專利名稱：一種高效制備綿羊克隆胚胎的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高效制備綿羊克隆胚胎的方法，屬于胚胎移植的方法領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
目前，生產(chǎn)哺乳動物克隆的方法主要有胚胎分割和細胞核移植兩種。克隆羊“多莉”，以及其后各國科學(xué)家培育的各種克隆動物，采用的都是細胞核移植技術(shù)。所謂細胞核移植，是指將不同發(fā)育時期的胚胎或成體動物的細胞核，經(jīng)顯微注射和細胞融合方法移植到卵母細胞中，重新組成胚胎并使之發(fā)育成熟的過程。與胚胎分割技術(shù)不同，細胞核移植技術(shù)，特別是細胞核連續(xù)移植技術(shù)可以產(chǎn)生無限個遺傳相同的個體。由于細胞核移植是產(chǎn)生克隆動物的有效方法，故人們往往把它稱為動物克隆技術(shù)。目前細胞核移植過程中，操作人員大都僅憑主觀判斷來挑選用作成熟的卵母細胞，所有關(guān)于豬，山羊，綿羊、牛(Keefer，CL, H. , Baldassarre, R. , Keyston. 2001. Generation of dwarf goat (Capra hircus) clones following nuclear transfer with transfected and nontransfected fetal fibroblasts and in vitro—matured oocytes. Biology of Reproduction, vol. 64 no. 3 849-856;翁凡，鄭小亮，劉哲.哺乳動物卵母細胞去核方法的研究進展[J]，安徽農(nóng)學(xué)通報.2007年21期；桑國俊，牛卵母細胞及體外胚培養(yǎng)技術(shù)研究D)].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué).2008年；吳志南，山羊卵泡卵體外成熟、體外受精及冷凍保存方法的研究[D].揚州大學(xué).2005年)的卵母細胞篩選的報道和論文都是采取在體視顯微鏡下挑選有2-3層顆粒細胞的卵丘-卵母細胞復(fù)合體的方法，并不進行初步的篩選。且胚胎融合率較低，導(dǎo)致大量胚胎浪費及高昂成本，因此急需開發(fā)一套高效制備綿羊克隆胚胎的方法，包括優(yōu)質(zhì)核供體細胞的制備方法、通過攪拌法初步篩選綿羊卵母細胞以提高綿羊卵母細胞的成熟效率，提高核移植操作的效率，提高融合效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種高效制備綿羊克隆胚胎的方法，以提高綿羊克隆胚胎制作效率。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過攪拌篩選提高綿羊卵母細胞的體外成熟效率； 選取長勢良好的生長匯合的成纖維細胞作為核供體；采取擠壓去核同時注核的方法提高核移植效率；通過優(yōu)化融合液配方提高胚胎融合效率。具體實施步驟為
成熟綿羊卵母細胞的制備將采集的卵巢置于30°C-35°C的滅菌生理鹽水中，lh-池內(nèi)運回實驗室。用預(yù)溫的生理鹽水清洗卵巢，用帶8#針頭的IOml注射器，內(nèi)有吸卵液(含青霉素(100IU/ml)、鏈霉素(100IU/ml)，0· 5%FBS，25mg/ml 肝素 TCM199 (Tissue Culture Medium 199 ，吸取卵巢表面2mm-6mm大小的卵泡，卵泡液收集于燒杯中，靜置5min后卵泡液凝集為絮狀，用細棒輕柔攪拌凝集物，待凝集物聚集成團后將凝集團扯碎并繼續(xù)攪拌。將攪拌后卵泡液放在體視顯微鏡下收集有兩層以上卵丘細胞包裹的綿羊卵母細胞用于成熟，將收集的卵丘-卵母細胞復(fù)合體(Cumulus Oocyte Complexes, COCs)在成熟液中洗3遍， 置于ΙΟΟμΙ成熟培養(yǎng)液微滴中，每滴放15個COCs，置于38. 5°C、5%C02、飽和濕度的培養(yǎng)箱
中成熟培養(yǎng)。供體細胞的準(zhǔn)備剖腹取40天胚齡的綿羊胎兒頭部皮膚，盡量撕碎，將組織塊按 5mm左右間隔，接種在50 ml卡氏培養(yǎng)瓶的瓶底，每個瓶接種約25塊左右，要盡量將組織塊的切面貼在瓶底上，使組織塊粘附在瓶底，放入培養(yǎng)箱，靜置池-處，加5ml含15%FBS(fetal calf serum)的DMEM/F12 (Dulbecco's modified Eagle's medium mixed 1:1 with Ham's F-12)培養(yǎng)液，放入37°C、5%C02、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)3d后，換5ml含15%FBS的 DMEM/F12新鮮培養(yǎng)液。以后每3d換培養(yǎng)液一次，3_4d可明顯看到組織塊周圍有細胞長出， 細胞向周圍擴展，5d-8d由組織塊長出的細胞匯合，用0. 05%TE (胰蛋白酶一 EDTA)消化傳代，篩選長勢旺盛的成纖維細胞，取5代以內(nèi)的自然生長匯合的成纖維細胞作為核供體，用 0. 05%TE 37°C消化lmin，離心收集細胞后用操作液清洗3次放4°C冰箱備用?？寺∨咛サ闹苽?br> 1.將成熟培養(yǎng)22h-24h后的綿羊卵母細胞置于無血清的H-M199 (HEPES-TCM199)中， 用移液器反復(fù)吹吸成熟綿羊卵母細胞，待成熟綿羊卵母細胞周圍的卵丘細胞部分脫落，再將成熟綿羊卵母細胞移入含0. 25%透明質(zhì)酸酶的H-M199中作用5min，然后用含10%FBS的 H-M199反復(fù)吹吸綿羊卵母細胞，直到無卵丘細胞為止。以排出第一極體為成熟標(biāo)準(zhǔn)，于顯微鏡下檢查成熟情況。2.選取5代以內(nèi)的自然生長匯合的成纖維細胞作為核供體，用0. 05%TE37°C消化 lmin，終止消化后，離心收集細胞，用操作液清洗3次放4°C冰箱備用。3.挑選排放第一極體并且形態(tài)正常的綿羊卵母細胞，置于7. 5μδ/πι1細胞松弛素(CCB)中，作用5min，然后用含10%FBS的H-M199清洗3遍，置于覆蓋有石蠟油10μ1含 10%FBS的H-M199的微滴中，并將核供體細胞也置于微滴中，在顯微操作系統(tǒng)下，用持卵針吸住綿羊卵母細胞，使極體處在5點鐘的位置，用內(nèi)徑為20Mm去核針扎破透明帶擠出第一極體及其附近少量胞質(zhì)，從破口處將供體成纖維細胞直接注射到去核綿羊卵母細胞透明帶下，輕輕觸壓使供體細胞與細胞膜緊密接觸。重構(gòu)胚胎的融和及體外培養(yǎng)供體細胞注射完成后立即用融合液融合，融合后放入成熟液中，培養(yǎng)4h后，用含5mM離子霉素5%FBS的H-M199中激活5min，移入含有2mM 6-DMAP (6-二甲基氨基)的輸卵管上皮培養(yǎng)液(SOFaa)中培養(yǎng)4h。將重構(gòu)胚置于ΙΟΟμΙ的 SOFaa培養(yǎng)液微滴中培養(yǎng)，每個微滴放入15枚重構(gòu)胚，置于38. 5°C、5%C02、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 后檢查卵裂情況，連續(xù)培養(yǎng)7d檢查囊胚情況。本發(fā)明通過攪拌法篩選的綿羊卵母細胞大部分處于同一時期，成熟的時間統(tǒng)一， 成熟過度的綿羊卵母細胞均凝集，質(zhì)量差的卵丘細胞完全脫落，便于篩選，提高成熟率。采用本發(fā)明制作的成纖維細胞活力好，生長旺盛，接觸性抑制可以將細胞周期調(diào)整到GO期， 可以在卵細胞中啟動重編程，發(fā)育到囊胚。本發(fā)明提供的融合液可以使融合效率提高到95% 以上，大大提高了克隆胚胎的成功率，且不影響后續(xù)的胚胎發(fā)育。采用本發(fā)明提供的方法降低了克隆胚胎制作過程中的胚胎損失，提高了克隆胚胎的效率，是一種高效制備綿羊優(yōu)質(zhì)克隆胚胎的方法。
具體實施例方式實施例1綿羊卵母細胞的成熟
將新鮮采集的綿羊卵巢置于30°C _35°C的滅菌生理鹽水中，lh-池內(nèi)運回實驗室。用預(yù)溫的生理鹽水清洗卵巢，用帶8#針頭的IOml注射器，內(nèi)有吸卵液(含青霉素(100IU/ml)、 鏈霉素(100IU/ml)，0. 5%FBS, 25mg/ml肝素的TCM199)，吸取卵巢表面2mm-6mm大小的卵泡， 卵泡液收集于燒杯中，靜置5min后卵泡液凝集為絮狀，用細棒輕柔攪拌凝集物，待凝集物聚集成團后將凝集團扯碎并繼續(xù)攪拌。將攪拌后卵泡液放在體視顯微鏡下收集有兩層以上卵丘細胞包裹的綿羊卵母細胞用于成熟，將收集的COCs在成熟液中洗3遍，置于ΙΟΟμΙ成熟培養(yǎng)液微滴中，每滴放15個COCs，置于38. 5°C、5%C02、飽和濕度的培養(yǎng)箱中成熟培養(yǎng)。培養(yǎng)17h后第一極體排出率90. 9%(1504/1654)。成熟液15%PG處理后發(fā)情綿羊血清 10 μδ/πι1 FSH, 20 μδ/πι1 LH, 1. 5 Pg/ml 17-BE2 溶于 TCM199。實施例2供體細胞的準(zhǔn)備
剖腹取40天胚齡的綿羊胎兒頭部皮膚，盡量撕碎，將組織塊按5mm左右間隔，接種在50 ml卡氏培養(yǎng)瓶的瓶底，每個瓶接種約25塊左右，要盡量將組織塊的切面貼在瓶底上，使組織塊粘附在瓶底，放入培養(yǎng)箱，靜置池-處，加5ml含15%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，放入37°C、 5%C02、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)3d后，換5ml含15%FBS的DMEM/F12新鮮培養(yǎng)液。以后每3d換培養(yǎng)液一次，3d-4d可明顯看到組織塊周圍有細胞長出，細胞向周圍擴展，5d — 8d 由組織塊長出的細胞匯合，可消化傳代，篩選長勢旺盛的成纖維細胞，鑒定核型，制作生長曲線，選取5代以內(nèi)的自然生長匯合的成纖維細胞作為核供體，用0. 05%TE37°C消化lmin， 離心收集細胞后用操作液清洗3次放4°C冰箱備用。實施例3克隆胚胎的制作
1.將成熟培養(yǎng)22h-24h后的綿羊卵母細胞置于無血清的H-M199中，用移液器反復(fù)吹吸成熟綿羊卵母細胞，待成熟綿羊卵母細胞周圍的卵丘細胞部分脫落，再將成熟綿羊卵母細胞移入含0. 25%透明質(zhì)酸酶的H-M199中作用5min，然后用含10%FBS的H-M199清洗綿羊卵母細胞，直到無卵丘細胞為止。以排出第一極體為成熟標(biāo)準(zhǔn)，于顯微鏡下檢查成熟情況。2.選取5代以內(nèi)的自然生長匯合的成纖維細胞作為核供體，用0. 05%TE37°C消化 lmin,終止消化后，離心收集細胞，用操作液清洗3次放4°C冰箱備用。3.挑選排放第一極體并且形態(tài)正常的綿羊卵母細胞，置于7. 5Pg/mlCCB中，作用 5min,然后用含10%FBS的H-M199清洗3遍，置于覆蓋有石蠟油10μ1含10%FBS的H-M199的微滴中，并將核供體細胞也置于微滴中，在顯微操作系統(tǒng)下，用持卵針吸住綿羊卵母細胞， 使極體處在5點鐘的位置，先用內(nèi)徑為20Mm的注射針吸取多個形態(tài)良好，表面粗糙的核供體細胞，用注核針扎破透明帶然后用注射針擠壓透明帶外第一極體上方位置，擠出第一極體及其附近少量胞質(zhì)，從破口處將去注核針內(nèi)的供體成纖維細胞直接注射到去核綿羊卵母細胞透明帶下，輕輕觸壓使供體細胞與細胞膜緊密接觸。實施例4重構(gòu)胚胎的融和及體外培養(yǎng)
供體細胞注射完成后立即用特制融合液融合，融合后放入成熟液中，4h后，用含5mM離子霉素5%FBS的H-Ml99中激活5min，移入含有2mM 6-DMAP的SOFaa培養(yǎng)液中培養(yǎng)4h。將重構(gòu)胚置于ΙΟΟμΙ的SOFaa培養(yǎng)液微滴中培養(yǎng)，每個微滴放入15枚重構(gòu)胚，置于38. 5°C、5%C02、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 后檢查卵裂情況，連續(xù)培養(yǎng)7d檢查囊胚情況。結(jié)果融合率達到 96. 47% (356/369)，卵裂率達 92. 97% (331/356)，囊胚率達 24. 8% (82/331)。融合液0.05g/LBSA, 0. 20M 甘露醇，0. 08mM 醋酸鈣，0. 8 mM Hepes 用 Sigma 超純水溶解，不調(diào)PH值，調(diào)節(jié)滲透壓為253468 mOsm, 0. 22Mm濾膜過濾，分裝后4°C儲存。實施例5重構(gòu)胚胎的融和及體外培養(yǎng)
供體細胞注射完成后立即用特制融合液融合，融合后放入成熟液中，4h后，用含5mM離子霉素5%FBS的H-Ml99中激活5min，移入含有2mM 6-DMAP的SOFaa培養(yǎng)液中培養(yǎng)4h。將重構(gòu)胚置于ΙΟΟμΙ的SOFaa培養(yǎng)液微滴中培養(yǎng)，每個微滴放入15枚重構(gòu)胚，置于38. 5°C、 5%C02、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 后檢查卵裂情況，連續(xù)培養(yǎng)7d檢查囊胚情況。結(jié)果融合率達到 98 % (355/362)，卵裂率達 89. 85% (319/355)，囊胚率達 23. 8% (76/319)。融合液組成為0. 15g/LBSA, 0. 35M甘露醇，0. 05mM醋酸鈣，0. 5mM Hepes,超純水溶解，不調(diào)PH值，調(diào)節(jié)滲透壓為253468 mOsm, 0. 22Mm濾膜過濾，分裝后4°C儲存。實施例6重構(gòu)胚胎的融和及體外培養(yǎng)
供體細胞注射完成后立即用特制融合液融合，融合后放入成熟液中。將融合胚置于成熟液中培養(yǎng)4h后，用含5mM離子霉素5%FBS的H-M199中激活5min，移入含有2mM 6-DMAP 的SOFaa培養(yǎng)液中培養(yǎng)4h。將重構(gòu)胚置于ΙΟΟμΙ的SOFaa培養(yǎng)液微滴中培養(yǎng)，每個微滴放入15枚重構(gòu)胚，置于38. 5°C、5%C02、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 后檢查卵裂情況，連續(xù)培養(yǎng)7d檢查囊胚情況。結(jié)果融合率達到96. 78% (361/373)，卵裂率達90. 8% (328/361), 囊胚率達 27. 7% (91/328)0融合液0.12g/LBSA, 0. 30M 甘露醇，0. 20mM 醋酸鈣，2 mM Hepes 用 Sigma 超純水溶解，不調(diào)PH值，調(diào)節(jié)滲透壓為253468 mOsm, 0. 22Mm濾膜過濾，分裝后4°C儲存。以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實施例，并非對本發(fā)明作任何形式上和實質(zhì)上的限制，凡熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案范圍內(nèi)，當(dāng)可利用以上所揭示的技術(shù)內(nèi)容，而作出的些許更動、修飾與演變的等同變化，均為本發(fā)明的等效實施例；同時，凡依據(jù)本發(fā)明的實質(zhì)技術(shù)對以上實施例所作的任何等同變化的更動、修飾與演變，均仍屬于本發(fā)明的技術(shù)方案范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種高效制備綿羊克隆胚胎的方法，其特征在于通過攪拌篩選獲得處于同一細胞周期的綿羊卵母細胞，將供體胞細胞核通過顯微注射到所述綿羊卵母細胞后立即用融合液處理，融合后的胚放入成熟液培養(yǎng)形成融合胚胎。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述綿羊卵母細胞的制備方法為預(yù)溫的生理鹽水清洗新鮮卵巢，收集卵巢表面2mm-6mm大小的卵泡與吸卵液中，卵泡液凝集為絮狀后， 用細棒輕柔攪拌使凝集物聚集，將凝集團撕碎并繼續(xù)攪拌；在體視顯微鏡下收集卵丘-卵母細胞復(fù)合體，成熟液中洗3遍，置于成熟培養(yǎng)液微滴中，38. 5°C、5%C02、飽和濕度的培養(yǎng)箱中成熟培養(yǎng)。
3.權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述供體細胞為成纖維細胞，來源于40天胚齡胎兒的頭部。
4.權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述吸卵液組成為100IU/ml青霉素、100IU/ml 鏈霉素，0. 5%FBS，25mg/ml 肝素 TCM199。
5.權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述成熟液體組成為15%PG處理后發(fā)情綿羊血清 10 Pg/ml FSH, 20 Pg/ml LH, 1. 5 Pg/ml 17_βΕ2 溶于 TCM199。
6.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述供體細胞的制備方法為剖腹取40天胚齡的綿羊胎兒頭部皮膚，盡量撕碎，將組織塊按5mm左右間隔，接種在50 ml卡氏培養(yǎng)瓶的瓶底，每個瓶接種約25塊左右，要盡量將組織塊的切面貼在瓶底上，使組織塊粘附在瓶底，放入培養(yǎng)箱，靜置3h-4h，加5ml含15%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，放入37°C、5%C02、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)3d后，換5ml含15%FBS的DMEM/F12新鮮培養(yǎng)液；以后每3d換培養(yǎng)液一次， 3d-4d可明顯看到組織塊周圍有細胞長出，細胞向周圍擴展，5d-8d由組織塊長出的細胞匯合，可消化傳代，篩選長勢旺盛的成纖維細胞，選取5代以內(nèi)的自然生長匯合的成纖維細胞作為核供體，用0. 05%TE 37°C消化lmin，離心收集細胞后用操作液清洗3次放4°C冰箱備用。
7.權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述顯微注射的具體步驟為顯微鏡下篩選排出第一極體綿羊卵母細胞，置于覆蓋有石蠟油10μ1含10%FBS的H-M199的微滴中，通過顯微注射將權(quán)利要求4所述供體細胞移植入去核綿羊卵母細胞透明帶下，輕輕觸壓使供體細胞與細胞膜緊密接觸，注射完成后立刻使用融合液處理。
8.一種可提高胚胎融合效率的融合液，其特征在于組成為0.05-0. 15g/LBSA, 0. 20-0. 35M甘露醇，0. 05-0. 20mM醋酸鈣，0. 5-2 mM H印es，超純水溶解，不調(diào)pH值，調(diào)節(jié)滲透壓為253468 mOsm, 0. 22Mm濾膜過濾，分裝后4°C儲存。
9.權(quán)利要求8所述的融合液，其特征在于組成為0.08-0. 12g/LBSA，0. 05-0. 30M甘露醇，0.08-0. 12mM醋酸鈣，0.8-1. 2 mM H印es，超純水溶解，不調(diào)pH值，調(diào)節(jié)滲透壓為253468 mOsm, 0. 22Mm濾膜過濾，分裝后4°C儲存。
10.權(quán)利要求9所述的融合液，其特征在于組成為0.lg/LBSA，0. 28M甘露醇，0. ImM醋酸鈣，1 mM H印es，超純水溶解，不調(diào)pH值，調(diào)節(jié)滲透壓為253468 mOsm, 0. 22Mm濾膜過濾， 分裝后4°C儲存。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高效制備綿羊優(yōu)質(zhì)克隆胚胎的方法，屬于胚胎移植的方法領(lǐng)域。本發(fā)明通過攪拌篩選獲得處于同一細胞周期的綿羊卵母細胞，將供體胞細胞核通過顯微注射入移植入綿羊卵母細胞后，立即用融合液處理，處理后的胚胎放入成熟液培養(yǎng)形成融合胚胎，化學(xué)激活后啟動重構(gòu)胚胎卵裂。本發(fā)明通過攪拌法獲得處于同一時期，成熟時間統(tǒng)一的綿羊卵母細胞，提供了新的挑選優(yōu)質(zhì)綿羊卵母細胞方法，提高了綿羊卵母細胞的成熟率。使用同一根注射針擠壓去核同時注核的方法提高了核移植的操作效率。通過使用本發(fā)明開發(fā)的融合液可以使融合效率提高到95%以上，大大提高了克隆胚胎的成功率，且不影響后續(xù)的胚胎發(fā)育。本發(fā)明提供的方法降低了克隆胚胎制作過程中的胚胎損失，提高了生產(chǎn)綿羊克隆胚胎的效率，是一種高效制備綿羊優(yōu)質(zhì)克隆胚胎的方法，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/877GK102229964SQ20111013385
公開日2011年11月2日 申請日期2011年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月23日
發(fā)明者劉羿羿, 周歡敏, 張東 申請人:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)