專利名稱：一種檢測(cè)多種高致病性病原細(xì)菌的方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和核酸檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及檢測(cè)多種高致病性病原細(xì)菌的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
引起突發(fā)傳染病的病原體，在平時(shí)可造成烈性傳染病爆發(fā)流行，在戰(zhàn)時(shí)可作為生物武器。這些病原微生物主要分為六大類病毒類、細(xì)菌類、立克次體類、衣原體類、支原體類和真菌類，主要的有40余種。炭疽芽胞桿菌(Bacillus anthracis),鼠疫耶氏菌 (Yersinia pestis)，肉毒梭菌(Clostridium botulinum)，羊布魯菌(Brucella mallei),牛布魯菌(Brucella abortus),豬鏈球菌 2 (Streptococcus suis II)，霍亂弧菌(Vibriocholerae), 土拉弗菌(Francisella tularensis),鼻疽假單胞菌(Burkholderia mallei),類鼻疽假單胞菌(Burkholderia pseudomallei),貝納柯克斯體(Coxiella burnetii),嗜肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila)等都是高致病性病原細(xì)菌。目前，可能引起國(guó)內(nèi)突發(fā)傳染病(生物恐怖或生物突發(fā)事件)的細(xì)菌類病原體主要有炭疽芽胞桿菌、鼠疫耶氏菌、霍亂弧菌、肉毒梭菌、土拉弗菌、鼻疽假單胞菌、類鼻疽假單胞菌、布魯氏菌、豬鏈球菌、貝納柯克斯體(屬立克次體類)、嗜肺軍團(tuán)菌等。這些病菌對(duì)人的危害巨大，其中鼠疫耶氏菌、霍亂弧菌屬于甲類傳染病致病菌，布魯氏菌、炭疽芽胞桿菌屬于乙類傳染病致病菌，土拉弗菌、鼻疽假單胞菌、類鼻疽假單胞菌、豬鏈球菌、嗜肺軍團(tuán)菌也具有很強(qiáng)的致病性，嚴(yán)重時(shí)可以危及生命。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法為培養(yǎng)鑒定法，通過(guò)病菌培養(yǎng)后的外觀和一些理化指標(biāo)進(jìn)行鑒定，耗時(shí)要二至五天時(shí)間，同時(shí)相對(duì)容易出現(xiàn)誤判。后來(lái)興起的分子鑒定法，利用鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)(PCR)對(duì)病菌的基因的脫氧核糖核酸(DNA)進(jìn)行檢測(cè)與鑒定。分子鑒定法主要分為兩類。第一，對(duì)病菌的16S rRNA或23S rRNA基因基因檢測(cè)和鑒定，一般是進(jìn)行序列測(cè)定，即PCR-測(cè)序法，其中16S rRNA的檢測(cè)應(yīng)用最廣泛；這種方法一般需要先對(duì)病菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，然后再進(jìn)行分子鑒定，可靠性最高，鑒定最準(zhǔn)確，不過(guò)耗時(shí)仍然很長(zhǎng)。第二，對(duì)病菌的特異性基因的DNA進(jìn)行檢測(cè)和鑒定，這種方法無(wú)需培養(yǎng)，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，一般只需要幾個(gè)小時(shí)就可以完成；但這種方法有一個(gè)缺點(diǎn)，即每次檢測(cè)只能判斷其是或不是某種病菌，然后進(jìn)行另一次反應(yīng)判斷其是或不是另一種病菌，因此這個(gè)方法都有相應(yīng)檢測(cè)范圍，即只能檢出其檢測(cè)范圍內(nèi)的病菌，假如要檢測(cè)十種病菌就要進(jìn)行十次反應(yīng)，雖然這些反應(yīng)可以依次，也可以平行進(jìn)行，但總體來(lái)講比較繁瑣。有人采用“PCR-固態(tài)芯片”的辦法來(lái)進(jìn)行分子檢測(cè)，即先對(duì)病菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將能識(shí)別不同病菌序列的DNA探針按照一定的順序和位置偶聯(lián)在玻璃片、膜條等固態(tài)介質(zhì)上構(gòu)成DNA芯片，將PCR產(chǎn)物置于芯片上進(jìn)行雜交和信號(hào)檢測(cè)，提高了檢測(cè)的通量，一次反應(yīng)就能檢測(cè)出多種病菌。不過(guò)，與其他固態(tài)芯片檢測(cè)一樣，受固態(tài)芯片自身缺陷所致，這種方法需要多次洗滌，過(guò)程仍顯繁瑣，同時(shí)靈敏度一般也不高，更重要的是重復(fù)性較差，檢測(cè)質(zhì)量不穩(wěn)定。綜上所述，本領(lǐng)域尚缺乏令人滿意的、能夠同時(shí)檢測(cè)多種高致病性病原菌的技術(shù)。因此，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)高靈敏度的、簡(jiǎn)便快捷的、高通量地檢測(cè)多種高致病性病原菌的方法和試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種高靈敏的、簡(jiǎn)便快捷的、高通量地檢測(cè)多種高致病性病原菌的方法和試劑盒。本發(fā)明的第一方面提供了一種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，它包括步驟(a)在聚合酶反應(yīng)體系中進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，其中所述的反應(yīng)體系中含有特異性擴(kuò)增至少5種高致病性病原菌的擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性引物集，其中所述 的高致病性病原菌選自炭疽芽胞桿菌、鼠疫耶氏菌、肉毒梭菌、布魯氏菌、豬鏈球菌、霍亂弧菌、土拉弗菌、鼻疽假單胞菌(或類鼻疽假單胞菌)、貝納柯克斯體、嗜肺軍團(tuán)菌。在另一優(yōu)選例中，所述的反應(yīng)體系中含有特異性擴(kuò)增以下6、7、8、9或10種高致病性病原菌的擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性引物集炭疽芽胞桿菌、鼠疫耶氏菌、肉毒梭菌、布魯氏菌、豬鏈球菌、霍亂弧菌、土拉弗菌、鼻疽假單胞菌(或類鼻疽假單胞菌)、貝納柯克斯體、嗜肺軍團(tuán)菌。在另一優(yōu)選例中，所述的引物集包括由2個(gè)引物所構(gòu)成的引物對(duì)或3-6個(gè)引物所構(gòu)成的引物集。在另一優(yōu)選例中，所述的引物集包括上游引物所述上游引物含有SEQ ID NO. :1、24、25或26所示核苷酸序列；和下游引物所述下游引物含有SEQ ID NO. :2、27、28或28所示核苷酸序列。在另一優(yōu)選例中，所述的擴(kuò)增高致病性病原菌的特異性引物集包括SEQ ID NO.1、24、25或26所示核苷酸序列的上游引物和SEQ ID NO. :2、27、28或28所示核苷酸序列的下游引物。在另一優(yōu)選例中,所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),還包括步驟(b)對(duì)步驟(a)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物用高致病性病原菌的特異性探針進(jìn)行檢測(cè)。在另一優(yōu)選例中，所述引物的5’末端標(biāo)記生物素。在另一優(yōu)選例中，所述的特異性探針帶有可檢測(cè)標(biāo)記。在另一優(yōu)選例中，所述的可檢測(cè)標(biāo)記包括熒光團(tuán)、熒光微球。在另一優(yōu)選例中，在步驟(b)還包括使用作為陰性對(duì)照的探針。較佳地，所述的陰性探針含有SEQ ID NO. :3所示的序列。在另一優(yōu)選例中，步驟(b)中用Luminex xMAP進(jìn)行檢測(cè)。在另一優(yōu)選例中，所述的探針的5’端或3’端具有NH2-間隔臂；或者所述的探針通過(guò)“-NH-間隔臂”結(jié)合于微球或固相載體。在另一優(yōu)選例中，所述的間隔臂選自下組⑴連續(xù)的脫氧胸腺嘧啶核苷即(dT)n，η = 10-15 ；(ii)烷基鏈-(CH2)m-，m = 6-12 ;和(iii)乙二醇己醚(HEG)。
在另一優(yōu)選例中，在步驟(b)中，先進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物與探針的雜交反應(yīng)，雜交完成后加入標(biāo)記了藻紅蛋白(PE)的SA，最終形成微球-探針-PCR產(chǎn)物-生物素-SA-PE復(fù)合物。本發(fā)明的第二方面提供了一種引物集，所述的引物集可特異性擴(kuò)增至少5種高致病性病原菌的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中所述的高致病性病原菌選自炭疽芽胞桿菌、鼠疫耶氏菌、肉毒梭菌、布魯氏菌、豬鏈球菌、霍亂弧菌、土拉弗菌、鼻疽假單胞菌(或類鼻疽假單胞菌)、貝納柯克斯體、嗜肺軍團(tuán)菌。在另一優(yōu)選例中，所述的引物集包括由2個(gè)引物所構(gòu)成的引物對(duì)或3-6個(gè)引物所構(gòu)成的引物集。在另一優(yōu)選例中，所述的引物集包括
上游引物所述上游引物含有SEQ ID NO. :1、24、25或26所示核苷酸序列；和下游引物所述下游引物含有SEQ ID NO. :2、27、28或28所示核苷酸序列。在另一優(yōu)選例中，所述的引物集包括SEQ ID NO. : 1、24、25或26所示核苷酸序列的上游引物和SEQ ID NO. :2、27、28或28所示核苷酸序列的下游引物。在另一優(yōu)選例中，所述引物集是SEQ ID NO. :1和2構(gòu)成的引物對(duì)。本發(fā)明的第三方面提供了一種檢測(cè)試劑盒，它包括第一容器以及位于所述容器內(nèi)本發(fā)明第二方面所述的引物集。在另一優(yōu)選例中，所述的引物集包括由2個(gè)引物所構(gòu)成的引物對(duì)或3-6個(gè)引物所構(gòu)成的引物集。在另一優(yōu)選例中，所述的引物集包括上游引物所述上游引物含有SEQ ID NO. :1、24、25或26所示核苷酸序列；和下游引物所述下游引物含有SEQ ID NO. :2、27、28或28所示核苷酸序列。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還包括使用說(shuō)明書(shū)。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還包括第二容器以及位于所述容器內(nèi)的核酸探針。在另一優(yōu)選例中，所述的探針是針對(duì)炭疽芽胞桿菌、鼠疫耶氏菌、肉毒梭菌、布魯氏菌、豬鏈球菌、霍亂弧菌、土拉弗菌、鼻疽假單胞菌(或類鼻疽假單胞菌)、貝納柯克斯體、嗜肺軍團(tuán)菌的特異性探針。在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒還包括可以被引物組合擴(kuò)增但內(nèi)部序列為其它非相關(guān)病原菌的外源核酸片段，以及包被有可以與這個(gè)外源核酸片段良好雜交的探針的微球，作為內(nèi)參。在本發(fā)明的第四方面，提供了本發(fā)明第二方面中所述的引物集的用途，它被用于制備檢測(cè)高致病性病原菌的試劑盒。在另一優(yōu)選例中，所述的高致病性病原菌包括炭疽芽胞桿菌、鼠疫耶氏菌、肉毒梭菌、布魯氏菌、豬鏈球菌、霍亂弧菌、土拉弗菌、鼻疽假單胞菌(或類鼻疽假單胞菌)、貝納柯克斯體、嗜肺軍團(tuán)菌。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒用于同時(shí)檢測(cè)5-50種(較佳地5-10種)高致病性病原菌。在本發(fā)明的第五方面，提供了本發(fā)明第二方面所述的引物集或本發(fā)明第三方面所述的試劑盒的用途，它用于體外非診斷地檢測(cè)樣品中是否存在高致病性病原菌。
在另一優(yōu)選例中，用于檢測(cè)在環(huán)境樣品是否存在高致病性病原菌。在本發(fā)明的第六方面，提供了一系列寡核苷酸片段，它們具有選自SEQ IDNO. 1-29的核苷酸序列。所述的寡核苷酸可作為引物或探針。在本發(fā)明的第七方面，提供了本發(fā)明上述特異性引物對(duì)和特異性探針的用途，它們被用于制備用于檢測(cè)高致病性病原菌的試劑盒。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過(guò)對(duì)多種高致病性病原菌的核酸序列的廣泛而深入的研究，并經(jīng)過(guò)大量篩選，首次確定了多種高致病性病原菌基因序列中相對(duì)保守的、且多病原菌檢測(cè)時(shí)相互 干擾較小的16s rRNA區(qū)域。針對(duì)所述區(qū)域不僅可以設(shè)計(jì)出特異性擴(kuò)增多種高致病性病原菌的引物，還可設(shè)計(jì)出特異性探針。這樣，在一次PCR反應(yīng)中，通過(guò)檢測(cè)探針的熒光信號(hào)，就可快速簡(jiǎn)便地鑒定多種高致病性病原菌(炭疽芽胞桿菌、鼠疫耶氏菌、肉毒梭菌、布魯氏菌、豬鏈球菌、霍亂弧菌、土拉弗菌、鼻疽假單胞菌(或類鼻疽假單胞菌)、貝納柯克斯體、嗜肺軍團(tuán)菌)。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。術(shù)語(yǔ)如本文所用，術(shù)語(yǔ)“高致病性病原菌”包括引起哺乳動(dòng)物(如人)的疾病的病原菌，其中包括(但并不限于)炭疽芽胞桿菌、鼠疫耶氏菌、肉毒梭菌、布魯氏菌、豬鏈球菌、霍亂弧菌、土拉弗菌、鼻疽假單胞菌(或類鼻疽假單胞菌)、貝納柯克斯體、嗜肺軍團(tuán)菌。引物如本文所用，術(shù)語(yǔ)“高致病性病原菌特異性引物”指這樣的引物(對(duì))，它的擴(kuò)增產(chǎn)物具有高致病性病原菌保守的且各病原菌之間差異較大的16s rRNA基因區(qū)域的核苷酸序列。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“特異性引物”，指長(zhǎng)度通常為18_28nt的寡核苷酸鏈，其與多種高致病性病原菌中一種病原體的基因組上16s rRNA基因的DNA序列(也稱作16s rDNA)完全互補(bǔ)或者相同。在一個(gè)優(yōu)選例中，本發(fā)明人針對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因設(shè)計(jì)了通用引物，能對(duì)全部所要檢測(cè)的病原細(xì)菌的16S rRNA基因片段進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果表明，該引物對(duì)可以同時(shí)擴(kuò)增上述多種高致病性病原菌的核酸。所述引物對(duì)具有以下特點(diǎn)I.上下游引物所在的位置是細(xì)菌16S rRNA基因片段高度保守區(qū)域，所有要檢測(cè)的病菌的16S rRNA基因在此位置的DNA序列都完全相同；2.上下游引物之間間距，即擴(kuò)增產(chǎn)物在150 200堿基對(duì)(bp)之間(因不同細(xì)菌的序列有差異，所以擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度不完全一樣)，這樣長(zhǎng)度的PCR擴(kuò)增效率高，其后與相應(yīng)的探針雜交的效率也高，因此靈敏度較高；3.上下游引物之間的序列是16S rRNA基因的可變區(qū)域，不同細(xì)菌之間差異極大，不同屬(Genus)甚至不同種(Species)的細(xì)菌之間的序列都不相同，一般作為細(xì)菌分子鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)；
4.引物對(duì)的兩條或者其中一條5’末端可任選地標(biāo)記有生物素(biotin)，其可以與親和素(avidin)或鏈親和素(streptavidin, SA)緊密結(jié)合,在后來(lái)檢測(cè)時(shí)的起到信號(hào)放大、顯示或標(biāo)記等作用。
名稱~W^\~SEQ ID NO. ~
Tgl6sF5， TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3，
Tgl6sR5， TATTACCGCGGCTGCTGG-3，2*SEQ ID NO. : 1_2所示引物較佳地在5’末端標(biāo)記有生物素。
此外，上述上游和下游引物的衍生引物也可用于本發(fā)明。并且任一上游引物可與任一下游弓I物組合構(gòu)成弓I物對(duì)。其中，適用于本發(fā)明的上游引物還包括
名稱~W^\~SEQ ID NO. ~
Tgl6sFl5， -ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3，24
Tgl6sF25’ -CTCCTACGGGAGGCAGCAG-3J25
Tgl6sF35， -ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT-3，26其中，適用于本發(fā)明的下游引物還包括
名稱~W^\~SEQ ID NO. ~
Tgl6sRl5， -TATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3，27
Tgl6sR25， -GTATTACCGCGGCTGCTGGCA-3，28
Tgl6sR35， -GTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3，29探針如本文所用，術(shù)語(yǔ)“高致病性病原菌特異性探針”指能夠結(jié)合于高致病性病原菌的擴(kuò)增產(chǎn)物，但不結(jié)合于其他無(wú)關(guān)的擴(kuò)增產(chǎn)物的探針。更佳地，所述的高致病性病原菌特異性探針具有SEQ ID NO 4-23所示的核苷酸序列。本發(fā)明的特異性探針帶有可檢測(cè)標(biāo)記。所述的可檢測(cè)標(biāo)記的例子包括(但并不限于)突光團(tuán)、突光微球。一種優(yōu)選的可檢測(cè)標(biāo)記是熒光微球。利用Luminex xMAP法可方便地同時(shí)區(qū)分和檢測(cè)多種不同的突光微球。Luminex xMAP是一個(gè)非常靈活的多功能技術(shù)平臺(tái)。其原理是把微小的乳膠顆粒(Beads，簡(jiǎn)稱為“微球”)分別染成不同的熒光色，然后再把針對(duì)不同檢測(cè)物的探針或蛋白以共價(jià)方式結(jié)合到特定顏色的微球上。應(yīng)用時(shí)，先把針對(duì)不同檢測(cè)物的、用不同顏色編碼的微球混合，再加入被檢測(cè)物(被測(cè)物可以是血清或樣品中的核酸(如擴(kuò)增產(chǎn)物)、抗原、抗體、或酶等)。在懸液中的微球與被檢測(cè)物特異性地結(jié)合，并加上熒光標(biāo)記。然后，微球成單列通過(guò)兩束激光，一束判定微球的顏色從而決定被測(cè)物的特異性(定性)；另一束測(cè)定微球上的熒光標(biāo)記強(qiáng)度從而決定被測(cè)物的量(定量)，所得到的數(shù)據(jù)經(jīng)電腦處理后可以直接用來(lái)判斷結(jié)果。在Luminex檢測(cè)儀上，這些微球被微量液體傳送系統(tǒng)排成單列，通過(guò)兩束激光，一束判定微球的編碼從而決定被測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的種類；另一束測(cè)定微球上PE的熒光強(qiáng)度，經(jīng)數(shù)據(jù)處理得出被測(cè)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的含量。關(guān)于Luminex xMAP的技術(shù)平臺(tái)詳細(xì)資料,請(qǐng)參見(jiàn)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)或文獻(xiàn)，(I)CancerChemotherapy and Pharmacology,51 :321-327, (2)Journal of Immunological Methods,227 :41-52 ； (3)WWW. luminexcorp. com。探針微球集本發(fā)明還提供了可用于檢測(cè)多種高致病性病原菌的式I熒光微球和熒光微球集。P-bead (I)式中，“P”表示針對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性探針，“bead”表示微球，表示探針與微球之間的結(jié)合方式。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，提供了一套檢測(cè)多種高致病性病原菌的探針微球集。該探針微球集具有一個(gè)或多個(gè)以下特征I.它可包括10-50種不同的突光編碼微球；2.其中一個(gè)微球上固定有一條不與任何一種病菌相關(guān)位置DNA序列相同的探針，其余的每種微球上固定有一種針對(duì)特定病菌的特異性核酸探針，每種探針在試劑盒描述的條件下僅能與對(duì)應(yīng)的病菌的16s rRNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物相結(jié)合，并且具有較強(qiáng)的結(jié)合能力，同時(shí)又不與其他任何病菌的產(chǎn)物結(jié)合；3.為了與微球交聯(lián)固定，探針的5’端均可標(biāo)記有氨基。4.為了減小空間位阻，5’端氨基和探針之間插入有間隔臂(spacer)，典型的間隔臂是連續(xù)的10至15個(gè)脫氧胸腺嘧啶核苷即dT，也可以是烷基鏈，如C6[即-(CH2)6-]或C12[即-(CH2)12-],也可以是乙二醇己醚(HEG)，等等。5.探針序列既可以是正向序列，也可以說(shuō)其反向(互補(bǔ))序列，探針的序列見(jiàn)下表(其中標(biāo)記為2的探針是另一優(yōu)選例，其序列是I的互補(bǔ)序列，可任選其一使用)
權(quán)利要求
1.一種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，其特征在于，它包括步驟 (a)在聚合酶反應(yīng)體系中進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，其中所述的反應(yīng)體系中含有特異性擴(kuò)增至少5種高致病性病原菌的擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性引物集，其中所述的高致病性病原菌選自炭疽芽胞桿菌、鼠疫耶氏菌、肉毒梭菌、布魯氏菌、豬鏈球菌、霍亂弧菌、土拉弗菌、鼻疽假單胞菌(或類鼻疽假單胞菌)、貝納柯克斯體、嗜肺軍團(tuán)菌。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的擴(kuò)增高致病性病原菌的特異性引物集包括SEQ ID NO. :1、24、25或26所示核苷酸序列的上游引物和SEQ ID NO. :2、27、28或28所示核苷酸序列的下游引物。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，還包括步驟 (b)對(duì)步驟I獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物用高致病性病原菌的特異性探針進(jìn)行檢測(cè)。
4.如權(quán)利要求3所示的方法，其特征在于，所述的探針的5’端或3’端具有NH2-間隔臂；或者所述的探針通過(guò)“-NH-間隔臂”結(jié)合于微球或固相載體。
5.一種引物集，其特征在于，所述的引物集可特異性擴(kuò)增至少5種高致病性病原菌的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中所述的高致病性病原菌選自炭疽芽胞桿菌、鼠疫耶氏菌、肉毒梭菌、布魯氏菌、豬鏈球菌、霍亂弧菌、土拉弗菌、鼻疽假單胞菌(或類鼻疽假單胞菌)、貝納柯克斯體、嗜肺軍團(tuán)菌。
6.如權(quán)利要求5所述的引物集，其特征在于，所述的引物集包括 上游引物所述上游引物含有SEQ ID NO. :1、24、25或26所示核苷酸序列；和 下游引物所述下游引物含有SEQ ID NO. :2、27、28或28所示核苷酸序列。
7.如權(quán)利要求5所述的引物集，其特征在于，所述的引物集包括SEQID NO. :1、24、25或26所示核苷酸序列的上游引物和SEQ ID NO. :2、27、28或28所示核苷酸序列的下游引物。
8.—種檢測(cè)試劑盒，其特征在于，它包括第一容器以及位于所述容器內(nèi)權(quán)利要求5所述的引物集。
9.如權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還包括第二容器以及位于所述容器內(nèi)的核酸探針。
10.如權(quán)利要求5所述的引物集的用途，其特征在于，用于制備檢測(cè)高致病性病原菌的試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測(cè)多種高致病性病原細(xì)菌的方法和試劑盒。具體地，本發(fā)明公開(kāi)了一種同時(shí)檢測(cè)多種高致病性病原細(xì)菌的方法，包括在聚合酶反應(yīng)體系中，用特異性的針對(duì)高致病性病原菌的引物集進(jìn)行PCR反應(yīng)，從而獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；以及用特異性探針或探針微球進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明還提供了相應(yīng)的試劑盒。本發(fā)明可靈敏、簡(jiǎn)便地檢測(cè)和鑒定多種高致病性病原菌，其中包括炭疽芽胞桿菌、鼠疫耶氏菌、肉毒梭菌、布魯氏菌、豬鏈球菌、霍亂弧菌、土拉弗菌、鼻疽假單胞菌(或類鼻疽假單胞菌)、貝納柯克斯體、嗜肺軍團(tuán)菌。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102796810SQ20111013754
公開(kāi)日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2011年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月24日
發(fā)明者譚暢, 王勤熙, 張秀斐, 姚見(jiàn)兒 申請(qǐng)人:上海透景生命科技有限公司