專利名稱：一種多肽食鹽替代物及其制備方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于食品領域，涉及一種多肽食鹽替代物及其制備方法，具體涉及大豆蛋白的酶解、目標多肽的分離純化和測序技術(shù)及目標多肽的咸度評定。
背景技術(shù)：
“民以食為天，食以味知先”。咸味是一種基礎的食品風味。食鹽是最基礎的咸味劑，也是唯一具有重要生理功能的的味制劑，它可調(diào)節(jié)細胞與血液之間的滲透平衡和正常的水鹽代謝。然而過多的食鹽攝入會嚴重影響人類的健康，引起一系列的疾病。據(jù)研究表明，長期高鈉飲食容易產(chǎn)生鈉的滯留，而鈉的滯留會導致腎臟病及心血管疾病。隨著生活水平的提高，人們越來越注意飲食的健康，因而開發(fā)一種新型的咸味劑迫在眉睫。本發(fā)明采用大豆蛋白作為原料，制得具有咸味的多肽，能夠部分替代食鹽從而減少鈉離子的攝入，使人們的飲食更加安全健康，具有廣闊的市場前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種多肽食鹽替代物。本發(fā)明的另一目的在于提供一種多肽食鹽替代物的制備方法。本發(fā)明制備的多肽食鹽替代物既能擁有食鹽的咸味，同時又能降低鈉離子的攝入，避免了由于高鈉飲食引起的一系列的疾病，因而更符合現(xiàn)代人的健康飲食觀念。本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)一種多肽食鹽替代物，其在于由包括下述步驟的方法制成(1)制備酶解液將大豆蛋白制成水溶液、并水浴反應后；加入Alcalase酶酶解并滅活，調(diào)節(jié)PH值后，再加入胃蛋白酶酶解并滅活，離心留上清；(2)分離純化目標多肽將步驟(1)制備的大豆蛋白酶解液加入到G-25葡聚糖層析柱中進行脫鹽及初步分離，收集具有咸味的組分；然后將目標溶液濃縮并進行G-15葡聚糖凝膠層析，再次收集具有咸味的組分；將經(jīng)G-15葡聚糖層析收集的咸味多肽混合物放入冷凍干燥機中冷凍干燥，得到凍干粉；將凍干粉使用反相高效液相色譜儀進行進一步分離純化，得到純凈的咸味多肽。上述的多肽食鹽替代物，其在于所述的多肽食鹽替代物氨基酸序列為Gly-Lys。上述的多肽食鹽替代物，其在于步驟(1)中制成的大豆蛋白水溶液的濃度為8 15g/L，水浴條件為80 85°C反應15 20min ；Alcalase酶酶解反應條件為42 47°C反應100 120min ；胃蛋白酶酶解反應條件為46 50°C反應100 120min ；兩次酶解反應后滅活條件為95 100°C滅活15 20min ；Alcalase酶酶解反應后將反應溶液的pH值調(diào)成 1. 0。上述的多肽食鹽替代物，其在于步驟⑴制備酶解液的過程中，大豆蛋白與 Alcalase酶的質(zhì)量體積比(g/ml)為1 0. 05 0. 07，大豆蛋白與胃蛋白酶的質(zhì)量比為 1 0. 03 0. 05。
上述的多肽食鹽替代物，其在于步驟O)中進行G-25葡聚糖層析和G-15葡聚糖層析時的洗脫速度為lml/min，用反相高效液相色譜儀進行進一步分離純化時的B液為乙 If+0.01% TFA(v/v/% )，洗脫梯度為30%~ 60% B，洗脫時間:60min。上述的多肽食鹽替代物的制備方法，其在于包括以下步驟(1)制備酶解液稱取大豆蛋白溶于水中制成8 15g/L的溶液，將溶液在80 85°C水浴條件下反應15 20min，冷卻后加入Alcalase酶于42 47°C反應100 120min， 95 100°C滅活15 20min ；調(diào)至pH為1. 0后，加入胃蛋白酶于46 50°C反應100 120min，95 100°C滅活15 20min，離心保留上清液；其中大豆蛋白與Alcalase酶的質(zhì)量體積比(g/ml)為1 0.05 0.07，大豆蛋白與胃蛋白酶的質(zhì)量比為1 0. 03 0. 05 ；(2)分離純化目標多肽將步驟(1)制備的大豆蛋白酶解液加入到G-25葡聚糖層析柱中進行脫鹽及初步分離，收集具有咸味的組分；然后將目標溶液濃縮并進行G-15葡聚糖凝膠層析，再次收集具有咸味的組分；將經(jīng)G-15葡聚糖層析收集的咸味多肽混合物放入冷凍干燥機中冷凍干燥，得到凍干粉；將凍干粉使用反相高效液相色譜儀進行進一步分離純化，得到咸味多肽。上述的多肽食鹽替代物的制備方法，其在于所述的步驟O)中步驟O)中進行 G-25葡聚糖層析和G-15葡聚糖層析時的洗脫速度為lml/min，用反相高效液相色譜儀進行進一步分離純化時的B液為乙腈+0.01% TFA(ν/ν/%)，洗脫梯度為30^-60% B，洗脫時間:60min。本發(fā)明通過單因素實驗及正交實驗確定大豆蛋白酶解的最適溫度、pH、時間、最適酶添加量等條件。根據(jù)感官評定結(jié)果，通過多次試驗確定葡聚糖凝膠層析流速等條件，反相高效液相色譜的最適進樣量及B液的最適濃度梯度等條件，最終分離純化得到咸味多肽。多肽食鹽替代物的制備方法包括1.酶解液的制備稱取大豆蛋白溶于蒸餾水中制成8 15g/L的大豆蛋白溶液， 加熱使蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)被破壞，解螺旋從而利于酶對其進行切割。接著加入Alcalase酶及胃蛋白酶，使其在最適的條件下對大豆蛋白進行定向切割。最后高速離心保留上清液去除雜質(zhì)，得到多肽混合液。2.咸味多肽的分離純化及測序首先將得到的多肽混合液經(jīng)G-25葡聚糖凝膠層析，進行脫鹽并去除一部分分子量大的多肽，然后經(jīng)感官評定選出具有咸味或近似咸味的組分。這些組分再經(jīng)G-15葡聚糖凝膠層析，得到分子量相近的多肽段。接著使用反相高效液相色譜儀對其進行分離純化，再經(jīng)感官評定得出具有咸味的多肽。最后采用蛋白質(zhì)測序儀對分離得到的咸味多肽進行測序，得到其序列。即制得具有咸味的多肽。3.咸味多肽的感官鑒定采用“與對照的差異檢驗”法將呈梯度濃度的咸味多肽溶液與特定濃度的NaCl溶液進行比較，從而得到咸味多肽的咸度。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明以大豆蛋白為原料，通過葡聚糖凝膠層析以及反相高效液相色譜的分離， 制得了純凈的咸味多肽，重復性高，結(jié)果精確可靠。本發(fā)明是我國首次對咸味肽進行研究。開發(fā)出的咸味肽在保證咸味的同時能降低鈉離子的攝入，避免了由于高鈉離子攝入而引起的一系列疾病，從而更加保健，深受廣大消費者歡迎，具有很好的經(jīng)濟價值及市場前景。
本發(fā)明是首次研究對肉品加工既有調(diào)味作用又有改變其物化性質(zhì)且對人的營養(yǎng)有益的食鹽替代物。本發(fā)明是首次對天然資源進行酶解，并從中分離出咸味肽，更加安全可靠。


圖1為咸味肽高效液相色譜圖。
具體實施例方式實施例11.酶解液的制備1)稱取Ig大豆蛋白溶于IOOml水中，在80 85°C條件下加熱15 20min。2)冷卻，加入Alcalase酶(諾維信)0. 06ml，在42 47 °C條件下反應100 120mino3)于95 100°C條件下加熱15 20min，滅活。4)冷卻，調(diào)節(jié)溶液的pH至1.0，加入胃蛋白酶0. 04g，于46 50°C下反應100 120mino5)于95 100°C條件下加熱15 20min，滅活。6)使用高速離心機，在SOOOrpm條件下離心15 20min。保留上清液去除沉淀。
2.咸味多肽的分離純化及測序1)吸取2ml多肽混合液加到G-25葡聚糖層析柱中，以lml/min的流速進行脫鹽及初步分離，收集分離得到的組分。2)選取15 20名感官評定員對收集的組分進行感官評定，選出其中具有咸味的組分。3)重復G-25葡聚糖層析數(shù)次，收集足夠量含有咸味多肽的組分。4)將收集的目標溶液進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮從而提高咸味多肽的濃度。5)吸取2ml的濃縮液加到G-15葡聚糖層析柱中，以lml/min的流速進行進一步地分離，收集分離得到的組分。6)選取15 20名感官評定員對收集的組分進行感官評定，選出其中具有咸味的組分。7)重復G-15葡聚糖凝膠層析數(shù)次，收集足夠量的目的肽混合物。8)將經(jīng)G-15葡聚糖層析收集的咸味多肽混合物放入冷凍干燥干燥機中，進行冷凍干燥，得到凍干粉。9)將凍干粉使用反相高效液相色譜儀進行進一步分離純化，通過多次的分離純化，得到高純度的咸味多肽。樣品加樣量為25ul、B液洗脫梯度為30% 60%8、洗脫時間:60min。B 液為乙腈 +0. 01% TFA (v/v/% )。10)使用蛋白質(zhì)測序儀對咸味多肽進行測序，得到其氨基酸序列為Gly-Lys。
3.多肽咸度的鑒定采用“與對照的差異檢驗法”對多肽咸度進行鑒定，具體方法如下1)按質(zhì)量百分含量計，配制濃度為0.6%的食鹽溶液作為對照，濃度分別為
50.4%,0.6%,0.8%,1.0%,1.2%的咸味肽溶液作為樣品。同時配制相同濃度的食鹽溶液
作為盲樣。2)將樣品及盲樣進行隨機數(shù)字編碼，將樣品與對照以小組的形式呈遞。每組中包括一個樣品和一個對照，其中對照溶液標志出來。3)選取30 50名評價員對其進行評定，一次評定5個樣品，評價6次。評定待測樣品與對照之間的差異度，并打分。每個分值對應相對的差異程度。4)將最終的結(jié)果進行方差分析，得到與濃度為0. 6%的食鹽溶液咸度相當?shù)臉悠啡芤簼舛?，從而得到咸味多肽的咸度。評定結(jié)果如下樣品類別溶液評定說明1.你將成對分別評定5個樣品，每一對的第一個評定是對照，記錄樣品編號；2.評定樣品的咸度，并用如下尺度表示樣品與對照間的差異程度，將你認為最能表達與對照樣差異程度的尺度值填入評定結(jié)果。-3——比對照咸味極淡-2——比對照咸味很淡-1——比對照咸味較淡0——咸度與對照并無差異1——比對照較咸2——比對照很咸3——比對照極咸表1采用“與對照的差異檢驗法”對多肽咸度進行鑒定的鑒定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種多肽食鹽替代物，其特征在于由包括下述步驟的方法制成(1)制備酶解液將大豆蛋白制成水溶液、并水浴反應后；加入Alcalase酶酶解并滅活，調(diào)節(jié)PH值后，再加入胃蛋白酶酶解并滅活，離心留上清；(2)分離純化目標多肽將步驟(1)制備的大豆蛋白酶解液加入到G-25葡聚糖層析柱中進行脫鹽及初步分離，收集具有咸味的組分；然后將目標溶液濃縮并進行G-15葡聚糖凝膠層析，再次收集具有咸味的組分；將經(jīng)G-15葡聚糖層析收集的咸味多肽混合物放入冷凍干燥機中冷凍干燥，得到凍干粉；將凍干粉使用反相高效液相色譜儀進行進一步分離純化， 得到純凈的咸味多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽食鹽替代物，其特征在于所述的多肽食鹽替代物氨基酸序列為Gly-Lys。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽食鹽替代物，其特征在于步驟(1)中制成的大豆蛋白水溶液的濃度為8 15g/L，水浴條件為80 85°C反應15 20min ；Alcalase酶酶解反應條件為42 47°C反應100 120min ；胃蛋白酶酶解反應條件為46 50°C反應100 120min ；兩次酶解反應后滅活條件為95 100°C滅活15 20min ；Alcalase酶酶解反應后將反應溶液的PH值調(diào)成1. 0。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽食鹽替代物，其特征在于步驟(1)制備酶解液的過程中， 大豆蛋白與Alcalase酶的質(zhì)量體積比(g/ml)為1 0. 05 0. 07，大豆蛋白與胃蛋白酶的質(zhì)量比為1 0. 03 0. 05。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽食鹽替代物，其特征在于步驟( 中進行G-25葡聚糖層析和G-15葡聚糖層析時的洗脫速度為lml/min，用反相高效液相色譜儀進行進一步分離純化時的B液為乙腈+0.01% TFA(v/v/% )，洗脫梯度為30% 60% B，洗脫時間60min。
6.權(quán)利要求1或2所述的多肽食鹽替代物的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)制備酶解液稱取大豆蛋白溶于水中制成8 15g/L的溶液，將溶液在80 85°C水浴條件下反應15 20min，冷卻后加入Alcalase酶于42 47°C反應100 120min，95 100°C滅活15 20min ；調(diào)至pH為1. 0后，加入胃蛋白酶于46 50°C反應100 120min， 95 100°C滅活15 20min，離心保留上清液；其中大豆蛋白與Alcalase酶的質(zhì)量體積比 (g/ml)為1 0.05 0.07，大豆蛋白與胃蛋白酶的質(zhì)量比為1 0. 03 0. 05 ；(2)分離純化目標多肽將步驟(1)制備的大豆蛋白酶解液加入到G-25葡聚糖層析柱中進行脫鹽及初步分離，收集具有咸味的組分；然后將目標溶液濃縮并進行G-15葡聚糖凝膠層析，再次收集具有咸味的組分；將經(jīng)G-15葡聚糖層析收集的咸味多肽混合物放入冷凍干燥機中冷凍干燥，得到凍干粉；將凍干粉使用反相高效液相色譜儀進行進一步分離純化， 得到咸味多肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的多肽食鹽替代物的制備方法，其特征在于所述的步驟O)中步驟O)中進行G-25葡聚糖層析和G-15葡聚糖層析時的洗脫速度為lml/min，用反相高效液相色譜儀進行進一步分離純化時的B液為乙腈+0.01% TFA(V/V/% )，洗脫梯度為 30% 60% B，洗脫時間60min。
全文摘要
本發(fā)明屬于食品領域，具體公開了一種多肽食鹽替代物及其制備方法，通過大豆蛋白的酶解、目標多肽的分離純化及測序，最終制得具有咸味的多肽，制備工藝包括用Alcalase酶及胃蛋白酶對大豆蛋白進行定向切割得到多肽混合液；使用葡聚糖凝膠層析柱、反相高效液相色譜儀對目的多肽進行分離純化；目標多肽的咸味評定。本發(fā)明采用天然的大豆蛋白作為原料，制得咸味多肽，能夠部分代替食鹽減少鈉離子的攝入，避免了由于長期高鈉飲食引起的一系列的疾病，因而會受到廣大消費者的歡迎，具有很大的經(jīng)濟效益和廣闊的市場前景。
文檔編號A23L1/237GK102224921SQ20111012119
公開日2011年10月26日 申請日期2011年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月11日
發(fā)明者張雅瑋, 彭增起, 郭秀云 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學