專利名稱：豬雌激素誘導(dǎo)啟動子及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及豬雌激素誘導(dǎo)啟動子及應(yīng)用。本發(fā)明包括豬HoxalO基因DNA的提取、引物設(shè)計、基因克隆、啟動子預(yù)測、雌激素誘導(dǎo)啟動子質(zhì)粒構(gòu)建的相關(guān)技術(shù)。從豬中獲得了 HoxalO基因雌激素誘導(dǎo)型啟動子質(zhì)粒，并在細胞水平對其功能進行了驗證，證實了該質(zhì)粒在受體細胞中具有增強豬HoxalO基因表達的作用。
背景技術(shù)：
豬的產(chǎn)仔數(shù)是繁殖性狀中重要的經(jīng)濟性狀，直接關(guān)系到養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟收益。在英國，如果每頭母豬的產(chǎn)活仔數(shù)每胎提高I頭，英國的養(yǎng)豬業(yè)每年就可增加利潤7億英鎊，整個歐盟養(yǎng)豬業(yè)可多獲利20億英磅(Chris Hale, 1996);在我國，如果母豬產(chǎn)仔數(shù)每胎提高I頭，每年也將增收190億人民幣的純利(王莉興，2008)。母豬產(chǎn)仔數(shù)性狀是一個由排卵、受精、著床、胎兒發(fā)育等多個具有時間順序特征的組分性狀構(gòu)成的復(fù)合性狀。從目前的研究情況來看，豬早期胚胎丟失率和中期胎兒死亡率是決定母豬產(chǎn)仔數(shù)的主要原因之一。母豬 早期胚胎丟失與子宮內(nèi)環(huán)境密切相關(guān)，而胚泡異常發(fā)育與著床失敗是導(dǎo)致母豬早期胚胎丟失的主要原因。HoxalO基因是同源異型基因的一種，在進化上高度保守，其表達產(chǎn)物是一種轉(zhuǎn)錄因子。目前，在人及其他哺乳動物中的研究表明，HoxalO基因是調(diào)控子宮微環(huán)境、影響子宮內(nèi)膜容受性和胚胎著床的關(guān)鍵因子，該基因在子宮內(nèi)膜上皮細胞中持續(xù)上調(diào)是正常妊娠的必要條件。HoxalO基因在“著床窗口期”高表達，與其輔因子PBX2及Meisl相互作用形成不同的異源二聚體或三聚體(Sanro JL, 2005),調(diào)控0 3 (Gaurang S. Daftary, 2002)、EMX2 (Patrick J. Troy, 2003), IGFbp-I、FKbp52、EP3、EP4 (T Svingen, 2006)等下游基因，參與雌性生殖系統(tǒng)的發(fā)育和正常子宮內(nèi)膜形態(tài)的構(gòu)建，并對子宮內(nèi)膜的增殖與分化、子宮內(nèi)膜容受性的建立、胚胎的定位及粘附、胞飲突的形成、子宮內(nèi)膜的蛻膜化以及血管通透性的增強發(fā)揮著重要作用。研究表明，妊娠初期，雌激素和孕酮分別通過它們的受體直接調(diào)控HOXAlO基因的表達(Taylor HS, 1998 ；Bagot CN，2007)，阻礙成體母鼠子宮內(nèi)膜中HoxalO基因的表達導(dǎo)致胚胎附植和窩產(chǎn)仔數(shù)降低(Akbas GE，2004)。HoxalO基因參與調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞及腺上皮細胞周期性的增殖和分化，從而使子宮內(nèi)膜進入容受狀態(tài)，并參與子宮內(nèi)膜的蛻膜化和妊娠的維持，是調(diào)節(jié)胚胎著床的重要基因。由于在人和小鼠等的研究表明HoxalO基因在子宮內(nèi)膜高表達，雌激素可以通過ER與HOXAlO的ERl及ER2結(jié)合，使HOXAlO轉(zhuǎn)錄激活，增加HOXAlO的表達(Melissa B. Taylor，2007)。HoxalO基因是調(diào)控子宮微環(huán)境、影響子宮內(nèi)膜容受性和胚胎著床的關(guān)鍵因子，并且與母鼠產(chǎn)仔數(shù)有關(guān)，而HoxalO基因在物種間高度保守，啟動子序列分析表明與人HOXAlO基因啟動子研究結(jié)果吻合；因此推測豬HoxalO基因具有類似繁殖性狀相關(guān)功能。啟動子是一段對基因的表達起調(diào)控作用的DNA片段，是精確調(diào)控基因表達的“開關(guān)”。因此對雌激素誘導(dǎo)的豬HoxalO基因啟動子的分離克隆及深入研究，不僅有助于研究豬HoxalO基因?qū)δ肛i妊娠和胚胎發(fā)育的作用，還可以指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因育種，創(chuàng)造巨大的經(jīng)濟效益和社會效益，更好的為人類生產(chǎn)生活服務(wù)。本發(fā)明就是利用有關(guān)分子生物學(xué)方法，從豬基因組中分離克隆了 HoxalO基因及其上游四個不同長度的啟動子區(qū)域，分別構(gòu)建不同長度的啟動子熒光素酶質(zhì)粒，鑒定雌激素刺激條件下在受體細胞中調(diào)控活性最高的啟動子片段，并在受體細胞驗證了該啟動子的調(diào)控作用。為下一步研究子宮內(nèi)膜特異高表達啟動子制備高繁殖力的轉(zhuǎn)基因豬，達到增加母豬產(chǎn)仔數(shù)的目的奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，獲得一種適用于豬雌激素誘導(dǎo)的啟動子及應(yīng)用。本發(fā)明通過基因克隆方法，從豬基因組中分離克隆一個子宮內(nèi)膜高表達的HoxalO 基因包含完整CDS區(qū)域的DNA片段及該基因啟動子區(qū)域DNA片段，該啟動子片段在雌激素誘導(dǎo)條件下可以增強子宮內(nèi)膜細胞中豬HoxalO基因的表達。通過分子克隆的方法構(gòu)建豬HoxalO基因雌激素誘導(dǎo)啟動子熒光素酶質(zhì)粒，在細胞水平對其功能進行驗證，以便用于豬HoxalO基因功能研究，子宮內(nèi)膜高表達啟動子篩選，以及提高母豬繁殖力的研究。本發(fā)明的技術(shù)路線見圖I所示。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是豬HoxalO基因包含完整⑶S區(qū)域的DNA片段擴增及組織表達譜分析，它包括下列步驟I)利用美國國立生物研究所網(wǎng)站NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)數(shù)據(jù)庫信息中人和小鼠HoxalO基因序列信息釣取豬HoxalO基因DNA序列(豬基因組登錄號(即第18號染色體)Gene ID : 100521236)，設(shè)計引物，以豬總DNA為模板，通過PCR擴增得到豬HoxalO基因包含完整⑶S區(qū)域的DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO: I所示，其中外顯子區(qū)域位于該序列的第10-970和第2160-2434bp處；內(nèi)含子區(qū)域位于第971-2159bp處，序列長度為2552bp，并進行測序。序列分析表明豬HoxalO基因包含一個1236bp的開放閱讀框，編碼411個氨基酸的蛋白質(zhì)，包含一個Homo家族同源結(jié)構(gòu)域(site:370to 393)BLASTP分析顯示其與已有報道的人HOXAlO基因、小鼠HoxalO基因的氨基酸序列同源性分別高達95%和 90%。2)為研究豬HoxalO基因在豬不同組織中表達情況，申請人利用半定量RT-PCR技術(shù)對該基因在豬子宮內(nèi)膜等18個不同組織中的表達譜進行了分析，結(jié)果見圖2。表明豬HoxalO基因在子宮內(nèi)膜中高度表達。申請人:構(gòu)建了一種豬HoxalO基因雌激素誘導(dǎo)啟動子質(zhì)粒，它包括下列步驟I)為進一步研究豬HoxalO基因在子宮內(nèi)膜的表達調(diào)控，通過BLAST比對以及啟動子預(yù)測軟件分離克隆了該基因啟動子區(qū)域DNA片段(2076bp)，該引物核苷酸序列如下實施例I所示，并進行測序，其核苷酸序列如SEQ IDNO :3所示。經(jīng)啟動子分析軟件分析該啟動子片段結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該序列含有一些順式作用元件，其中包含ERl (位于該序列的第-543-(-530)bp處)、ER2(位于該序列的第-295-(-283) bp處)、SPl (位于該序列的第-739-(-734)、第-355-(-350)和第-255-(-246)bp處)等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點；2)克隆豬HoxalO基因啟動子區(qū)HProl、HPro2、HPro3、和HPro4共4個不同長度的啟動子片段(其核苷酸序列分別如SEQ ID NO :3-6所示)，擴增上述四個啟動子片段的引物對的核苷酸序列如實施例3所示。將這些啟動子片段分別插入pGL3-Basic質(zhì)粒的MluI和HindIII酶切位點間，構(gòu)建4個豬HoxalO基因啟動子熒光素酶載體，轉(zhuǎn)染ISHIKAWA子宮內(nèi)膜癌細胞系，經(jīng)雌激素刺激后檢測熒光素酶活性，鑒定活性最高的啟動子片段，申請人將該啟動子熒光素酶載體命名為PGL3-P1X)，該載體的核苷酸序列如SEQID NO 7所示；3)設(shè)計特異引物引入HindII和KpnI酶切位點擴增豬HoxalO基因包含完整CDS的DNA片段，將該DNA片段插入pcDNA3. I (+)質(zhì)粒的HindII和KpnI酶切位點間，構(gòu)建包含豬HoxalO基因包含完整⑶S的DNA片段的pc3. I-DNA質(zhì)粒，篩選得到經(jīng)雌激素刺激后熒光素酶活性最高的啟動子片段(其序列見SEQID NO 5)插入到pc3. I-DNA質(zhì)粒的MluI和HindIII酶切位點間，構(gòu)建得到pc3. I-Pro-DNA質(zhì)粒(其核苷酸序列如SEQIDN0 8所示)；轉(zhuǎn)染ISHIKAWA子宮內(nèi)膜癌細胞系，驗證該質(zhì)粒pc3. I-Pro-DNA對豬HoxalO基因的調(diào)控作用。本發(fā)明的優(yōu)點在于
I)本發(fā)明首次分析了豬HoxalO基因啟動子不同長度的片段的活性，找到活性較高的片段HPix)3，構(gòu)建啟動子載體pGL3-Pix)，該啟動子受雌激素誘導(dǎo)后活性提高。2)本發(fā)明獲得了受雌激素誘導(dǎo)的在子宮內(nèi)膜癌細胞活性較高的啟動子，為基因工程和分子育種提供了新的特異表達的啟動子資源。更詳細的技術(shù)方案參見《具體實施方式
》的內(nèi)容。


序列表SEQ ID NO I是本發(fā)明分離克隆的豬HoxalO基因包含完整⑶S區(qū)域的核苷酸序列，其中外顯子區(qū)域位于該序列的第10-970和第2160-2434bp處；內(nèi)含子區(qū)域位 于第971-2159bp處，序列長度為2552bp。序列表SEQ ID NO 2是本發(fā)明用于檢測豬HoxalO基因組織表達譜利用RT-PCR擴增得到的HoxalO部分cDNA應(yīng)用的核苷酸序列，長度為425bp。序列表SEQ ID NO 3是本發(fā)明克隆的豬HoxalO基因啟動子HProl的核苷酸序列，長度為2076bp。序列表SEQ ID NO 4是從所述的SEQ ID NO :3核苷酸序列的克隆得到的作為另一個啟動子HPro2應(yīng)用的核苷酸序列，長度為1527bp。序列表SEQ ID NO 5是從所述的SEQ ID NO :3核苷酸序列的克隆得到的作為另一個啟動子HPro3應(yīng)用的核苷酸序列，長度為1062bp。序列表SEQ ID NO 6是從所述的SEQ ID NO :3核苷酸序列的克隆得到的作為另一個啟動子，即本發(fā)明用于構(gòu)建豬HoxalO基因雌激素誘導(dǎo)啟動子質(zhì)粒的啟動子HPro4應(yīng)用的核苷酸序列，長度為474bp。序列表SEQ ID NO 7是本發(fā)明構(gòu)建的包含豬HoxalO基因雌激素誘導(dǎo)啟動子片段的真核表達質(zhì)粒pGL3-Pro的核苷酸序列,全長5848bp。序列表SEQ ID NO 8本發(fā)明構(gòu)建的包含豬HoxalO基因雌激素誘導(dǎo)啟動子片段和豬HoxalO基因包含完整⑶S區(qū)域的DNA片段，全長8365bp。序列表SEQ ID NO 9本發(fā)明用于檢測豬HoxalO基因定量表達譜利用Q-PCR擴增得到的HoxalO部分cDNA應(yīng)用的核苷酸序列，長度為113bp。
圖I :本發(fā)明的技術(shù)路線圖。圖2 :半定量RT-PCR分析HoxalO基因在豬18個不同組織中的表達模式；上下列分別表示的為HoxalO基因和內(nèi)參豬P -actin基因在各個組織中的表達情況，其中I心2肝3脾4肺5腎臟6腦7胃8肌肉9脂肪10淋巴11膀胱12腸13骨髓14睪丸15附睪16皮膚17卵巢18子宮內(nèi)膜。圖3 :豬HoxalO基因不同缺失片段轉(zhuǎn)染人子宮內(nèi)膜癌細胞后，雙熒光素酶活性檢測結(jié)果。圖4 :豬HoxalO基因啟動子受雌激素誘導(dǎo)后調(diào)控功能細胞驗證定量驗證結(jié)果。圖5 :人子宮內(nèi)膜癌細胞(ISHIKAWA)RNA提取電泳圖。圖6 :本發(fā)明所用的pEasy-Blunt Simple載體信息。
圖7 :本發(fā)明所用的pGL3-Basic載體信息。圖8 :本發(fā)明所用的pcDNA3. I (+)載體信息。圖9 :本發(fā)明構(gòu)建的p-Easy-DNA載體信息。圖10 :本發(fā)明構(gòu)建的pGL3_Pro載體信息。圖11 :本發(fā)明構(gòu)建的pc3. I-Pro-DNA載體信息。
具體實施例方式豬子宮內(nèi)膜高表達基因HoxalO基因的克隆、表達、雌激素誘導(dǎo)啟動子分離及細胞驗證。實施例I豬HoxalO基因包含完整⑶S區(qū)域的DNA片段克隆(相應(yīng)分子生物學(xué)常規(guī)操作參考J.薩姆布魯克等，《分子克隆實驗指南(第二版)》，1996版，科學(xué)出版社)梅山豬基因組DNA的抽提以成年“梅山豬”(一種報道的中國地方豬品種，購自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗豬場)耳組織為實驗材料抽提其基因組DNA，具體方法參照Murray報道的CTAB法(Murray and Thompson. 1980)，抽提出的DNA完全溶解后置于_20°C冰箱保存。在生物信息學(xué)網(wǎng)站NCBI (http:"www. ncbi. nlm. nih. gov/)中提取人、小鼠Hoxa10基因mRNA序列，通過BLASTN比對，該基因在人和小鼠中核酸序列同源性達90 %。利用DNAstar軟件拼接兩條序列，利用該拼接產(chǎn)物在NCBI網(wǎng)站釣取豬EST序列，將所有EST序列拼接得到豬Hoxa10基因全長cDNA序列；根據(jù)豬Hoxa10基因全長cDNA序列在GeneBank中找到了對應(yīng)的基因組序列(豬基因組登錄號Gene ID : 100521236)，位于豬第18號染色體上。利用Primer5軟件設(shè)計特異性引物，并在引物上下游分別加入限制性內(nèi)切酶HindIII (購自Fermentas湖北晶茂生物技術(shù)有限公司)和KpnI (購自Fermentas湖北晶茂生物技術(shù)有限公司)酶切位點(以下劃線部分表示，)及相應(yīng)的保護堿基(以斜體表示)，利用PCR法，以抽提的梅山豬基因組DNA為模板，通過設(shè)計特異引物HFl (5/ -AAAMGCTTTGCACAAGAAATGTCAGCCAGA-3' )、HF2 (5' -AAAGGTACCGCAGAGCCGATGACAGAG-3')，用高保真酶PrimerStar with 2*GC Buffer (購自寶生物工程大連有限公司)擴增豬HoxalO基因包含完整CDS區(qū)域在內(nèi)的DNA片段2552bp。PCR反應(yīng)條件98°C 30s，98°C 10s，60°C5s，72°C lmin30s，30個循環(huán)，72°C 5min，4°C保存。反應(yīng)體系為2*GC Buffer50ul
dNTP Mix8ul
引物HFl3ul
引物HF23 ul
PrimerStarIul
DNAIOul
ddH2025ul
TotalIOOul 取5ulPCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳檢測。剩余的PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收(購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司)后連pEasy-Blunt Simple質(zhì)粒(購自北京全式金生物技術(shù)有限公司)上，37°C連接15min，轉(zhuǎn)化后涂板，篩選陽性克隆p-Easy-DNA (圖9)并送Invitrogen公司測序,序列為SEQ ID NO :1。連接體系為HoxalOPCR 產(chǎn)物4 U IpEasy-Blunt Simple Vctor IulTotal5ul測序結(jié)果顯示來源于“梅山豬”基因組的HoxalO基因序列與拼接出的預(yù)測序列100%相同。實施例2豬HoxalO基因的組織表達譜檢測的材料準(zhǔn)備取“梅山豬”的心、肝、脾、肺、腎、腦、胃、肌肉、脂肪、淋巴、膀胱、腸、骨髓、睪丸、附睪、皮膚、卵巢和子宮內(nèi)膜共18個組織樣品，RNA提取使用RNAprep pure Tissue Kit (購自天根生化科技(北京)有限公司)的進行，按照試劑盒的說明書操作?？俁NA經(jīng)I. 2%瓊脂糖膠電泳檢測和濃度測定確認(rèn)質(zhì)量合格(18S、28S兩條主帶清晰無拖尾，0D260/0D280 = I. 8-2. 0)后方可進行后續(xù)試驗。將各個組織的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，置于_20°C冰箱保存。反轉(zhuǎn)錄使用的試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (購自 Fermentas 湖北晶茂生物技術(shù)有限公司)，按照產(chǎn)品說明書操作即可。豬HoxalO的⑶S區(qū)域大小為1236bp，編碼411個氨基酸(見序列表SEQIDN0 1)。設(shè)計能擴增跨內(nèi)含子的部分mRNA的RT-PCR引物(HBF1 5 ' -TGCCTGTGCCCGGCTACTT-3 '，HBRl 5 ' -CAGCGTCTGGTGCTTGGTGT-3 '，擴增大小為425bp，序列為SEQ ID NO :2)，以心、肝、脾、肺、腎、腦、胃、肌肉、脂肪、淋巴、膀胱、腸、骨髓、睪丸、附睪、皮膚、卵巢和子宮內(nèi)膜共18個組織的RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，以豬P -actin基因(登錄號 gi I 298162948)為內(nèi)參(擴增引物為 actFl 5 ' -TCTGGCACCACACCTTCT-3 '，actRl :5' -TGATCTGGGTCATCTTCTCAC-3' )。PCR 反應(yīng)條件95°C 5min,95°C 30s, 60°C 30s,72°〇408，30個循環(huán)，7215111111。反應(yīng)體系為I O5lcBufferIuI
dNTP Mix0.8ul
HBFl/actFl0_3ul
HBRl/ actRl0.3ul
rTaqO.lul
cDNAIul
ddF^O6.5ul
TotalIOul PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖膠電泳檢測。檢測結(jié)果見附圖2。結(jié)果顯示，豬HoxalO基因在子宮內(nèi)膜、腎臟和膀胱中高表達，在肌肉、淋巴、附睪和卵巢中有較弱表達，在其他組織不表達。實施例3豬子宮內(nèi)膜高表達基因HoxalO啟動子候選片段及相應(yīng)缺失片段的獲得(相應(yīng)分子生物學(xué)常規(guī)操作參考J.薩姆布魯克等，《分子克隆實驗指南(第二版)》，1996版，科學(xué)出版社)梅山豬基因組DNA的抽提以成年梅山豬耳組織為實驗材料抽提其基因組DNA，具體方法為Murray報道的CTAB法(Murray and Thompson. 1980)，抽提出的DNA完全溶解后置于-20°C冰箱保存。在生物信息學(xué)網(wǎng)站NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)上提取豬 HoxalO 基因(Gene ID =100521236)的上游序列，具體來講是-2058至+18 (轉(zhuǎn)錄起始點為+1)區(qū)間共計2076bp，其序列如SEQ ID NO :3所示，作為啟動子候選片段，將該啟動子命名為HProl。利用Primerf軟件設(shè)計特異性引物，并在引物上下游分別加入限制性內(nèi)切酶MluI (購自Fermentas湖北晶茂生物技術(shù)有限公司)和HindIII (購自Fermentas湖北晶茂生物技術(shù)有限公司)酶切位點(以下劃線部分表示)及相應(yīng)的保護堿基(以斜體表示)，利用PCR法，以抽提的梅山豬基因組DNA為模板，設(shè)計了如下所示的引物對，其核苷酸序列如下所示HPF I :5' - Trn ACGCGTTGTGTGTTTGTGCGATGTGGA-3'； HPRl : 5' - CCC AAGCTTACATGCTGAATACGATTAGCAATC-3'；用高保真酶PrimerStar with 2*GC Buffer (購自寶生物工程大連有限公司)擴增 HProl 啟動子片段。PCR 反應(yīng)條件98°C 30s, 98°C 10s, 60 °C 5s, 72°C lmin30s，30 個循環(huán)，72°C 5min，4°C保存。反應(yīng)體系為2*GC Buffer50ul
dNTP Mix8ul
HPFl3ul
HPF23ul
PrimerStarIul
DNAIOul
(WH2O25ul
TotalIOOul取5ul的HProlPCR產(chǎn)物用I %瓊脂糖電泳檢測。剩余的PCR產(chǎn)物回收用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(購自天根生化科技(北京)有限公司)后連入pEasy-BluntSimple質(zhì)粒(購自北京全式金生物技術(shù)有限公司)上，37°C連接15min,轉(zhuǎn)化后涂板,篩選陽性克隆并送Invitrogen公司測序，其序列見序列為SEQ ID NO :3。連接體系為HProlPCR 產(chǎn)物4 y IpEasy-Blunt Simple Vctor IulTotal5ul測序結(jié)果顯示來源于“梅山豬”基因組的HProl序列與NCBI上報道豬HoxalO基因序列為100%相同。三個5'缺失片段與HProl啟動子片段共用同一個反向引物，其核苷酸序列如下所示(引物前面的英文字母F代表正向引物，R代表反向引物)，如下 HPRl : 5' - CCC AAGCTTACATGCTGAATACGATTAGCAATC-3'；HPF2:5' - AAA ACGCGTTCCAGGCGTTCAGCAGTTCC-3'；HPF3 :5' - AAA ACGCGTGTTCTTGTCATAGCCTCGGG-3'；HPF4:5' - AAA ACGCGTGGCTGAATGGGAAGAGCTTG-3'；在每條正向引物5'端都引入MluI酶切位點(以下劃線部分表示)及相應(yīng)的保護堿基(以斜體表示)。PCR模板為測序正確的p-Easy-HProl質(zhì)粒。得到擴增產(chǎn)物之后，后續(xù)操作按照構(gòu)建p-Easy-HProl的方法進行。采用一系列啟動子分析軟件，如Softberry 網(wǎng)站(http://www. softberry. com)的 TSSP 軟件、PROSCAN 軟件(http://bimas. dcrt. nih. gov/molbio/proscan)、TESS 軟件http://searchlauncher. bcm. tmc. edu/seq-search/gene-search. html)、PromoSer 軟件(http://biowulf.bu.edu/zlab/PromoSer/)、以及 FirstEF 軟件(http://rulai.cshl.org/tools/FirstEF/)等分析豬HoxalO基因啟動子的結(jié)構(gòu)。發(fā)現(xiàn)在HoxalO基因啟動子第-543- (-530) bp處是雌激素受體結(jié)合位點ERl，第-295- (-283) bp處是雌激素受體結(jié)合位點ER2，第-739-(-734)、第-355-(-350)和第-255-(-246) bp處分別是三個SPl結(jié)合位點(見序列表SEQ ID NO 3) o實施例4豬子宮內(nèi)膜高表達基因HoxalO啟動子候選片段及相應(yīng)缺失片段的熒光素酶質(zhì)粒構(gòu)建(相應(yīng)分子生物學(xué)常規(guī)操作參考J.薩姆布魯克等，《分子克隆實驗指南(第二版)》，1996版,科學(xué)出版社)將實施例3 中所述 p-Easy-HProl、p-Easy-HPro2> p-Easy-HPro3> p-Easy-HPro4質(zhì)粒用MluI (購自Fermentas湖北晶茂生物技術(shù)有限公司)和HindIII限制性內(nèi)切酶(購自Fermentas湖北晶茂生物技術(shù)有限公司)雙酶切，回收純化后，分別插入到pGL3_Basic質(zhì)粒(購自promega普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司)的MluI和HindIII酶切位點之間，得到四個重組質(zhì)粒，將獲得的重組質(zhì)粒測序鑒定，結(jié)果表明四個啟動子片段均成功插入到pGL3-Basic質(zhì)粒中；將鑒定表明正確的啟動子熒光素酶重組質(zhì)粒命名為pGL3_HProl、pGL3-HPro2、pGL3-HPro3 和 pGL3_HPro4。插入四個啟動子片段的p-Easy質(zhì)粒酶切體系為
MluI8ul HindIII8ul
Buffer R20ul
質(zhì)粒20ul
ddH2021ul
Total200ulpGL3-Basic質(zhì)粒酶切體系為
MluI8ul
HindIII8ul
Buffer R20ul
pGL3-Basic12ul
ddH20152ul Total 200ul37。〇酶切411。連接體系為
10*T4 Ligase Buffer Iul
T4 DNA LigaseO.lul
連接產(chǎn)物2ul
載體0.5ul
dd H2O6.5ul
TotalIOulI6 °C連接過夜。實施例5豬子宮內(nèi)膜高表達基因HoxalO啟動子候選片段及相應(yīng)缺失片段雌激素刺激條件下轉(zhuǎn)錄活性的體外鑒定，具體方法是將人子宮內(nèi)膜癌細胞系ISHIKAWA培養(yǎng)于1640完全培養(yǎng)基中(購自美國Gibco公司(武漢生命技術(shù)有限公司代理))(10%胎牛血清FBS(購自美國Gibco公司(武漢生命技術(shù)有限公司代理))、100u/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素、2mmol/L L-谷氨酰胺)37°C，5% CO2條件下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前一天，將細胞分別傳代于兩個24孔板(各傳15個孔，每種處理設(shè)三個重復(fù))，用不含雙抗的培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，第二日按Roche FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑盒(購自Roche(武漢飛羿科技有限公司代理))說明書的要求將pGL3-HPix)l、pGL3-HPro2、pGL3-HPro3和pGL3_HPro4四個啟動子熒光素酶重組質(zhì)粒以及pGL3_Basic質(zhì)粒(購自Promega普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司)分別轉(zhuǎn)染人子宮內(nèi)膜癌細胞系ISHIKAWA。轉(zhuǎn)染后24h，一個24孔板內(nèi)加入濃度為l(T7mol/l的17Beta_estradiol (購自Sigma-Aldrich公司(上海))，繼續(xù)培養(yǎng)IOh后檢測雙熒光素酶活性，以另一個24孔板的未加17Beta_estradiol (未誘導(dǎo)組)的ISHIKAWA細胞作為對照。啟動子熒光素酶活性檢測結(jié)果(見圖3)表明，四個啟動子質(zhì)粒熒光素酶活性均高于pGL3-Basic質(zhì)粒，其中pGL3_HPro3質(zhì)粒在未誘導(dǎo)組四個啟動子質(zhì)粒中熒光素酶活性最低，而在雌激素(UBeta-estradiol)誘導(dǎo)組中熒光素酶活性最高(上升了 4. 3倍)，并 且兩組數(shù)值差異顯著(P < 0. 05)。因此鑒定出長度1062bp的HPro3啟動子片段在雌激素(UBeta-estradiol)誘導(dǎo)條件下轉(zhuǎn)錄活性最高，將該啟動子熒光素酶質(zhì)粒片段命名為pGL3-Pro (圖 10)。實施例6pc3. l-Pro-DNA 載體構(gòu)建以豬HoxalODNA為目的基因，以HPro3為調(diào)控元件，以pcDNA3. 1(+)質(zhì)粒(購自Promega普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司)為框架，替換cmv啟動子,構(gòu)建目標(biāo)質(zhì)粒pc3. I-Pro-DNA(圖11)。將實例5中所述pGL3_Pro質(zhì)粒和pcDNA3. I (+)質(zhì)粒分別用MluI (購自Fermentas生物技術(shù)深圳有限公司)和HindIII (購自Fermentas生物技術(shù)深圳有限公司)限制性內(nèi)切酶(雙酶切，將回收純化后的PGL3-P1X)質(zhì)粒，插入到回收純化后的pcDNA3. I (+)質(zhì)粒的MluI和HindIII酶切位點之間，得到重組質(zhì)粒，將獲得的重組質(zhì)粒測序鑒定。將實施例I中所述p-Easy-DNA質(zhì)粒用HindIII和KpnI限制性內(nèi)切酶雙酶切，回收純化后插入到鑒定表明正確重組質(zhì)粒pc3. I-Pro的HindIII和KpnI酶切位點之間，將得到的重組質(zhì)粒命名為pc3. I-Pro-DNA (圖11)。pGL3-Pro質(zhì)粒酶切體系為
MluI2.5ul
HindIII2.5ul
Buffer R5ul
質(zhì)粒25ul
ddH2015ul
Total50ulpcDNA3. I (+)質(zhì)粒酶切體系為MluI7.5ul
HindIII7.5ul
Buffer R15ul
pGL3-Basic29ul
ddH209 Iul
Total150ul 37 dC 酶切 4h。
連接體系為
10*T4 Ligase BufferIul
T4 DNA LigaseO.lul
連接產(chǎn)物7.4ul
載體1.5ul16DC連接過夜。pc3. I-Pro質(zhì)粒酶切體系為
KpnI2ul
HindIII8ul
Buffer KpnIIOul
質(zhì)粒20ul
ddH2060ul
TotalIOOulp-Easy-DNA質(zhì)粒酶切體系為
KpnIIul
HindIII4ul
Buffer KpnI5ul
質(zhì)粒IOul
ddH2030ul
Total50ul37 dC 酶切 4h。連接體系為
10*T4 Ligase BufferIul
T4 DNA Ligase0.2ul
連接產(chǎn)物7.5ul
載體1.3ul16 °C連接過夜。
實施例7HPro3雌激素刺激下上調(diào)HoxalO基因表達體外驗證將人子宮內(nèi)膜癌細胞ISHIKAWA培養(yǎng)于1640完全培養(yǎng)基中(10% (v/v)胎牛血清FBS((購自美國Gibco公司(武漢生命技術(shù)有限公司代理)))，100u/ml青霉素，100mg/ml鏈霉素，2mmol/LL-谷氨酰胺)37°C，5% C02條件下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前一天，將細胞分至24孔板(傳12個孔)，用不含雙抗(100u/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素)的培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，第二日按Roche轉(zhuǎn)染試劑盒說明書的要求將載體質(zhì)粒pc3. I-Pro-DNA轉(zhuǎn)染其中7_12共6個孔的人子宮內(nèi)膜癌細胞ISHIKAWA，轉(zhuǎn)染后24h換液并在4_6孔和7-9孔中加入10_7mol/l的雌激素(17Beta-estradiol (E2)(購自Sigma-Aldrich公司(上海)))繼續(xù)培養(yǎng)IOh后，收集細胞，提取細胞RNA。RNA提取使用RNAPrep pure Cell/Bacteria Kit(購自天根生化科技(北京)有限公司)的進行。將人子宮內(nèi)膜癌細胞ISHIKAWA中提取的細胞總RNA經(jīng)I. 2%瓊脂糖膠電泳檢測和濃度測定確認(rèn)其質(zhì)量合格(圖5) (18S、28S兩條主帶清晰無拖尾，RNA的純度與濃度純度利用NanoDrop 2000Spectrophotometer (購自美國NanoDrop公司)檢 測，根據(jù)記錄的A260/A280比值，估測RNA質(zhì)量，一般A260/A280在I. 8_2. O之間，蛋白質(zhì)含量為零時可以滿足本試驗的要求)后方可進行后續(xù)試驗。將各個細胞的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，置于-20°C冰箱保存。反轉(zhuǎn)錄使用的試劑盒RevertAid First Strand cDNA SynthesisKit(購自Fermentas湖北晶茂生物技術(shù)有限公司)，按照產(chǎn)品說明書操作即可。對提取的細胞cDNA進行實時定量PCR分析，用目的引物與內(nèi)參引物分別對樣品cDNA進行擴增。目的引物(HDLF1:5, -TGGGAGGCAAGCGCAATG-3'，HDLRl :5' -CGCGTCCAGCCACAAGTCTAT-3'，擴增大小為113bp，其序列見SEQ ID NO :9所示)，以只轉(zhuǎn)染pc3. I-Pro-DNA質(zhì)粒、轉(zhuǎn)染pc3. I-Pro-DNA 質(zhì)粒 24 小時后用 10 7mo 1/1 的 17Beta_estradiol 刺激；只用 10 7mol/l 的17Beta-estradiol刺激和空白對照(每種處理設(shè)三個重復(fù))共12個細胞的RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，以人GAPDH基因(Gene ID :2597)為內(nèi)參(用于擴增的引物為homo-GAPDHFl 5 ’ -ACCACAGTCCATGCCATCAC-3，，homo-GAPDHRl 5，-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3，)。PCR反應(yīng)條件95°C 5min，95°C 15s，60°C 30s，72°C 30s，40 個循環(huán)，熔解曲線從 58V到 95°C，每2. 2°C循環(huán)一次20s。反應(yīng)體系為
SYBGIOul
HDLFI / homo-GAPDHF I0.4ul
HDLF2/ homo-GAPDHRl0.4ul
RoxDyeIII0.4ul
cDNA2ul
ddH206.8ul
Total20ul檢測結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pc3. I-Pro-DNA質(zhì)粒后，ISHIKAWA細胞中HoxalO基因的表達量比處理細胞升高了 I. 2倍，差異不顯著。轉(zhuǎn)染pc3. I-Pro-DNA質(zhì)粒后，又加A 17Beta-estradiol刺激的ISHIKAWA細胞中HoxalO基因的表達量比未處理細胞升高了28. 5倍,差異顯著(p = 0. 03)。證明pc3. I-Pro-DNA載體可以通過雌激素誘導(dǎo)增強HoxalO基因的表達。
參考文獻I.王莉興等，豬產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)候選基因的研究進展，上海畜牧獸醫(yī)通訊，2008，(4)，11-142. Bagot CN,Troy PJ,Taylor HS. Alteration of maternal HoxalOexpression byin vivo gene transfection affects implantation. Gen Ther 2000 ；7 :1378-84.3. Taylor HS，Arici A,Olive D，Igarashi P. H0XA10 is expressed in responseto sex steroids at the time of implantation in the human endometrium. J ClinInvest 1998 ；101 :1379-84.4.Akbas GE，Song J, Taylor HS. A H0XA10 estrogen response element(ERE)isdifferentially regulated by 17Beta Estradiol and Diethylstilbestrol(DES). J MolBiol 2004 ；340 :1013-23.
5. Michael Kelly，MD，Gaurang Daftary, MD，Hugh S. Taylor, MD. Anautoregulatory element maintains HOXA IOexpression in endometrial epithelialcells. J Obstetrics and Gynecology2006 ;194，1100-96. Ryan Martin，Melissa B. Taylor,Graciela Krikun，Charles Lockwood,G. EddaAkbas, and Hugh S.Taylor. Differential Cell-Specific Modulation of HOXAlObyEstrogen and Specificity Protein IResponse Elements. J Clin Endocrinology &Metabolism 2007 ；92(5) :1920-19267.Daftary GS, Troy PJ, Bagot CN, Young SL, Taylor HS. Direct regulationof beta3_integrin subunit gene expression by H0XA10 in endometrial cells. MolEndocrinol. 2002Mar ；16(3) :571-9.8.Troy PJ，Daftary GS，Bagot CN,Taylor HS.Transcriptional repression ofperi-implantation EMX2expression in mammalian reproduction by H0XA10. Mol CellBiol. 2003Jan ；23(1) :1-13.9.Svingen T，Tonissen KF. Hox transcription factors and their elusivemammalian gene targets. Heredity. 2006Aug ；97 (2) :88-96. Epub 2006May 24.10. Bagot CN, Cregg R，Patel RK, Shariff A，Arya R. Perioperativemyocardial infarction in a patient receiving low-dose prothrombin complexconcentrates. Thromb Haemost. 2007Nov ；98(5) :1141-2.11. Sarno 幾，Kliman HJ, Taylor HS. H0XA10, Pbx2，and Meislproteinexpression in the human endometrium !formation of multimeric complexes onHOXAlOtarget genes. J Clin Endocrinol Metab. 2005Jan ；90(1) :522-8. Epub 20040ct19.
權(quán)利要求
1.一個豬雌激素誘導(dǎo)啟動子，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:5所示。
2.ー種包含豬雌激素誘導(dǎo)啟動子的熒光素酶質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征包括以下步驟 1)通過豬基因組與NCBI小鼠和人HoxalO基因DNA序列比對，設(shè)計一對引入HindIII和 KpnI 雙酶切位點的引物HF I :5' -AAAAAGCTTTGCACAAGAAATGTCAGCCAGA-3'，HF2 :5'-AAAGGTACCGCAGAGCCGATGACAGAG-3'，以豬總DNA為模板，擴增豬HoxalO基因包含完整CDS區(qū)域的DNA片段，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO : I所示，片段長度為2552bp ； 2)提取豬組織的RNA，設(shè)計ー對跨豬HoxalO基因內(nèi)含子的引物，該引物的核苷酸序列如下HBFl :5' -TGCCTGTGCCCGGCTACTT-3 ' , HBRl :5' -CAGCGTCTGGTGCTTGGTGT-3 ';通過RT-PCR方法，擴增得到長度為425bp的豬HoxalO基因cDNA片段，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :2所示；檢測該基因在豬組織中的表達，確定該基因在豬子宮內(nèi)膜中是否高表達； 3)通過豬基因組與NCBI小鼠和人HoxalO基因DNA序列比對,設(shè)計如下所不的引物對 HPF I :5' -TCGACGCGTTGTGTGTTTGTGCGATGTGGA-3'；HPRl :5' -CCCAAGCTTACATGCTGAATACGATTAGCAATC-3'；HPro2:5' -AAAACGCGTTCCAGGCGTTCAGCAGTTCC-3'；HPRl :5' -CCCAAGCTTACATGCTGAATACGATTAGCAATC-3'；HPro3 :5' -AAAACGCGTGTTCTTGTCATAGCCTCGGG-3'；HPRl :5' -CCCAAGCTTACATGCTGAATACGATTAGCAATC-3'；HPro4:5' -AAAACGCGTGGCTGAATGGGAAGAGCTTG-3'；HPRl :5' -CCCAAGCTTACATGCTGAATACGATTAGCAATC-3'； 引入MluI和HindIII雙酶切位點，以豬總DNA為模板，擴增豬HoxalO基因啟動子區(qū)域四個DNA片段，其長度分別為2076bp、1527bp、1062bp和474bp，將其命名為HProl、HPro2、HPro3和HPro4啟動子片段，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO :3_6所示； 4)將步驟3)所述的帶有MluI和HindIII酶切位點的啟動子片段HProl、HPro2、HPro3和HPro4，構(gòu)建至雙熒光素酶載體報告系統(tǒng)pGL3-Basic中獲得pGL3_HProl，pGL3_HPro2，pGL3-HPro3 和 pGL3_HPro4 載體； 5)將步驟4)中四個啟動子熒光素酶載體轉(zhuǎn)染兩組子宮內(nèi)膜癌細胞ISHKAWA，第一組直接檢測熒光素酶活性，第二組經(jīng)雌激素刺激后檢測熒光素酶活性，篩選得到檢測活性最高的質(zhì)粒，將其命名為PGL3-P1X)，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 7所示； 6)將pcDNA3.I (+)質(zhì)粒用MluI和HindIII雙酶切切除該質(zhì)粒CMV啟動子； 7)將步驟5)中篩選出的熒光素酶活性最高的質(zhì)粒定向插入步驟6)中pcDNA3.1(+)質(zhì)粒的MluI和HindIII雙酶切切點之間，構(gòu)建得到ー個中間質(zhì)粒； 8)將步驟7)中的中間質(zhì)粒用HindIII和KpnI雙酶切； 9)將步驟I)中擴增得到的HoxalO基因的包含完整⑶S區(qū)域的DNA片段定向插入到步驟8)所述的中間質(zhì)粒的HindIII和KpnI雙酶切切點之間，構(gòu)建包含豬HoxalO基因雌激素誘導(dǎo)啟動子片段和豬HoxalO基因包含完整CDS區(qū)域的DNA片段的質(zhì)粒pc3. l-Pro_DNA，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:8所示。
3.權(quán)利要求I所述的啟動子在調(diào)控豬HoxalO基因表達中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于動物基因工程應(yīng)用領(lǐng)域。具體涉及豬雌激素誘導(dǎo)啟動子及應(yīng)用。從梅山豬中克隆Hoxa10基因DNA片段(其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示)及其上游4個不同啟動子缺失片段，它們分別為HPro-1、HPro-2、HPro-3和HPro-4。將這些片段構(gòu)建至pGL3-Basic載體中，經(jīng)過雌激素(17Beta-estradiol)后確定HPro-3活性相對較強(其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO5所示)。將HPro-3片段與包含豬Hoxa10基因完整CDS區(qū)域的DNA片段插入pcDNA3.1(+)質(zhì)粒，構(gòu)建豬Hoxa10基因雌激素誘導(dǎo)啟動子質(zhì)粒pc3.1-Pro-DNA，在人子宮內(nèi)膜癌細胞系中驗證該啟動子經(jīng)雌激素誘導(dǎo)后可以增強豬Hoxa10基因表的表達。本發(fā)明同時公開了四個不同缺失啟動子片段的獲得、相應(yīng)重組表達載體的制備方法，從而為雌激素誘導(dǎo)外源基因在子宮內(nèi)膜組織中高效表達提供了新的遺傳資源。
文檔編號C12N15/66GK102796738SQ20111013737
公開日2012年11月28日 申請日期2011年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月21日
發(fā)明者趙書紅, 吳迪, 李長春, 李新云, 曹建華, 余梅 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)