專利名稱：一種水稻干旱脅迫應(yīng)答蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種可以準(zhǔn)確應(yīng)答水稻干旱脅迫的蛋白 及其編碼基因，以及這種基因的調(diào)控元件在水稻抗旱中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物的生長發(fā)育需要水分，礦物質(zhì)和有機(jī)物質(zhì)的供應(yīng)，同時(shí)也受到植物生長物質(zhì) 的調(diào)節(jié)與控制。人類種植作物已有上萬年的歷史，如何增強(qiáng)作物抗災(zāi)害能力、提高產(chǎn)量一直 是種植業(yè)一大難題。其中干旱是危害面積最廣，危害程度最大的災(zāi)害之一。當(dāng)植物遭遇干 旱逆境時(shí)，植物體迅速感知外部信號(hào)，并迅速傳導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)部，進(jìn)而激活許多干旱脅迫應(yīng)答 基因的表達(dá)，在植物體內(nèi)產(chǎn)生大量的特異性蛋白，協(xié)同調(diào)節(jié)植物生理生化一級(jí)代謝的變化， 從而提高對(duì)干旱的耐性。與其他旱作植物相比，水稻對(duì)水分脅迫更為敏感，水分虧缺會(huì)使植 株發(fā)育受阻，分蘗減少，花粉敗育，產(chǎn)量減少等。植物生理學(xué)家和育種專家對(duì)水稻的長期種 植實(shí)踐和觀察發(fā)現(xiàn)，生殖發(fā)育時(shí)期有幾個(gè)階段對(duì)外界逆境非常敏感，此時(shí)遭受脅迫可能會(huì) 導(dǎo)致產(chǎn)量的大幅度下降，比如說水稻的第一苞分化至穎花原基分化始期(決定花的個(gè)數(shù))， 減數(shù)分裂期(決定雌雄育性)，灌漿期(決定種子飽滿程度，千粒重)。這些時(shí)期遭受干旱脅迫 會(huì)使得花的個(gè)數(shù)減少、穎花退化、空癟等(楊弘遠(yuǎn)編著.水稻生殖生物學(xué).2005，浙江大學(xué) 出版社)。水稻全基因測(cè)序工作的完成，為針對(duì)水稻組織應(yīng)用高通量的全基因組表達(dá)技術(shù) 如基因芯片、蛋白質(zhì)組分析提供了方便。這些高通量的功能基因組研究技術(shù)結(jié)合公共數(shù) 據(jù)庫中的序列信息，將有利于克隆水分虧缺條件下的響應(yīng)基因，進(jìn)而有望從中發(fā)現(xiàn)新的 抗旱基因，分析這些基因上游的啟動(dòng)子，還能發(fā)現(xiàn)可應(yīng)用于抗旱基因工程育種上的新的 調(diào)控元件。通過干旱環(huán)境下的轉(zhuǎn)錄譜分析，我們獲得了一個(gè)干旱脅迫后誘導(dǎo)表達(dá)的基因 0s07g0422100。0s07g0422100 具有的 PM-19 (19-kDa Plasma Membrane Polyp印tide)結(jié) 構(gòu)域，是最重要的ABA (脫落酸，abscisic acid)誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)域之一。植物在遭受干旱脅迫 時(shí)，ABA被普遍認(rèn)為是一種干旱信號(hào)而傳遞干旱信息，進(jìn)而調(diào)控體內(nèi)基因的表達(dá)以抵御干 旱造成的傷害。對(duì)基因洲進(jìn)一步分析后發(fā)現(xiàn)洲基因的啟動(dòng)子屬于誘導(dǎo)型 啟動(dòng)子，特異性地在植物體受到干旱脅迫時(shí)啟動(dòng)該基因的表達(dá)，以抵御干旱逆境。根據(jù)這一 特性，我們?cè)谠搯?dòng)子3’端連接一個(gè)報(bào)告基因(^Λ5)，在植物受到干旱逆境脅迫時(shí)，報(bào)告基 因便開始表達(dá)，經(jīng)過一種便捷有效的染色方法就可以準(zhǔn)確估量植物受災(zāi)程度，以便及時(shí)補(bǔ) 救，有效減少甚至避免損失。0s07g0422100蛋白及其編碼基因的特性讓我們對(duì)此基因在研究抗旱功能方面有 很高的期望，對(duì)深入研究植物抗旱機(jī)制及功能有重大意義。0s07g0422100的調(diào)控元件啟動(dòng) 子驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因的方法更是提供了一種檢測(cè)植物遭受干旱脅迫程度的手段，具有較高的實(shí) 際應(yīng)用價(jià)值，應(yīng)用前景廣闊。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一個(gè)來源于水稻的可應(yīng)答干旱的基因及改造該基因后的可 以報(bào)告干旱程度的基因。本發(fā)明所提供的可應(yīng)答干旱的蛋白，名稱為0s07g0422100，來源于水稻(ftr^a sativa ssp. japonica)；是下述氨基酸殘基序列之一
1)序列表中的SEQID No:l;
2)將序列表中的SEQID No: 1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至二十個(gè)氨基酸殘基的取代和 /或缺失和/或添加且對(duì)植物的生長發(fā)育具有調(diào)控作用的蛋白質(zhì)。序列表中的SEQ ID No: 1由173個(gè)氨基酸殘基組成。編碼本發(fā)明的0s07g0422100基因，是下述核苷酸序列之一
1)序列表中的SEQID No:2的核苷酸序列；
2)編碼序列表中的SEQID No: 1蛋白質(zhì)序列的DNA ；
3)與序列表中的SEQID No:2限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且編碼相同功 能蛋白質(zhì)的核苷酸序列；
4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的SEQID No: 2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件用0.1XSSPE(或0.1XSSC)，0.1%SDS的溶液，在65° C下雜交
并洗膜。序列表中的SEQ ID No:2由522個(gè)堿基組成，其編碼框?yàn)樽?’端第1-522位堿基， 編碼具有序列表中的SEQ ID No: 1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。本發(fā)明所提供的可應(yīng)答干旱的基因0s07g0422100的調(diào)控元件為該基因的啟動(dòng)子 區(qū)域，是是下述核苷酸序列之一
1)序列表中的SEQID No:3的核苷酸序列；
2)與序列表中的SEQID No:3限定的核苷酸序列具有90%以上同源性的核苷酸序
列；
3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的SEQID No: 3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件用0.1XSSPE(或0.1XSSC)，0.1%SDS的溶液，在65° C下雜交
并洗膜。含有本發(fā)明基因的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和工程菌以及擴(kuò)增該基因中任一 片段的引物對(duì)均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述基因的應(yīng)用，包括提供一種用上述基因檢測(cè)植物 遭受干旱脅迫程度的方法。在實(shí)際應(yīng)用中，將0s07g0422100的啟動(dòng)子與報(bào)告基因(卵·5)融合，將該構(gòu)建
轉(zhuǎn)化水稻，得到可以比較準(zhǔn)確地估量植物受到干旱脅迫程度的植株。上述重組表達(dá)載體均可按照常規(guī)方法構(gòu)建。本發(fā)明的0s07g0422W0是一個(gè)抗旱基因，可以在水稻受到干旱脅迫時(shí)大量表達(dá)， 以抵御干旱逆境。而^^7^ 州的轉(zhuǎn)基因植株可以報(bào)告水稻干旱程度。本發(fā)明不 但提供了一種抗旱基因，更提供了一種檢測(cè)植物遭受干旱脅迫程度的方法，同時(shí)也對(duì)深入 研究植物抗旱機(jī)制及功能有重大意義。本發(fā)明的蛋白質(zhì)及其編碼基因具有較高的實(shí)際應(yīng)用 價(jià)值，應(yīng)用前景廣闊。


圖1為水稻幼苗(seedling)、未進(jìn)行干旱處理的水稻花序(flower)和進(jìn)行干旱處 理后的水稻花序(drought flower)中洲的表達(dá)水平。圖2為卵S轉(zhuǎn)化水稻植株與野生型水稻經(jīng)過干旱處 理后花苞中的gus染色結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。所用引物由英駿生物技術(shù)有 限公司完成，測(cè)序工作由上海桑尼生物科技有限公司完成。實(shí)施例1.水稻抗旱基因0s07g0422100的篩選。在水稻二級(jí)枝梗形成時(shí)，停止灌溉，監(jiān)測(cè)土壤含水量，使之保持在20-30%，持續(xù)一 周。取水稻花苞為材料,提取總RNA (Promega, SV total RNA isolation system)，通過基 因芯片比較分析對(duì)照植物與被脅迫植物的基因表達(dá)譜，初步篩選到包括0s07g0422100的 一些候選基因。以水稻的總RNA為模板，用AMV反轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa)合成cDNA (依據(jù)Plant RT - PCR Kit 2. 01 (TaKaRa)的用戶手冊(cè)進(jìn)行)，用熒光定量PCR試劑盒STOR Premix Ex Taq (TaKaRa)檢測(cè)對(duì)照植物與被脅迫植物中0s07g0422100的表達(dá)情況(依據(jù)TaKaRa的用 戶手冊(cè)進(jìn)行)。所用5’和3’引物分別為
5’-TGTGACAGTGTGACTGTGAGGC-3’ ( SEQ ID No:4)； 5，-CAAACCCAACACACAACGCTA-3， ( SEQ ID No:5)。反應(yīng)按照下列程序進(jìn)行預(yù)變性95°C 3分鐘，1個(gè)循環(huán)；變性95°C 10秒，退火與 延伸60°C 30秒，40個(gè)循環(huán)。對(duì)比該基因的在幼苗時(shí)期(seedling)、未受干旱脅迫的花期 (flower)和受到干旱脅迫的花期(drought flower)的表達(dá)量，我們發(fā)現(xiàn)0s07g0422100的 表達(dá)具有非常高的專一性，僅在受到干旱脅迫后的水稻花穗中特異表達(dá)(圖1)。實(shí)施例2.洲啟動(dòng)子的克隆。提取水稻總DNA，以水稻總DNA為模板，PCR擴(kuò)增0s07g0422100的啟動(dòng)子部分。5， 和3’引物序列分別為
5’ -AAGTAAACCGTTTTTTAAGGAT-3，( SEQ ID No:6)； 5， -TGAGCTATCAGGGTAGCAGCC-3， (SEQ ID No:7)。50ul PCR反應(yīng)體系包含模板2ul，高保真酶KOD plus (Τ0Υ0Β0) lul，10X緩沖 液5ul，2.5uM dNTP 8ul，20uM的5'和3，引物各lul，水32ul。反應(yīng)條件為94° C預(yù)變 性2分鐘；94° C變性30秒，55° C退火1分鐘，68° C延伸2分鐘，共30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié) 束后，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收并純化約21Λρ的擴(kuò)增片段。PCR產(chǎn)物 1^HindYW和勒“/II位點(diǎn)克隆到大腸桿菌表達(dá)載體PCAMBIA1301中，測(cè)序驗(yàn)證其正確后得 到大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒 \)CkmikUQ\-0s07g0422100p-gus。實(shí)施例3.重組質(zhì)粒卵S轉(zhuǎn)化水稻植株。將重組質(zhì)粒卵S轉(zhuǎn)化到水稻中。參照Hiei等(Plant Mol Biol, 1997，35 :205 — 218)的方法轉(zhuǎn)化水稻。將質(zhì)粒？041^認(rèn)1301- ^7冰^^70你-卵>5 通過電激法轉(zhuǎn)入根瘤農(nóng)桿菌EH105中，經(jīng)篩選獲得陽性克隆。將攜帶質(zhì)粒pCAMBIA1301 -0s07g0422100p-gus 的農(nóng)桿菌EH105 接種到 5ml 含 100mg/L卡那霉素的 YEB 液 體培養(yǎng)基中搖菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期晚期，再1 :100擴(kuò)大培養(yǎng)到0D600為0. 5左右。收 集農(nóng)桿菌菌體并重懸于轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中。按照常規(guī)方法浸染水稻日本晴的愈傷組織，經(jīng)共培 養(yǎng)感染、抗性培養(yǎng)基篩選及分化培養(yǎng)基上分化得到潮霉素抗性的陽性苗。待小苗長至IOcm 左右時(shí)，將小苗移至室外網(wǎng)室種植，收種即得Tl代種子。實(shí)施例4. pCAMB IA1301 -0s07g0422100p-gus轉(zhuǎn)基因水稻植株報(bào)告干旱脅迫效果 的檢測(cè)。將得到的轉(zhuǎn)基因水稻Tl代種子正常種植，在水稻二級(jí)枝梗形成時(shí)，停止灌溉，監(jiān) 測(cè)土壤含水量，使之保持在20-30%，持續(xù)一周。取下花序浸于gus染液中，于37°C放置Mh， 70%乙醇浸泡24h以洗脫雜色，觀察經(jīng)過干旱處理與對(duì)照組的花器染色程度。圖2即為轉(zhuǎn)基 因水稻植株和野生型水稻花序的gus染色結(jié)果。未受干旱處理的轉(zhuǎn)基因水稻植株，其花序 里報(bào)告基因gus的表達(dá)水平非常之低，而受過干旱處理的轉(zhuǎn)基因水稻植株，其報(bào)告基因卻 呈現(xiàn)了高度表達(dá)，因而證明了 0s07g0422100的啟動(dòng)子為一種干旱誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子，在植物 受到干旱脅迫后在花器官中誘導(dǎo)表達(dá)。同時(shí)我們的結(jié)果還提供了 一種檢測(cè)植株水分缺虧的 方法，即通過便捷有效的染色就可以較為地準(zhǔn)確估量植物水分缺失的程度，以便及時(shí)補(bǔ)救， 有效減少甚至避免損失。
權(quán)利要求
1.一種水稻干旱脅迫應(yīng)答蛋白，其特征在于是下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)(1)SEQ ID No 1 ；(2)SEQ ID No: 1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至二十個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和 /或添加且對(duì)植物的生長發(fā)育具有調(diào)控作用的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求1所述的水稻干旱脅迫應(yīng)答蛋白的基因，其特征在于為下述核苷酸序 列之一(1)SEQ ID No 2 ；(2)編碼SEQID No: 1蛋白質(zhì)序列的DNA ；(3)與SEQID No:2限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且編碼相同功能蛋白質(zhì)的 核苷酸序列；(4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQID No:2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
3.如權(quán)利要求2所述水稻干旱脅迫應(yīng)答蛋白的基因的調(diào)控元件即該基因的啟動(dòng)子，其 特征在于為下述核苷酸序列之一(1)SEQ ID No 3 ；(2)與SEQID No:3限定的核苷酸序列具有90%以上同源性的核苷酸序列；(3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與SEQID No:3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
4.含有權(quán)利要求2或3所述的水稻干旱脅迫應(yīng)答基因及其調(diào)控元件的表達(dá)載體。
5.含有權(quán)利要求2或3所述的水稻干旱脅迫應(yīng)答基因及其調(diào)控元件的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
6.含有權(quán)利要求2或3所述的水稻干旱脅迫應(yīng)答基因及其調(diào)控元件的工程菌。
7.擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述的水稻干旱脅迫應(yīng)答基因及其調(diào)控元件中任一片段的引物對(duì)。
8.權(quán)利要求2或3所述的水稻干旱脅迫應(yīng)答基因及其調(diào)控元件在植物生長發(fā)育中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，所述的植物包括單子葉植物和雙子葉植物。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于將所述水稻干旱脅迫應(yīng)答基因的調(diào)控元 件啟動(dòng)子區(qū)域與報(bào)告基因^^融合后轉(zhuǎn)化水稻，在受過干旱處理的轉(zhuǎn)基因水稻植株里，其 報(bào)告基因呈現(xiàn)誘導(dǎo)表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種水稻干旱脅迫應(yīng)答蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。該蛋白是下述氨基酸殘基序列之一(1)如SEQ ID No1所示；(2)將SEQ ID No:1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至二十個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且對(duì)植物的生長發(fā)育具有調(diào)控作用的蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供一個(gè)水稻抗旱基因及建立于此基因調(diào)控元件基礎(chǔ)上的有效檢測(cè)植物所受干旱脅迫程度的方法。經(jīng)檢測(cè)，該方法具有快速、準(zhǔn)確估量水稻植株所受干旱影響程度的特點(diǎn)。本發(fā)明為植物缺水檢測(cè)提供了一種快速、便捷、有效的方法，并為植物抗旱研究及干旱育種提供了一個(gè)優(yōu)質(zhì)基因，具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N1/19GK102146131SQ20111011809
公開日2011年8月10日 申請(qǐng)日期2011年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月9日
發(fā)明者俞瑜, 牟晨, 董愛武, 金菁, 隋鵬飛 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)