在TK基因的作用下，未發(fā)生重組和重組刪除后又重新連接到基因組中的細(xì)胞，tk基因的產(chǎn)物使細(xì)胞利用丙氧鳥苷轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘晕镔|(zhì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，通過(guò)此負(fù)篩選得到成功轉(zhuǎn)染目的基因，同時(shí)又能成功刪除熒光蛋白和抗性基因等存在生物安全隱患的外源基因的細(xì)胞，然后再利用這種細(xì)胞用于核移植供體，從而為制作無(wú)外源標(biāo)記基因的安全型轉(zhuǎn)基因動(dòng)物提供基本的手段和技術(shù)方案。以上實(shí)施例僅為本發(fā)明的示例性實(shí)施例，不用于限制本發(fā)明，本發(fā)明的保護(hù)范圍由權(quán)利要求書限定。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和保護(hù)范圍內(nèi)，對(duì)本發(fā)明做出各種修改或等同替換，這種修改或等同替換也應(yīng)視為落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種表達(dá)載體，其特征在于，在線性化載體的非目的基因的兩端加入Loxp序列，同時(shí)引入誘導(dǎo)表達(dá)啟動(dòng)子組分，啟動(dòng)Cre酶表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體包括Ptight (bp 33-348)選擇性啟動(dòng)子，由Tet-On Advanced蛋白亞基與四環(huán)素類似物共同啟動(dòng)；Cre (bp 371-1402)表達(dá)Cre酶，識(shí)別兩段Loxp序列，并發(fā)生同源重組； SV40 PolyA (bp 1403-1603)多聚腺苷酸信號(hào); LoxP (bp 1619-1652)、(bp 1690-1723)，Cre 酶識(shí)別序列; MCS(bp 1654-1689)多克隆位點(diǎn)，用于插入目的基因； CMV 啟動(dòng)子(bp 1829-2429)，啟動(dòng) Tet-On Advanced、TK、DsRed 的表達(dá)； Tet-On Advanced (bp 2381-3124)表達(dá)Tet-On Advanced蛋白亞基，在四環(huán)素的共同作用下，可以激活Ptight啟動(dòng)子，啟動(dòng)Cre酶轉(zhuǎn)錄和表達(dá)； T2A 序列(bp 3134-3193)；TK胸苷激酶(bp 3194-4324)，使丙氧鳥苷三磷酸化，抑制DNA聚合酶活性； IRES 序列(bp 4357-4941)；DsRed2 (bp 4961-5638)紅色熒光蛋白基因，選擇標(biāo)記基因； Psv40啟動(dòng)子(bp 65514-6784)，啟動(dòng)抗性基因的表達(dá)； KanR/NeoR(bp 6867-7661)是卡那霉素和新霉素的抗性基因； HSV TK PolyA (bp 7897-7915)多聚腺苷酸信號(hào)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述表達(dá)載體，其特征在于，其序列如序列表SEQ=ID NO 1所示。
4.一種表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟1)合成IoxP-MCS-IoxP序列，并通過(guò)EcoRI和SalI酶切連接到pDsRed2_l質(zhì)粒，得到的質(zhì)粒命名為PDsRed-LoxP ；2)從pIRES2-EGFP上通過(guò)PCR得到CMV啟動(dòng)子，在引物的兩端引物SalI和Asp 718 I酶切位點(diǎn)，命名為Pcmv;3)將PCR所得片段經(jīng)酶切后連接到pDsRed-LoxP質(zhì)粒中，得到pDsRed-LoxP-CMV質(zhì)粒；4)對(duì)已知質(zhì)粒查詢，獲得Tet-OnAdvanced組件、TK基因和IRES序列，并在Tet-On Advanced和TK基因之間引入T2A多肽，并在整體片段的兩端設(shè)計(jì)Asp718 I和BamH I酶切位點(diǎn)，命名為Tet-On TK ；5)將步驟4中所合成基因片段雙酶切后連接到pDsRed-Loxp-CMV質(zhì)粒中，命名為 pTet-On RL 質(zhì)粒；6)查詢GeneBank中Cre酶基因，通過(guò)密碼子優(yōu)化后并在兩端加入EcoRI和Xba I酶切位點(diǎn)，合成后命名為Cre ；7)將步驟6合成的Cre酶基因經(jīng)EcoRI和Xba I雙酶切，連接到pTRE_Tight質(zhì)粒中， 經(jīng)Xho I單酶切后得到的片段命名為Ptight-Cre ；8)將質(zhì)粒pTet-OnRL用Xho I單酶切后，與Ptight-Cre片段連接，得到名稱為pTRE Tet-On RL的質(zhì)粒。
5.權(quán)利要求1至3任一所述的表達(dá)載體在制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的載體在制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的應(yīng)用，包括如下步驟a.基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞，表達(dá)載體連接 目的基因并線性化后，轉(zhuǎn)染細(xì)胞并插入到細(xì)胞基因組中，啟動(dòng)子同時(shí)驅(qū)動(dòng)Tet-On Advanced蛋白亞基、胸苷激酶和紅色熒光蛋白基因的表達(dá)；b.轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的富集，基因轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，添加G418篩選；c.紅色熒光蛋白進(jìn)行二次篩選；d.轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中外源標(biāo)記基因的刪除，經(jīng)12-15天培養(yǎng)后，挑選穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光蛋白的細(xì)胞團(tuán)，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后，在培養(yǎng)液中添加強(qiáng)力霉素，強(qiáng)力霉素與Tet-On Advanced蛋白亞基的共同作用下激活Ptight啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄表達(dá)Cre酶，Cre酶識(shí)別兩個(gè)同向Loxp序列并引起同源重組，刪除載體中非目的基因的序列，而原位點(diǎn)只保留了目的基因；e.同源重組細(xì)胞的富集，由于TK基因單獨(dú)表達(dá)不會(huì)表現(xiàn)出細(xì)胞毒性，在丙氧鳥苷的作用下，阻止DNA合成而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，細(xì)胞培養(yǎng)液中添加強(qiáng)力霉素后，經(jīng)傳代培養(yǎng)1-2代后加入丙氧鳥苷，在TK基因的作用下，未發(fā)生重組和重組刪除后又重新連接到基因組中的細(xì)胞因DNA合成受阻而死亡，得到成功轉(zhuǎn)染目的基因，同時(shí)又能成功刪除熒光蛋白和抗性基因等存在生物安全隱患的外源基因的細(xì)胞；f.然后再利用步驟e得到的外源基因的細(xì)胞用于核移植供體，從而得到無(wú)外源標(biāo)記基因的安全型轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種表達(dá)載體及其構(gòu)建和應(yīng)用，其中表達(dá)載體為在線性化載體的非目的基因的兩端加入Loxp序列，同時(shí)引入誘導(dǎo)表達(dá)Cre酶和TK自殺基因組分。本發(fā)明的表達(dá)載體增加了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的安全性。
文檔編號(hào)C12N15/85GK102226201SQ201110117708
公開日2011年10月26日 申請(qǐng)日期2011年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月9日
發(fā)明者代蓉, 劉守仁, 周平, 唐紅, 王新華, 王立民 申請(qǐng)人:新疆農(nóng)墾科學(xué)院