專利名稱：Dgge法在微生物快速分類中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種快速區(qū)分不同微生物種類方法在生物領(lǐng)域中的應(yīng)用，尤其涉及在益生菌產(chǎn)品、傳統(tǒng)乳制品、葡萄酒、動(dòng)物微生態(tài)制品及人體內(nèi)DGGE法在微生物快速分類中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
微生物研究中，經(jīng)常需要對(duì)混合樣品中分離出的諸多單菌進(jìn)行分類和鑒定，以期了解該菌的生理特點(diǎn)和發(fā)酵性質(zhì)，為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。一般而言，菌種鑒定主要包括形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)、生理學(xué)和生物化學(xué)、次級(jí)代謝產(chǎn)物、泛醌系統(tǒng)、脂肪酸組成、細(xì)胞壁組成和蛋白質(zhì)組成等。通常，我們利用多種培養(yǎng)基(常用培養(yǎng)基或者選擇性培養(yǎng)基)對(duì)樣品中的微生物進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)其菌落形態(tài)和革蘭氏染色將其進(jìn)行大略判斷，之后利用以上介紹的鑒定方法進(jìn)行菌種鑒定。為了盡可能多地鑒定出樣品中的不同菌株，我們一般會(huì)對(duì)所有篩選菌進(jìn)行鑒定，工作量大，耗時(shí)長，金錢消耗甚巨。16S rDNA指紋圖譜技術(shù)——變性梯度凝膠電泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, DGGE)可以直接利用細(xì)菌rDNA或者rRNA對(duì)微生物進(jìn)行表征，不但避免了傳統(tǒng)方法中耗時(shí)的菌種分離，而且可以鑒定出無法利用傳統(tǒng)方法分離出的菌種。DGGE技術(shù)最先是用于檢測(cè)DNA突變的一種電泳技術(shù)，與基于分子量大小進(jìn)行分離的瓊脂糖電泳和 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳不同，它是基于PCR擴(kuò)增子的序列特異性熔解溫度進(jìn)行分離的， 并且可以檢測(cè)出序列中一個(gè)核苷酸的差異。1985年Muzyers et al]首次在DGGE中使用 “GC夾子”和異源雙鏈技術(shù)，使該技術(shù)日臻完善。1993年Muzyers et al首次將DGGE技術(shù)應(yīng)用于分子微生物生態(tài)學(xué)研究領(lǐng)域，并證實(shí)了這種技術(shù)在揭示自然界微生物區(qū)系的遺傳多樣性和菌群差異方面具有獨(dú)特的優(yōu)越性。 由于DGGE技術(shù)避免了分離培養(yǎng)的缺陷，直觀地顯現(xiàn)微生物區(qū)系菌群多樣性，目前已經(jīng)成為微生物菌群多樣性和動(dòng)態(tài)變化分析的常用工具。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于一種DGGE法在微生物快速分類中的應(yīng)用，該技術(shù)可以將益生菌產(chǎn)品、傳統(tǒng)乳制品、葡萄酒、動(dòng)物微生態(tài)制品及生物體內(nèi)分離的多株菌進(jìn)行分類，使用方便快捷、準(zhǔn)確且重復(fù)性好，為后繼實(shí)驗(yàn)節(jié)約大量時(shí)間和金錢。DGGE重現(xiàn)性強(qiáng)、可靠性高、速度快、能夠彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法分析微生物群落的不足，已成為現(xiàn)代微生物學(xué)領(lǐng)域一種重要研究手段。本發(fā)明利用DGGE技術(shù)靈敏度高、重復(fù)性強(qiáng)的特點(diǎn)，對(duì)單菌進(jìn)行DNA提取，PCR擴(kuò)增和DGGE檢測(cè)，從而快速、準(zhǔn)確地將同種微生物與其它微生物區(qū)別開來。而且，我們以原樣品中微生物為標(biāo)準(zhǔn)，可以判斷出樣品中的優(yōu)勢(shì)菌和弱勢(shì)菌。因?yàn)镈GGE技術(shù)是一種半定量技術(shù)，如果想獲得具體菌的名稱，則需對(duì)特征性的片斷進(jìn)行割膠回收、測(cè)序，最終確定其歸屬。本發(fā)明是一種微生物分類鑒定前期處理技術(shù)，可以將同種菌劃為一類，從而為后面菌種鑒定節(jié)約大量時(shí)間和金錢。本發(fā)明的成功，為DGGE技術(shù)在微生物生態(tài)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用提供了新思路。本發(fā)明是這樣來實(shí)現(xiàn)的，DGGE法在微生物快速分類中的應(yīng)用，其特征是該應(yīng)用分別包括DGGE法在區(qū)分不同益生菌中的應(yīng)用、DGGE法在區(qū)分傳統(tǒng)發(fā)酵乳viili中不同微生物的應(yīng)用、DGGE法在區(qū)分葡萄酒中不同微生物的應(yīng)用和DGGE法在區(qū)分動(dòng)物微生態(tài)制劑中不同微生物的應(yīng)用。所述DGGE法在區(qū)分不同益生菌中的應(yīng)用利用細(xì)菌通用引物，乳酸菌和雙歧桿菌特異性引物對(duì)4株乳酸菌標(biāo)準(zhǔn)菌和3株雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株保守區(qū)片段PCR擴(kuò)增并進(jìn)行 DGGE檢測(cè)，結(jié)果表明，相同標(biāo)準(zhǔn)菌株優(yōu)勢(shì)條帶在DGGE膠上出現(xiàn)的位置和條帶數(shù)一致，不同標(biāo)準(zhǔn)菌株優(yōu)勢(shì)條帶在DGGE膠上位置和條帶數(shù)不一致，所述4株乳酸菌標(biāo)準(zhǔn)菌分別為鼠李糖乳桿菌ATCC53103、植物乳桿菌ATCC8014、唾液乳桿菌FBC05、嗜酸乳桿菌ATCC4356 ；所述3株雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株分別為嬰兒雙歧桿菌ATCC15697、青春雙歧桿菌Bi07、長雙歧桿菌 NCC2705，其中長雙歧桿菌NCC2705設(shè)置3個(gè)重復(fù)。所述DGGE法在區(qū)分傳統(tǒng)發(fā)酵乳viili中不同微生物的應(yīng)用利用通用引物或種屬特異性引物對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵乳中篩選出的11株微生物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)以傳統(tǒng)發(fā)酵乳中微生物總菌DNA的PCR產(chǎn)物為對(duì)照，進(jìn)行DGGE檢測(cè)，結(jié)果表明，篩選得到的11株微生物屬于 5 禾中不同菌，分另Ij為 Lacio辦plantarum ATCC8014> Streptococcus thermophilus CICC6038> Lactobacillus paracasei ATCC25302> Bacillus cereus ATCC14579 禾口 Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus ATCCl 1842 ；與 viili 、菌所代表的DGGE 條帶相比可知，份re/^ococciAs thermophilus CICC6038為viili中細(xì)菌中的優(yōu)勢(shì)菌，而 Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus ATCC11842 為 viili 中乳桿菌屬中的優(yōu)勢(shì)乳桿菌。所述DGGE法在區(qū)分葡萄酒中不同微生物的應(yīng)用利用通用引物或種屬特異性引物對(duì)葡萄酒中篩選出的7株微生物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)以葡萄酒中微生物總菌DNA的 PCR產(chǎn)物為對(duì)照，進(jìn)行DGGE檢測(cè)，結(jié)果表明，篩選得到的7株微生物屬于4種菌，分別為 Saccharomyces cerevisiae ATCC9763^Baci11us megaterium ATCC19213>Paenibacillus pasadenensis SAFN—007T 禾口如eier sp. ATCC 33308 ；與葡萄酒總菌所代表的 DGGE條帶相比可知，SaccAarofflJ^e1S cerevisiae ATCC9763為葡萄酒中的優(yōu)勢(shì)菌。
DGGE法在區(qū)分動(dòng)物微生態(tài)制劑中不同微生物的應(yīng)用利用細(xì)菌通用引物對(duì)動(dòng)物微生態(tài)制劑中篩選出的6株微生物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)以動(dòng)物微生態(tài)制劑中微生物總菌DNA的 PCR產(chǎn)物為對(duì)照，進(jìn)行DGGE檢測(cè)，結(jié)果表明，篩選得到的6株微生物都屬于Lacto如 plan tarum ATCC8014，且其為葡萄酒中細(xì)菌屬的優(yōu)勢(shì)菌。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明方便快捷，可于菌種鑒定前將相同微生物歸于一類，大大減少了后繼工作量，節(jié)省大量時(shí)間和金錢。此外，本發(fā)明尚可判斷所區(qū)分菌在混合樣品中是否占優(yōu)勢(shì)。


圖1為特異性引物擴(kuò)增得到乳桿菌、雙歧桿菌PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳結(jié)果。圖2為V3區(qū)通用引物擴(kuò)增得到乳桿菌、雙歧桿菌PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳結(jié)果。圖3為特異性引物擴(kuò)增得到的乳桿菌、雙歧桿菌PCR產(chǎn)物的DGGE電泳結(jié)果。
圖4為V3區(qū)通用引物擴(kuò)增得到的乳桿菌、雙歧桿菌PCR產(chǎn)物的DGGE電泳結(jié)果。圖5為V3區(qū)通用引物和乳桿菌特異性引物擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳結(jié)果。圖6為V3區(qū)通用引物PCR-DGGE結(jié)果。圖7為乳桿菌特異性引物PCR-DGGE結(jié)果。圖8為葡萄酒中通用引物PCR-DGGE結(jié)果。圖9為動(dòng)物微生態(tài)制劑中通用引物PCR-DGGE結(jié)果。圖1中:L1,嗜熱鏈球菌；L2,鼠李糖乳桿菌；L3,植物乳桿菌L4，唾液乳桿菌L5， 嗜酸乳桿菌Mla。乳桿菌Marker; Mbif，雙歧桿菌Marker ；Bi,長雙歧桿菌；B2，青春雙歧桿菌；B3,嬰兒雙歧桿菌。圖2中L1，嗜熱鏈球菌；L2，鼠李糖乳桿菌；L3，植物乳桿菌；L4，唾液乳桿菌； L5,嗜酸乳桿菌；Mla。，乳桿菌Marker; Mbif，雙歧桿菌Marker ；Bi,長雙歧桿菌；B2，青春雙歧桿菌；B3，嬰兒雙歧桿菌。圖3中Ll 嗜熱鏈球菌；L2 鼠李糖乳桿菌；L3 植物乳桿菌；L4 唾液乳桿菌； L5 嗜酸乳桿菌；Mla。，乳桿菌DGGE Marker; Mbif，雙歧桿菌DGGE Marker ;B1，長雙歧桿菌； B2:青春雙歧桿菌；B3 嬰兒雙歧桿菌。圖4中嗜熱鏈球菌；L2 鼠李糖乳桿菌；L3 植物乳桿菌；L4 唾液乳桿菌；L5 嗜酸乳桿菌；Mla。，乳桿菌DGGE Marker; Mbif，雙歧桿菌DGGE Marker ；Bi:長雙歧桿菌；B2:青春雙歧桿菌；B3 嬰兒雙歧桿菌。圖5中，注A，V3區(qū)通用引物擴(kuò)增結(jié)果；B，乳桿菌特異性引物擴(kuò)增結(jié)果；M，DL2000 DNA Marker ； 1，villi ；2-16，菌株 1- 15。圖 6 中注1_7，菌株 1-7 ；8，villi ；9-16，菌株 8-15。圖 7 中，注1, villi ；2-11，菌株 1、4、5、6、7、9、11、13、14、15。圖8 中，注- ，葡萄酒總菌·Λ_ ,W^ 1、2、3、4、5、6、7。圖9中，注- ，微生態(tài)制劑總菌Λ-m 1、2、3、4、5、6。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
1.將10株細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(鼠李糖乳桿菌ATCC53103、植物乳桿菌ATCC8014、唾液乳桿菌 FBC05、嗜酸乳桿菌ATCC4356、嗜熱鏈球菌CICC6038、嬰兒雙歧桿菌ATCC15697、青春雙歧桿菌Bi07、長雙歧桿菌NCC2705，其中長雙歧桿菌NCC2705設(shè)置3個(gè)重復(fù))接種于MRS液體肉湯中于37°C、厭氧條件下培養(yǎng)M h。2.以上每種菌液各取1 mL提取基因組DNA;為制備具有指示功能的DGGE Marker, 每種菌各1 mL混合，提取基因組DNA，分別制備乳桿菌和雙歧桿菌特異性或通用性DGGE Marker03. 向2 mL離心管中加入700 μΙ-的裂解緩沖液[500 mM NaCl, 50 mM
Tris-HCl, pH 8.0，50 mM EDTA, 4% SDS]，300 pL 酚/ 氯仿 /異戊醇(25 :24 :l，Promega) 和0.4 g玻璃珠(0.35 g/0. 1 mm, 0. 05 g/0. 5 mm)，混勻，并將離心管置于渦旋振蕩器上振蕩10 min，20000Xg離心5 min后，向上清液中加入150 μΕ 10 M乙酸銨，DNA隨即使用兩次酚/氯仿/異戊醇提取和一次氯仿提取，異丙醇沉淀，70%乙醇洗滌，風(fēng)干后，加入100 μΙ TE緩沖液(10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8. 0)溶解DNA沉淀，加入 2 gL RNase (10 mg/ml)在 37°C 孵育 15min。4.擴(kuò)增 16S rDNA V3 區(qū)引物為 357 f(5 ‘ - GC cIamp-TACGGGAGGCAGCAG -3 ‘ ),519 r (5 ‘ -ATTACCGCGGCTGCTGG-3 ‘ ) ； 16S rDNA 乳桿菌引物 Iacl (5 ‘-AGCAGTAGGGAATCTTCCA-3‘ )， lac2 (5' - GC cIamp-ATTYCA
CCGCTACACATG -3' ) ； 16S rDNA 雙歧菌引物為 Bif id F (5' - CTCCTGGAA ACGGGTGG-3‘ ), Bifid R-GC (5' - GC cIamp-GGTGTTCTTCCCGATATCT
ACA -3')。擴(kuò)增體系(50 pL 包括 100 ng DNA 模板，IX EX Taq buffer, 200 μ M
dNTP, 200 nM 各引物，1. 5 mM MgCl2, 670 ng/μ L BSA, 1. 25 U EX Taq DNA 聚合酶) 參照 Muyzer 等方法(GC clamp sequence CGCCCGGGGCG
CGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG)。反應(yīng)條件94°C，5 min; 9，V 30 s;56°C，30 s;72°C，l min, 30 個(gè)循環(huán)；72°C，7 min。5.使用8 %聚丙烯酰胺凝膠，35 % 65 % [100%變性梯度包含40% (ν/ν)甲酰胺和 7 M尿素]變形梯度。電泳采用 DCode Universal Mutation Detection System (變性梯度凝膠電泳儀，Bio-fcid Laboratories, Hercules, CA, USA)，首先在220 V電壓下預(yù)電泳10 min，隨后在85 V的固定電壓下電泳16 h。電泳結(jié)束后，進(jìn)行硝酸銀染色。6.圖1顯示，對(duì)嗜熱鏈球菌(Li)用乳酸菌通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，未得擴(kuò)增產(chǎn)物， 但該引物對(duì)1^2、1^3、1^4、1^5及虬3。擴(kuò)增均得到所需條帶(大約380 bp),說明乳桿菌通用引物特異性好，可以選擇性擴(kuò)增乳酸菌菌屬；Mbif、Bl、B2、B3經(jīng)雙歧菌特異性引物擴(kuò)增后得到的條帶位置與預(yù)期結(jié)果相符(大約為596 bp)。圖2表明，嗜熱鏈球菌(Li)可經(jīng)V3通用引物擴(kuò)增得到所需目的片段，進(jìn)一步驗(yàn)證了乳酸菌引物的特異性，其擴(kuò)增后的條帶在217 bp位置，與預(yù)結(jié)果相符；其他菌經(jīng)通用引物擴(kuò)增均得到目的條帶(大約217 bp)。圖3說明，利用乳酸菌特異引物擴(kuò)增制備的乳酸菌DGGE Marker (Mla。)上的條帶 B1與鼠李糖乳酸菌優(yōu)勢(shì)條帶a —致，Id1與植物乳酸菌優(yōu)勢(shì)條帶b —致，C1與唾液乳酸菌優(yōu)勢(shì)條帶c 一致，Cl1與嗜酸乳酸菌優(yōu)勢(shì)條帶d優(yōu)勢(shì)條帶一致；利用雙歧菌特異性引物制備的雙歧菌DGGE Marker (Mbif)上的條帶θι與嬰兒雙歧優(yōu)勢(shì)條帶e —致，與長雙歧優(yōu)勢(shì)條帶 f 一致，gl與青春雙歧優(yōu)勢(shì)條帶g —致。圖4表明，利用細(xì)菌V3區(qū)通用引物擴(kuò)增制備的乳酸菌DGGE Marker (Mlac)其條帶al、bl、Cl、dl、el分別與嗜熱鏈球菌、鼠李糖乳酸菌、植物乳酸菌、唾液乳酸菌、嗜酸乳酸菌上的優(yōu)勢(shì)條帶a、b、c、d、e —致；而同樣利用細(xì)菌V3通用引物擴(kuò)增制備的雙歧菌DGGE Marker (Mbif )其上條帶f 1、gl、hi與青春雙歧、嬰兒雙歧、長雙歧上的優(yōu)勢(shì)條帶f、g、h —致。實(shí)施例2 =DGGE法在區(qū)分傳統(tǒng)發(fā)酵乳viili中不同微生物的應(yīng)用
1.將分離自viili中的15株菌接種于相應(yīng)的培養(yǎng)液中，于37°C培養(yǎng)16-20 h，使活菌數(shù)達(dá)到最大。2.按實(shí)施例1中的方法提取viili中所有分離菌和總菌的DNA，利用通用引物和菌屬特異性引物擴(kuò)增DNA，將得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行DGGE電泳。3.圖5表明，利用V3區(qū)總細(xì)菌通用引物可以對(duì)所有分離菌株擴(kuò)增出193 bp左右條帶，而利用乳桿菌特異性引物擴(kuò)增后，泳道3、4、9、11、13在380 bp無目的條帶出現(xiàn)，說明其代表的菌株2、3、8、10、12不屬于乳桿菌
圖6表明，菌株1、7在DGGE膠上優(yōu)勢(shì)條帶一致，為同一種菌；同樣，菌株2、3在DGGE 膠上優(yōu)勢(shì)條帶一致，為同一種菌；菌株4、5、9、11、13、14、15為同一種菌；菌株8、10、12為同一種菌；菌株6與其它菌優(yōu)勢(shì)條帶不同，單獨(dú)為一種細(xì)菌。此外，viili在DGGE膠上優(yōu)勢(shì)條帶與菌株8、10、12所代表的菌條帶一致，說明菌株8、10、12所代表的菌為viili中的優(yōu)勢(shì)菌。圖7表明，菌株1、6在DGGE膠上優(yōu)勢(shì)條帶一致，為同一乳桿菌；同樣，菌株4、5、9、 11、13、14、15為同一乳桿菌；菌株6與其它菌優(yōu)勢(shì)條帶不同，單獨(dú)為一乳桿菌。泳道1代表的viili其優(yōu)勢(shì)條帶與菌株6 —致，說明菌株6為viili中乳桿菌中的優(yōu)勢(shì)乳桿菌。將克隆測(cè)序得到的序列在Genbank中進(jìn)行Blastn，分離株分別為Lactobacillus plantarum> Streptococcus thermophilus、Lactobacillus paracasein Bacillus cereus 禾口 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus 5 禾中不同細(xì)菌。
實(shí)施例3 利用DGGE法在區(qū)分葡萄酒中不同微生物的應(yīng)用
1.將分離自葡萄酒中的7株菌接種于相應(yīng)的培養(yǎng)液中，于37°C培養(yǎng)16-20 h，使活菌數(shù)達(dá)到最大。2.按實(shí)施例1中的方法提取葡萄酒中所有分離菌和總菌的DNA，利用通用引物和菌屬特異性引物擴(kuò)增DNA，將得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行DGGE電泳。3.圖8表明，菌株1-4屬于同一種菌，測(cè)序結(jié)果表明其為feccAarfM^M cerevisiae^-Ι分別為不同菌，測(cè)序結(jié)果表明其分別為Bacillus megaterium, Paenibacillus pasadenensis私Acinetobacter sp.。與葡萄酒總菌條帶相比較，我們可 1^^3 , Saccharomyces cerevisiae 為葡萄酒中的優(yōu)勢(shì)菌。
實(shí)施例4 :DGGE法在區(qū)分動(dòng)物微生態(tài)制劑中不同微生物的應(yīng)用 1.將分離自動(dòng)物微生態(tài)制劑中的6株菌接種于相應(yīng)的培養(yǎng)液中，于37°C培養(yǎng)16-20 h， 使活菌數(shù)達(dá)到最大。2.按實(shí)施例1中的方法提取動(dòng)物微生態(tài)制劑中所有分離菌和總菌的DNA，利用通用引物和菌屬特異性引物擴(kuò)增DNA，將得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行DGGE電泳。3.圖9表明，菌株1-6屬于同一種菌，測(cè)序結(jié)果表明其為Lacto如CiBm plantarum ATCC8014 ；與動(dòng)物微生態(tài)制劑總細(xì)菌條帶相比較，我們可以發(fā)現(xiàn)， Lactobacillus plantarum ATCC8014為動(dòng)物微生態(tài)制劑中細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌。
實(shí)施例5 :DGGE法在區(qū)分土壤、食品、水體、空氣、人體內(nèi)不同微生物的應(yīng)用
1.將分離土壤、食品、水體、空氣、人體內(nèi)的微生物接種于相應(yīng)的培養(yǎng)液中，于適宜條件下進(jìn)行培養(yǎng)，使活菌數(shù)達(dá)到最大。2.按實(shí)施例1中的方法提取土壤、食品、水體、空氣、人體內(nèi)所有分離菌和總菌的 DNA,利用通用引物和菌屬特異性引物擴(kuò)增DNA，將得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行DGGE電泳。3.如單菌所在泳道上的條帶數(shù)目和位置與其他單菌一致，說明其為相同菌；如單菌優(yōu)勢(shì)帶在與總菌優(yōu)勢(shì)帶位置一致，說明該單菌在混合樣品中為優(yōu)勢(shì)菌。
權(quán)利要求
1.DGGE法在微生物快速分類中的應(yīng)用，其特征是該應(yīng)用分別包括DGGE法在區(qū)分不同益生菌中的應(yīng)用、DGGE法在區(qū)分傳統(tǒng)發(fā)酵乳viili中不同微生物的應(yīng)用、DGGE法在區(qū)分葡萄酒中不同微生物的應(yīng)用和DGGE法在區(qū)分動(dòng)物微生態(tài)制劑中不同微生物的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DGGE法在微生物快速分類中的應(yīng)用，其特征是所述DGGE法在區(qū)分不同益生菌中的應(yīng)用利用細(xì)菌通用引物，乳酸菌和雙歧桿菌特異性引物對(duì)4株乳酸菌標(biāo)準(zhǔn)菌和3株雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株保守區(qū)片段PCR擴(kuò)增并進(jìn)行DGGE檢測(cè)，結(jié)果表明，相同標(biāo)準(zhǔn)菌株優(yōu)勢(shì)條帶在DGGE膠上出現(xiàn)的位置和條帶數(shù)一致，不同標(biāo)準(zhǔn)菌株優(yōu)勢(shì)條帶在DGGE 膠上位置和條帶數(shù)不一致，所述4株乳酸菌標(biāo)準(zhǔn)菌分別為鼠李糖乳桿菌ATCC53103、植物乳桿菌ATCC8014、唾液乳桿菌FBC05、嗜酸乳桿菌ATCC4356 ；所述3株雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株分別為嬰兒雙歧桿菌ATCC15697、青春雙歧桿菌Bi07、長雙歧桿菌NCC2705，其中長雙歧桿菌 NCC2705設(shè)置3個(gè)重復(fù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DGGE法在微生物快速分類中的應(yīng)用，其特征是所述DGGE 法在區(qū)分傳統(tǒng)發(fā)酵乳viili中不同微生物的應(yīng)用利用通用引物或種屬特異性引物對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵乳中篩選出的11株微生物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)以傳統(tǒng)發(fā)酵乳中微生物總菌DNA的 PCR產(chǎn)物為對(duì)照，進(jìn)行DGGE檢測(cè)，結(jié)果表明，篩選得到的11株微生物屬于5種不同菌，分另Ij 為 Lactobacillus plantarum ATCC8014、Streptococcus thermophilus CICC6038、 Lactobacillus paracasei ATCC25302> Bacillus cerew^ATCC14579 勒 Lactobacillus delbrueckii subsp. BulgaricuskrKCUMl ；與 viili 總菌所代表的 DGGE 條帶相比可知， Streptococcus thermophilus CICC6038 為 vii 1 i 中細(xì)菌中的優(yōu)勢(shì)菌，而 Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus ATCCl 1842 為 viili 中乳桿菌屬中的優(yōu)勢(shì)乳桿菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DGGE法在微生物快速分類中的應(yīng)用，其特征是所述DGGE法在區(qū)分葡萄酒中不同微生物的應(yīng)用利用通用引物或種屬特異性引物對(duì)葡萄酒中篩選出的 7株微生物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)以葡萄酒中微生物總菌DNA的PCR產(chǎn)物為對(duì)照，進(jìn)行DGGE 檢測(cè)，結(jié)果表明，篩選得到的7株微生物屬于4種菌，分別為Saccharomyces cerevisiae ATCC9763> Bacillus mega terium ATCC19213> Paenibacillus pasadenensis SAFN-OO7T 和Acinetobacter sp. ATCC 33308 ；與葡萄酒總菌所代表的DGGE條帶相比可知， Saccharomyces cerevisiae ATCC9763 為葡萄酒中的優(yōu)勢(shì)菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DGGE法在微生物快速分類中的應(yīng)用，其特征是DGGE法在區(qū)分動(dòng)物微生態(tài)制劑中不同微生物的應(yīng)用利用細(xì)菌通用引物對(duì)動(dòng)物微生態(tài)制劑中篩選出的6 株微生物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)以動(dòng)物微生態(tài)制劑中微生物總菌DNA的PCR產(chǎn)物為對(duì)照，進(jìn)行 DGGE檢測(cè)，結(jié)果表明，篩選得到的6株微生物都屬于Zacio^ciBttS ρlantarum ATCC8014, 且其為葡萄酒中細(xì)菌屬的優(yōu)勢(shì)菌。
全文摘要
DGGE法在微生物快速分類中的應(yīng)用，其特征是該應(yīng)用分別包括DGGE法在區(qū)分不同益生菌中的應(yīng)用、DGGE法在區(qū)分傳統(tǒng)發(fā)酵乳viili中不同微生物的應(yīng)用、DGGE法在區(qū)分葡萄酒中不同微生物的應(yīng)用和DGGE法在區(qū)分動(dòng)物微生態(tài)制劑中不同微生物的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是方便、快捷，可于菌種鑒定前將相同微生物歸于一類，大大減少了后繼工作量，節(jié)省大量時(shí)間和金錢。此外，本發(fā)明尚可判斷所區(qū)分菌在混合樣品中是否占優(yōu)勢(shì)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102242193SQ20111011853
公開日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2011年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月9日
發(fā)明者萬翠香, 姜淑英, 徐鋒, 李祖旭, 汪孟娟, 熊順強(qiáng), 許恒毅, 陳廷濤, 魏華 申請(qǐng)人:南昌大學(xué)