專利名稱：基于基因沉默技術(shù)的灰飛虱致死基因片段Chitinase 7及其dsRNA的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本 發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及基于基因沉默技術(shù)的灰飛虱致死基因片段 Chitinase 7 及其 dsRNA。
背景技術(shù)：
在我國，化學藥劑連續(xù)單一長期使用已導致灰飛虱對多種農(nóng)藥產(chǎn)生了不同程度的抗性，需要不斷加大農(nóng)藥使用量才能達到滿意的防治效果，造成了更為嚴重的環(huán)境污染，形成惡性循環(huán)。另外灰飛虱傳播條紋病毒引起的水稻條紋葉枯病，發(fā)病后藥劑控制效果較差， 只能依靠治蟲防病。因此，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實踐中，急需化學農(nóng)藥之外的替代防治手段。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是一種由雙鏈RNA介導的基因沉默現(xiàn)象，雙鏈RNA最終被加工大小約為22nt的小RNA (siRNA)，通過序列配對的方式與蛋白編碼基因結(jié)合，根據(jù)序列配對的程度降解靶標基因mRNA或抑制基因的蛋白翻譯過程。RNAi廣泛地存在于真菌、植物和動物中。2006年Andre Fire和Craig Mello因發(fā)現(xiàn)RNAi現(xiàn)象被授予諾貝爾醫(yī)學與生理獎。在生物體中，一些重要的基因?qū)S持生命是必須的。因此，從理論上而言，如果利用RNA干擾技術(shù)將農(nóng)業(yè)害蟲中重要基因的表達進行干擾，則會引起害蟲的致畸或致死，從而達到控制害蟲的目的。本專利發(fā)明就是利用實驗室改進的dsRNA喂食法從灰飛虱中篩選出經(jīng)干擾后能夠?qū)е禄绎w虱死亡的重要基因，為建立利用RNA干擾技術(shù)控制害蟲的新策略提供序列和數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種灰飛虱致死基因片段 Chitinase 7及其克隆方法。本發(fā)明的另一方法是提供該致死基因片段Chitinase 7的dsRNA及其合成方法。本發(fā)明的又一目的是提供一種用于篩選致死基因的dsRNA喂食法。本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)灰飛虱致死基因片段Chitinase 7，序列如SEQ ID NO. 1所示。所述的灰飛虱致死基因片段Chitinase 7的克隆方法，包括如下步驟(1)取灰飛虱，提取總RNA，以提取的灰飛虱總RNA合成cDNA第一條鏈；(2)以步驟(1)合成的灰飛虱cDNA第一條鏈為模板，以序列為SEQ ID NO. 2的上游引物Pl、序列為SEQ ID NO. 3的下游引物P2進行RT-PCR擴增；(3) PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目標DNA片段；(4)將回收的目標DNA片段在T3連接酶作用下插入至pEASY_T3載體中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Tl，涂于含有x-gal、IPTG以及氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)，過夜；(5)通過挑選白色單菌落，篩選陽性重組子；
(6)用含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液將重組子擴增，提取克隆質(zhì)粒；(7)全自動序列儀進行測序，得到SEQ ID NO. 1所示的Chitinase 7基因片段。其中，所述的RT-PCR擴增體系為反應(yīng)緩沖液5μ L，Mg2+4y L，dNTP 4μ L，cDNA模板 2yL，上游引物 Pl lyL，下游引物 P2 1 μ L，R-Tag 酶 0. 5 μ L，ddH20 32. 5 μ L，共 50 μ L ； 所述的 PCR 反應(yīng)程序為941變性21^11，941 30sec, 55-62°C 30sec，72°C 30sec，38 個循環(huán)， 72°C延伸?；绎w虱致死基因片段Chitinase 7的dsRNA，序列如SEQ ID NO. 4所示。所述的灰飛虱致死基因片段Chitinase 7的dsRNA的合成方法，是以灰飛虱cDNA 第一條鏈為模板，以序列為SEQ ID W). 5的上游引物P3、序列為SEQ ID NO. 6的下游引物 P4，PCR擴增得到灰飛虱致死基因片段Chitinase 7的dsRNA。所述的灰飛虱致死基因片段Chitinase 7的dsRNA的合成方法優(yōu)選包含如下步驟(1)根據(jù)已經(jīng)驗證的Chitinase 7基因片段序列，設(shè)計并合成序列為SEQ ID NO. 5 的引物3和序列為SEQ ID NO. 6的引物4，以灰飛虱cDNA第一條鏈為模板PCR擴增得到灰飛虱致死基因片段Chitinase 7的dsRNA，PCR體系為反應(yīng)緩沖液5 μ L，Mg2+4 μ L, dNTP 4μ L, cDNA 模板 2μ L ；上游引物 Ρ3 2 4 1^，下游引物卩4 2 μ L，ExTap 酶 0. 25 μ L， ddH20 30. 75 μ L，共 50 μ L ;PCR 反應(yīng)程序為94°C 變性 2min，94°C 30sec，55-62 °C 30sec, 72°C 30sec，38 個循環(huán)，72°C 延伸。(2)PCR產(chǎn)物經(jīng)濃度為的低熔點瓊脂糖凝膠電泳分離；(3)回收目標DNA產(chǎn)物。一種灰飛虱的dsRNA喂食方法，包含如下步驟(1)將玻璃管的一端封好，用吸蟲器吸取二齡的灰飛虱加入玻璃管內(nèi)，用紗布將玻
璃管另一端封好；(2)將蟲子拍打至玻璃管封口端，將另一端的紗布取下，將已經(jīng)準備好的封口膜， 貼紙的一面朝上，蓋到玻璃管管口上，將管豎立放置；(3)用移液槍吸取含dsRNA的飼料滴在膜的中央，用一個新的封口膜，貼紙的一面朝下，貼在玻璃管管口上，將飼料和dsRNA封在兩層封口膜之間；(4)將加好飼料和dsRNA的玻璃管放回養(yǎng)蟲室的養(yǎng)蟲架上，房間溫度為26°C，利用灰飛虱的趨光習性僅在飼料端給予光照，使其趨食飼料，每24h換一次含dsRNA的飼料。有益效果利用RNAi技術(shù)沉默Chitinase 7基因，對灰飛虱具有明顯的致死效果，說明該基因可作為利用RNA干擾技術(shù)控制害蟲的有效靶點。本發(fā)明合成的Chitinase 7基因dsRNA能有效沉默Chitinase 7基因，更好地抵抗RNA酶的降解，同時合成成本較低，便于大量實驗使用。本發(fā)明采用喂食法進行RNAi干擾實驗，相對注射法，減少了蟲體的機械損傷，更加便于實驗操作。最終通過喂食實驗驗證了 Chitinase 7基因的RNAi對灰飛虱具有致死效果，為建立利用RNA干擾技術(shù)控制害蟲的新策略提供新的實驗手段。


圖IdsRNA合成電泳圖，泳道1為Marker，泳道2為Chitinase 7的dsRNA。圖2dsRNA喂食實驗致死率統(tǒng)計圖。
具體實施方式
實施例11. Chitinase 7基因片段的克隆方法(1)取灰飛虱10-20頭，用TRIzoI法提取總RNA ；(2)合成cDNA第一條鏈；(3)從灰飛虱轉(zhuǎn)錄組中獲取基因片段序列，在http://www. ncbi. nlm. nih. gov/進行同源性比對之后，預(yù)測為灰飛虱Chitinase 7基因，利用Primer premier 5. 0軟件設(shè)計 Pl和P2，以RT-PCR方法進行擴增；上游引物(Pl)5' GTGCTGCTGGATACGAT 3' (SEQ ID NO. 2)，下游引物(P2)5' GTCTGTAGGCGAATGGT 3' (SEQ ID NO. 3)；PCR 反應(yīng)程序為94°C變性 2min，94°C 30sec，55°C 30sec，72°C 30sec，35 個循環(huán)， 72°C延伸PCR 反應(yīng)體系(50 μ L)
反應(yīng)緩沖液
Mg2+4μL
dNTP4μL
cDNA 模板
上游引物PlΙμ
下游引物P 2Ιμ
R- Tag 酶0.5μ
ddH2032.5μ
總體積50μ (4) PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目標DNA片段；(5)將回收的目標片段在Τ3連接酶作用下插入至PEASY-T3載體中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Tl，涂于含x-gal 0. 02g/ml、IPTGO. 2g/ml以及氨芐青霉素50ng/ml的LB培養(yǎng)基，37°C 培養(yǎng)，過夜；(6)通過挑選白色單菌落，篩選陽性重組子；(7)用含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液將重組子擴增，提取克隆質(zhì)粒；(8)全自動序列儀進行測序(由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成)，即可得到SEQ IDN0. 1所示的核苷酸序列的Chitinase 7基因片段。實施例2. dsRNA合成及回收(1)根據(jù)已經(jīng)驗證的Chitinase 7基因片段序列，采用Primer Premier 5. 0軟件設(shè)計P3和P4，在上下游引物5，端加入T7啟動子序列TAATACGACTCACTATAGGG ；上游弓丨物(P4)5 ‘ TAATACGACTCACTATAGGGTGCTGCTGGATACGAT 3 ‘ (SEQ ID NO. 5)上游弓丨物(P5)5 ‘ TAATACGACTCACTATAGGGTCTGTAGGCGAATGGT 3 ‘ (SEQ ID NO. 6)
反應(yīng)緩沖液
Mg2+4μL
dNTP4μL
cDNA 模板
上游引物P 32μL
下游引物P 42μL
Ex Tap 酶0.25μ
ddH2030.75μ
總體積50μ PCR 反應(yīng)程序94°C 變性 2min，94°C 30sec,60°C 30sec，72°C 30sec，38 個循環(huán)， 72°C延伸。(2) PCR產(chǎn)物經(jīng)濃度為的低熔點瓊脂糖凝膠電泳分離并在紫外燈下進行觀察， 結(jié)果見圖1，其序列見SEQ ID NO. 4。(3)采用 Promega 公司的Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System 試劑盒進行回收 ①對分離得到的目標片段切膠，并放入稱量過重量(a)的1. 5ml微量離心管中，再次稱量(b)，b-a算得所切膠重；②根據(jù)膠重，每IOmg凝膠加入10 μ LMembrane Binding Solution。凝膠重量不超過 350mg ；③將凝膠放入50_65°C水浴鍋中水浴IOmin或者直到凝膠完全融化；④將試劑盒中的濾管放置在配套的收集管中，轉(zhuǎn)移融化的凝膠液體至濾管中，室溫放置Imin ；⑤16，000 Xg (14，OOOrpm)離心lmin，棄去收集管中的液體；⑥力口入 700 μ 1 Membrane Wash Solution (已力口入 95 % 酒精)， 16, 000 Xg (14, OOOrpm)離心lmin，棄去收集管中的液體；⑦力口入 500 μ 1 Membrane Wash Solution (已力口入 95 % 酒精)， 16, 000 Xg (14, OOOrpm)離心5min，棄去收集管中的液體；⑧不加液體空轉(zhuǎn)Imin ；⑨轉(zhuǎn)移濾管到1. 5ml微量離心管中，加入50 μ 1 Nuclease-Free Water，室溫放置 lmin, 16，000 Xg (14，OOOrpm)離心 Imin ；⑩收集到的DNA產(chǎn)物保存在4°C或_20°C。
實施例3. dsRNA喂食實驗(1)將玻璃管的一端用封口膜封好，用吸蟲器吸取二齡的灰飛虱加入玻璃管內(nèi)，用紗布將另一端封好；(2)將蟲子輕輕用手拍打至一端，將另一端的紗布取下，將已經(jīng)準備好的封口膜貼紙的一面朝上，均勻用力向兩側(cè)拉，拉成正方形，然后蓋到玻璃管管口上，將管豎立放置在超凈臺面上；

(3)用移液槍吸取飼料100 μ 1滴在封口膜的中央，對照只加飼料(配方見表1)， 處理組在飼料中加入Chitinase 7基因的dsRNA，dsRNA的濃度為3214ng/μ 1，用一個新的封口膜，貼紙的一面朝下，貼在玻璃管管口上，將飼料和dsRNA封在兩層封口膜之間；(4)將加好飼料和dsRNA的玻璃管放回養(yǎng)蟲室的養(yǎng)蟲架上，房間溫度為26°C，利用灰飛虱的趨光習性僅在飼料端給予光照，使其趨食飼料，每24h換一次飼料和dsRNA ；(5)連續(xù)喂食五天，每24h統(tǒng)計一次死亡率，結(jié)果見圖2，由圖2可見喂食致死基因 Chitinase 7的dsRNA能夠達到較好的致死效果。表 權(quán)利要求
1.灰飛虱致死基因片段Chitinase7，其特征在于序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.權(quán)利要求1所述的灰飛虱致死基因片段Chitinase7的克隆方法，其特征在于包括如下步驟(1)取灰飛虱，提取總RNA，以提取的灰飛虱總RNA合成cDNA第一條鏈；(2)以步驟(1)合成的灰飛虱cDNA第一條鏈為模板，以序列為SEQID NO. 2的上游引物Pl、序列為SEQ ID NO. 3的下游引物P2進行RT-PCR擴增；(3)PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目標DNA片段；(4)將回收的目標DNA片段在T3連接酶作用下插入至PEASY-T3載體中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Tl，涂于含有X-gal、IPTG以及氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)，過夜；(5)通過挑選白色單菌落，篩選陽性重組子；(6)用含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液將重組子擴增，提取克隆質(zhì)粒；(7)全自動序列儀進行測序，得到SEQID NO. 1所示的Chitinase 7基因片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的灰飛虱致死基因片段Chitinase7的克隆方法，其特征在于所述的RT-PCR擴增體系為反應(yīng)緩沖液5 μ L，Mg2+4 μ L，dNTP 4 μ L，cDNA模板2 μ L，上游引物1 μ L，下游引物lyL，R-Tag酶0.5 μ L，ddH20 32. 5 μ L，共50 μ L ；所述的PCR反應(yīng)程序為94°C變性 2min，94°C 30sec，55_62°C 30sec,72°C 30sec，38 個循環(huán)，72°C延伸。
4.權(quán)利要求1所述的灰飛虱致死基因片段Chitinase7的dsRNA，其特征在于序列如 SEQ IDN0. 4 所示。
5.權(quán)利要求4所述的灰飛虱致死基因片段Chitinase7的dsRNA的合成方法，其特征在于以灰飛虱cDNA第一條鏈為模板，以序列為SEQ ID NO. 5的上游引物P3、序列為SEQ ID NO. 6的下游引物P4進行PCR擴增得到灰飛虱致死基因片段Chitinase 7的dsRNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的灰飛虱致死基因片段Chitinase7的dsRNA的合成方法，其特征在于包含如下步驟(1)根據(jù)已經(jīng)驗證的Chitinase7基因片段序列，設(shè)計并合成序列為SEQ ID NO. 5的 P3和序列為SEQ ID NO. 6的P4，以灰飛虱cDNA第一條鏈為模板PCR擴增得到灰飛虱致死基因片段 Chitinase 7 的 dsRNA, PCR 體系為反應(yīng)緩沖液 5 μ L, Mg2+4 μ L, dNTP 4 μ L，cDNA 模板 2 μ L ；上游引物 2 μ L，下游引物 2 μ L，Ex Tap 酶 0. 25 μ L，ddH20 30. 75 μ L，共 50 μ L ； PCR 反應(yīng)程序為94°C變性 2min，94°C 30sec，55_62°C 30sec,72°C 30sec，38 個循環(huán)，72°C延伸；(2)PCR產(chǎn)物經(jīng)濃度為的低熔點瓊脂糖凝膠電泳分離；(3)回收目標DNA產(chǎn)物。
7.一種灰飛虱的dsRNA喂食方法，其特征在于包含如下步驟(1)將玻璃管的一端封好，用吸蟲器吸取二齡的灰飛虱加入玻璃管內(nèi)，用紗布將玻璃管另一端封好；(2)將蟲子拍打至玻璃管封口端，將另一端的紗布取下，將已經(jīng)準備好的封口膜，貼紙的一面朝上，蓋到玻璃管管口上，將管豎立放置；(3)用移液槍吸取含dsRNA的飼料滴在膜的中央，用一個新的封口膜，貼紙的一面朝下，貼在玻璃管管口上，將飼料和dsRNA封在兩層封口膜之間；(4)將加好飼料和dsRNA的玻璃管放回養(yǎng)蟲室的養(yǎng)蟲架上，房間溫度為26°C，利用灰飛虱的趨光習性僅在飼料端給予光照，使其趨食飼料，每24h換一次含dsRNA的飼料。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的dsRNA喂食方法，其特征在于所述的dsRNA為灰飛虱致死基因片段 Chitinase 7 的 dsRNA。
全文摘要
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及基于基因沉默技術(shù)的灰飛虱致死基因片段Chitinase7及其dsRNA。本專利發(fā)明就是利用實驗室改進的dsRNA喂食法從灰飛虱中篩選出經(jīng)干擾后能夠?qū)е禄绎w虱死亡的序列如SEQ ID NO.1所示的灰飛虱致死基因片段Chitinase 7，利用該基因片段的dsRNA喂養(yǎng)灰飛虱，可使灰飛虱的死亡率可達70％，為建立利用RNA干擾技術(shù)控制害蟲的新策略提供序列和數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/10GK102220341SQ20111012301
公開日2011年10月19日 申請日期2011年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月12日
發(fā)明者姜衛(wèi)華, 李國清, 李飛, 董雙林, 韓召軍 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學