專利名稱：用于檢測(cè)溶血性鏈球菌全族群的熒光pcr引物、探針及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域，尤其涉及用于檢測(cè)溶血性鏈球菌全族群的熒光PCR引物、探針及方法。
背景技術(shù)：
溶血性鏈球菌是重要的食源性致病菌，能導(dǎo)致化膿、敗血等癥狀。在日常檢驗(yàn)中的溶血性鏈球菌屬于常規(guī)檢驗(yàn)項(xiàng)目，檢測(cè)任務(wù)繁重。在溶血性鏈球菌引起的食品安全事件中， 大部分是由A群溶血性鏈球菌感染引起的，但是近年來C、G群溶血性鏈球菌所引起的感染案例呈遞增趨勢(shì)。目前，溶血性鏈球菌的檢測(cè)方法主要依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)《GB/T 4789. 11-2003食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)溶血性鏈球菌檢驗(yàn)》，以下簡(jiǎn)稱為國標(biāo)方法。國標(biāo)方法通過革蘭氏染色、觀察溶血、桿菌肽敏感試驗(yàn)及鏈激酶試驗(yàn)對(duì)溶血性鏈球菌進(jìn)行微生物學(xué)檢驗(yàn)。國標(biāo)方法進(jìn)行溶血性鏈球菌的檢測(cè)需經(jīng)選擇性增菌、分離純化、生化鑒定等步驟， 檢測(cè)周期通常需要5 7天。對(duì)于污染嚴(yán)重的樣品，混雜了大量環(huán)境細(xì)菌，而在培養(yǎng)過程中， 由于目前的增菌液并非很好的選擇性培養(yǎng)基，導(dǎo)致一些非目標(biāo)菌的大量繁殖，增加了目標(biāo)菌的分離純化難度，若是檢驗(yàn)人員沒有足夠豐富的工作經(jīng)驗(yàn)則容易導(dǎo)致漏檢。對(duì)于一些復(fù)雜樣品(如食品)，不同的加工工藝導(dǎo)致了其內(nèi)在成分差異很大，例如含糖量、PH值、含鹽量等，其自身的這些復(fù)雜情況可能會(huì)改變培養(yǎng)基的成分、PH值、鹽分等，從而干擾細(xì)菌的培養(yǎng)， 可能導(dǎo)致漏檢。因此，現(xiàn)有的國標(biāo)方法存在檢測(cè)周期長(zhǎng)，檢測(cè)步驟繁瑣，對(duì)檢驗(yàn)人員的經(jīng)驗(yàn)要求較高，容易導(dǎo)致漏檢的缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題(檢測(cè)周期長(zhǎng)，檢測(cè)步驟繁瑣，對(duì)檢驗(yàn)人員的經(jīng)驗(yàn)要求較高，容易導(dǎo)致漏檢)，本發(fā)明提供用于檢測(cè)溶血性鏈球菌全族群的熒光PCR引物、探針及方法。本發(fā)明以A、C、G群溶血性鏈球菌的溶血素S為靶基因位點(diǎn)，通過在NCBI數(shù)據(jù)庫中下載溶血素S的靶基因序列進(jìn)行序列比對(duì)，找到了保守于A、C、G群溶血性鏈球菌中的序列，根據(jù)該序列設(shè)計(jì)熒光PCR引物和探針。一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于檢測(cè)溶血性鏈球菌全族群的熒光PCR引物和探針，引物和探針的核苷酸序列為
正向引物 Pl :5，-GCTACTAGTGTAGCTGAAACAA-3，(SEQ ID NO 1)； 反向引物 P2 :5，-AGCAACAAGTAGTACAGCAGCA -3，(SEQ ID NO 2)； 探針5，-AAACAACTCAAGTTGCTCCTGGAGG-3，(SEQ ID NO 3)； 該探針的5’端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)。
作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述熒光報(bào)告基團(tuán)選自FAM、HEX、TET或JOE ；所述熒光淬滅基團(tuán)為TAMRA。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述熒光報(bào)告基團(tuán)選自FAM、HEX、ΤΕΤ、JOE、CY3、CY5、 ROX, TAMRA或iTexas Red ；所述熒光淬滅基團(tuán)為BHQ。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述熒光報(bào)告基團(tuán)選自FAM、HEX、ΤΕΤ、JOE、TAMRA或 ROX ；所述熒光淬滅基團(tuán)為ECLIPSE。另一方面，本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)溶血性鏈球菌全族群的熒光PCR檢測(cè)方法， 其特征在于包括如下步驟
A)DNA模板的制備；
B)配制含有如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述引物和探針的反應(yīng)體系，對(duì)DNA模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，在ABI7500熒光定量PCR儀上的運(yùn)行條件為95°C 3min ；95°C 15s，60°C 34s, 40 個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束后收集熒光信號(hào)；
C)反應(yīng)結(jié)束后，讀取并記錄擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(Ct)，根據(jù)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果的判斷。探針熒光基團(tuán)標(biāo)記在探針的5’端，而淬滅基團(tuán)則在3’端。當(dāng)完整的探針與目標(biāo)序列配對(duì)時(shí)，5’端發(fā)光基團(tuán)因與3’端的淬滅基團(tuán)接近，其發(fā)射的熒光被淬滅。當(dāng)PCR反應(yīng)到延伸步驟時(shí)，DNA聚合酶的5’外切酶活性將探針酶切斷裂，使發(fā)光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離， 從而使發(fā)光基團(tuán)發(fā)出熒光信號(hào)。隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加，釋放出來的熒光基團(tuán)不斷積累，因此熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量呈正比關(guān)系。Ct值(cycle threshold, Ct)的定義為每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。閾值的設(shè)定一般是將其設(shè)定為恰好可以覆蓋住陰性對(duì)照和空白對(duì)照的熒光值處，因此可以很好的去除反應(yīng)管熒光值即背景。檢測(cè)結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)為Ct值< 35時(shí)，可判定檢測(cè)結(jié)果為陽性；Ct值> 40時(shí)，可判定檢測(cè)結(jié)果為陰性；35<Ct值<40時(shí)，需適當(dāng)增加模板量重復(fù)擴(kuò)增，如果得到Ct值> 40， 則可判定檢測(cè)結(jié)果為陰性，否則判定檢測(cè)結(jié)果為陽性。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果有
1)特異性強(qiáng)本發(fā)明摒棄了以往研究中采用的溶血素0、鏈激酶、M蛋白等常用靶基因位點(diǎn)，以A、C、G群溶血性鏈球菌的溶血素S為靶基因位點(diǎn)，通過在NCBI數(shù)據(jù)庫中下載溶血素S的靶基因序列進(jìn)行序列比對(duì)，找到了保守于A、C、G群溶血性鏈球菌中的序列，根據(jù)該序列設(shè)計(jì)熒光PCR引物及探針，因此能夠?qū)、C、G群溶血性鏈球菌進(jìn)行特異的檢驗(yàn)；
2)檢測(cè)范圍廣可同時(shí)對(duì)A、C、G群溶血性鏈球菌進(jìn)行檢驗(yàn)，可防止漏檢；
3)靈敏度高增菌18h，可在含有初始濃度為3CFU/mL的樣品增菌液檢出A群溶血性鏈球菌，可在含有初始濃度為2 CFU/mL的樣品增菌液檢出G群溶血性鏈球菌，可在含有初始濃度為50 CFU/mL的樣品增菌液檢出C群溶血性鏈球菌；
4)檢測(cè)效率高檢測(cè)周期由國標(biāo)方法的5 7天縮短為增菌1 后經(jīng)歷Ih左右的PCR反應(yīng)程序，檢測(cè)時(shí)間短，且可同時(shí)檢測(cè)96個(gè)樣品，檢測(cè)量大；
5)操作簡(jiǎn)單且結(jié)果直接客觀操作步驟簡(jiǎn)單，自動(dòng)化程度高，Ct值為儀器自動(dòng)生成，結(jié)果直接客觀，對(duì)操作人員的經(jīng)驗(yàn)要求不高；
6)安全性好由于操作時(shí)所處理的菌需經(jīng)過水煮法制備DNA，因此操作人員可避免直接接觸高濃度的活菌，對(duì)操作人員有一定的保護(hù)性。


圖1熒光PCR檢測(cè)溶血性鏈球菌的特異性。圖2熒光PCR檢測(cè)樣品的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。實(shí)施例1引物和探針的設(shè)計(jì)和合成。具有乙型溶血特征的鏈球菌主要為A、B、C、G群鏈球菌，而具有鏈激酶陽性特征的鏈球菌為A、C、G群鏈球菌，對(duì)于具有桿菌肽陽性特征的鏈球菌為哪幾群則未在文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)相關(guān)報(bào)道，因此開展桿菌肽敏感實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如表1所示，桿菌肽紙片抑菌圈直徑大于IOmm判定為桿菌肽敏感即桿菌肽敏感實(shí)驗(yàn)陽性，用+表示；桿菌肽紙片抑菌圈小于等于IOmm判定為桿菌肽耐藥即桿菌肽敏感實(shí)驗(yàn)陰性，用-表示。結(jié)果表明同時(shí)具有桿菌肽實(shí)驗(yàn)陽性和乙型溶血特征的菌株為A、C、G 群溶血性鏈球菌。
權(quán)利要求
1.用于檢測(cè)溶血性鏈球菌全族群的熒光PCR引物和探針，其特征在于引物和探針的核苷酸序列為引物 Pl :5’ -GCTACTAGTGTAGCTGAAACAA-3’ ； 引物 P2 :5’ -AGCAACAAGTAGTACAGCAGCA-3’ ； 探針5，-AAACAACTCAAGTTGCTCCTGGAGG-3，； 該探針的5’端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)溶血性鏈球菌全族群的熒光PCR引物和探針，其特征在于所述熒光報(bào)告基團(tuán)選自FAM、HEX、TET或JOE ；所述熒光淬滅基團(tuán)為TAMRA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)溶血性鏈球菌全族群的熒光PCR引物和探針，其特征在于所述熒光報(bào)告基團(tuán)選自FAM、HEX、ΤΕΤ、JOE、CY3、CY5、ROX, TAMRA或Texas Red ；所述熒光淬滅基團(tuán)為BHQ。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)溶血性鏈球菌全族群的熒光PCR引物和探針，其特征在于所述熒光報(bào)告基團(tuán)選自FAM、HEX、ΤΕΤ、JOE、TAMRA或ROX ；所述熒光淬滅基團(tuán)為 ECLIPSE。
5.一種用于檢測(cè)溶血性鏈球菌全族群的熒光PCR檢測(cè)方法，其特征在于包括如下步驟A)DNA模板的制備；B)配制含有如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述引物和探針的反應(yīng)體系，對(duì)DNA模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，運(yùn)行條件為95°C 3min ；95°C 15s,60°C 34s，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束后收集熒光信號(hào)；C)反應(yīng)結(jié)束后，讀取并記錄擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(Ct)，根據(jù)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果的判斷。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于檢測(cè)溶血性鏈球菌全族群的熒光PCR引物、探針及方法，屬于檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域。本發(fā)明以A、C、G群溶血性鏈球菌的溶血素S為靶基因位點(diǎn)，設(shè)計(jì)熒光PCR引物及探針，建立了用于檢測(cè)溶血性鏈球菌全族群的熒光PCR檢測(cè)方法。本發(fā)明主要應(yīng)用于溶血性鏈球菌的檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/14GK102226215SQ201110131978
公開日2011年10月26日 申請(qǐng)日期2011年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月20日
發(fā)明者嚴(yán)瓊英, 蘭全學(xué), 李意, 楊國武, 林霖, 祝仁發(fā), 賴心田, 陳國培, 陳血建 申請(qǐng)人:深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院