專利名稱：一種快速提取人參葉組織rna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提取RNA的方法。
背景技術(shù)：
從植物組織中提取質(zhì)量高，完整性好的RNA是進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析、cDNA文庫構(gòu)建、 northern印跡分析，DDRT-PCR、cDNA末端快速擴增、RT-PCR等分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的工作基礎(chǔ)。針對不同的植物材料選擇適合的方法至關(guān)重要。由于人參植物中含有大量的蛋白質(zhì)、 糖、多酚以及其他次生代謝物質(zhì)代謝產(chǎn)物，內(nèi)源RNase活性較高，嚴(yán)重干擾了 RNA的提取，導(dǎo)致實驗失敗。以往大多數(shù)實驗室都采用傳統(tǒng)的CTAB法、SDS法提取植物的RNA，或者購買商業(yè)試劑盒提取RNA，這些方法操作步驟繁瑣，耗時長，所用藥品多，成本高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有提取人參葉組織RNA的方法存在步驟繁瑣、耗時長、所用藥品多和成本高的問題，而提供一種快速提取人參葉組織RNA的方法?？焖偬崛∪藚⑷~組織RNA的方法按以下步驟進(jìn)行一、將200mg人參葉組織，洗凈拭干后在液氮中研磨成粉末，然后加入到裝有750 μ L提取緩沖液和75 μ L β -巰基乙醇的離心管中，再加入350 μ L Tris平衡酚和350 μ L氯仿，震蕩5min后在13000r/min、4°C的條件下離心5min ；二、離心后取上清，加入350 μ L Tris平衡酚和350 μ L氯仿，震蕩5min 后在13000r/min、4°C的條件下離心5min，離心后取上清，加入750 μ L的氯仿，震蕩5min 后在13000r/min、4°C的條件下離心5min ；三、離心后取上清，加入等體積的異丙醇，混勻后于_20°C沉淀20min，然后在13000r/min、4°C的條件下離心15min，棄去上清液；四、采用體積濃度為75%、冰浴的乙醇ImL洗滌RNA沉淀一次，空氣中晾干沉淀，即完成快速提取人參葉組織RNA ；其中步驟一中提取緩沖液2% (質(zhì)量)十二烷基硫酸鈉、4mol/L尿素、0. Imol/ LNaCl、0. 01mol/L EDTA (pH8. 0)和 0.05mol/L Tris-HCL (pH8. 0)；步驟一中 β-巰基乙醇的體積濃度為10%。本發(fā)明與傳統(tǒng)的CTAB法等相比，提取效果比較好，時間短，容易操作。比商業(yè)試劑盒提取成本低。1、提取緩沖液中多種成分的加入可以增加對RNase活性的抑制。SDS不僅是蛋白質(zhì)變性劑，同時也是RNase的抑制劑，高濃度的尿素也是RNase的抑制劑。2、在材料提取之前，預(yù)先在提取液中加入Tris-平衡酚、氯仿，更能有效的抑制 RNase的活性。同時Tris-平衡酚、氯仿震蕩抽提，可以充分的變性RNase，通過離心除去。3、提取液中加入了 10%的β -巰基乙醇，高濃度的β -巰基乙醇用來抑制RNA酶的活性，也可以防止樣品氧化，因為酚類化合物很容易被氧化形成以共價鍵連接的奎寧，更易于綁定核酸，這引起了對RNA不可逆轉(zhuǎn)的破壞。β-巰基乙醇作為強還原劑可以防止多酚的氧化，可以打斷多酚氧化酶的二硫鍵使之失活。
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4、前3點能很好的解決了 RNAase污染的問題。保護(hù)RNA不受污染和降解。5、SDS是陰離子去污劑，可以解離核酸與蛋白質(zhì)的結(jié)合，并且蛋白質(zhì)與帶正電荷的側(cè)鏈結(jié)合，在高鹽存在下形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物而沉淀。6、傳統(tǒng)的CTAB法需要65°C水浴，在SDS法中無65°C水浴，這樣也避免了 CTAB法中由于高溫而引起RNA降解和水中污染的機會。7、在所有離心的過程中都選擇了高速離心(13000r/min)，高速離心，減少離心時
間。提取出來RNA質(zhì)量也很高。8、在沉淀過程中，在冰箱-20°C內(nèi)進(jìn)行20min沉淀，比傳統(tǒng)的室溫沉淀、冰上沉淀效果好，比過夜沉淀的方法更減少時間，也減少了其他雜質(zhì)也被沉淀的機會。可以防止RNA 在沉淀過程中不被降解。9、傳統(tǒng)提取RNA的方法大約在150分鐘左右，過夜沉淀的方法需要的時間更長。在本方法操作過程中，從提取到最后得到樣品需要的時間在90-100分鐘之內(nèi)。節(jié)省了時間。10、本方法比商業(yè)試劑盒方法成本低，國外提取試劑盒提取50次/盒，大約要上千元成本，本方法配制提取50次的各種試劑用量需要500-600元的成本。


圖1為具體實施方式
一中總RNA質(zhì)量檢測的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖2為具體實施方式
一中RT-PCR檢測的瓊脂糖凝膠電泳圖。
具體實施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式快速提取人參葉組織RNA的方法按以下步驟進(jìn)行 一、將200mg人參葉組織，洗凈拭干后在液氮中研磨成粉末，然后加入到裝有750 μ L提取緩沖液和75 μ L β-巰基乙醇的離心管中，再加入350 μ L Tris平衡酚和350 μ L氯仿，震蕩5min后在13000r/min、4°C的條件下離心5min ；二、離心后取上清，加入350 μ L Tris平衡酚和350 μ L氯仿，震蕩5min后在13000r/min、4°C的條件下離心5min，離心后取上清，加入750 μ L的氯仿，震蕩5min后在13000r/min、4°C的條件下離心5min ；三、離心后取上清， 加入等體積的異丙醇，混勻后于-20°C沉淀20min，然后在13000r/min、4°C的條件下離心 15min，棄去上清液；四、采用體積濃度為75%、冰浴的乙醇ImL洗滌RNA沉淀一次，空氣中晾干沉淀，即完成快速提取人參葉組織RNA ；其中步驟一中提取緩沖液2% (質(zhì)量)十二烷基硫酸鈉、4mol/L尿素、0. Imol/ LNaCl、0. 01mol/L EDTA (pH8. 0)和 0.05mol/L Tris-HCL (pH8. 0)；步驟一中 β-巰基乙醇的體積濃度為10%。本實施方式步驟一中人參葉組織為鮮樣。本實施方式中提取的人參葉組織RNA，加入40 μ L的DEPC即可保存?zhèn)溆?。本實施方式中提取的人參葉組織RNA，進(jìn)行RNA質(zhì)量檢測1、總RNA質(zhì)量檢測與分析1. 的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，紫外分光光度法進(jìn)行純度檢測；結(jié)果如圖1所示，其中^S、18S條帶清晰可見，28S與18S熒光亮度比接近2 1，說明RNA比較完整；取適量的總RNA經(jīng)紫外分光光度計進(jìn)行純度測定，RNA的A26tZA28tl值為1. 98，證明RNA 質(zhì)量好。2、RT-PCR 檢測將提取的總RNA用RQl RNase-Free DNase消化DNA ；消除可能的DNA污染；根據(jù)clontech公司提供RT-PCR操作體系說明書進(jìn)行；將總RNA使用反轉(zhuǎn)錄酶和SMART IV Oligonucleotide反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA，單鏈cDNA通過LD-PCR擴增生成dscDNA ；所提供的引物序列SMART IV Oligonucleotide(IOuM) 5，-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGC CGGG-3，；CDSIII/3，PCR Primer(IOuM) :5，-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)3(^_#_3，( N = A，G，CorT ；N^1 = A, G, orC) ；5，PCRPrimer(IOuM) :5，-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3，； PCR程序反應(yīng)參數(shù)如下95°C預(yù)變性Imin ；95°C變性15s，68°C延伸6min，共23個循環(huán)；至 4°C結(jié)束反應(yīng)。取5μ L反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1. 的瓊脂糖電泳鑒定產(chǎn)物。結(jié)果如圖2所示，經(jīng)1. 1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，SDS法提取的RNA經(jīng)過RT-PCR得到ds cDNA片段條帶彌散分布大小在0. 2-3. 01Λ，進(jìn)一步表明本實施方式提取的總RNA質(zhì)量合格，降解量少，cDNA的長片段較多；說明能夠用于進(jìn)行下一步cDNA文庫構(gòu)建、轉(zhuǎn)錄組測序等分子生物學(xué)研究。
具體實施方式
二 本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟一中離心管的規(guī)格為1. 5ml或2. Oml0其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟三中異丙醇在使用前要進(jìn)行預(yù)冷，預(yù)冷溫度為-20°C。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一相同。
權(quán)利要求
1.一種快速提取人參葉組織RNA的方法，其特征在于快速提取人參葉組織RNA的方法按以下步驟進(jìn)行一、將200mg人參葉組織，洗凈拭干后在液氮中研磨成粉末，然后加入到裝有750 μ L提取緩沖液和75 μ Li3 -巰基乙醇的離心管中，再加入350 μ L Tris平衡酚和 350 μ L氯仿，震蕩5min后在13000r/min、4°C的條件下離心5min ；二、離心后取上清，加入 350 μ L Tris平衡酚和350 μ L氯仿，震蕩5min后在13000r/min、4°C的條件下離心5min，離心后取上清，加入750 μ L的氯仿，震蕩5min后在13000r/min、4°C的條件下離心5min ；三、 離心后取上清，加入等體積的異丙醇，混勻后于_20°C沉淀20min，然后在13000r/min、4°C 的條件下離心15min，棄去上清液；四、采用體積濃度為75%、冰浴的乙醇ImL洗滌RNA沉淀一次，空氣中晾干沉淀，即完成快速提取人參葉組織RNA ；其中步驟一中提取緩沖液2% (質(zhì)量)十二烷基硫酸鈉、4mol/L尿素、0. Imo 1/L NaCl, 0. 01mol/L EDTA和0. 05mol/L Tris-HCL ；步驟一中β-巰基乙醇的體積濃度為10%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速提取人參葉組織RNA的方法，其特征在于步驟一中離心管的規(guī)格為1. 5ml或2. Oml0
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速提取人參葉組織RNA的方法，其特征在于步驟三中異丙醇在使用前要進(jìn)行預(yù)冷，預(yù)冷溫度為-20°C。
全文摘要
一種快速提取人參葉組織RNA的方法，它涉及一種提取RNA的方法。它解決了現(xiàn)有提取人參葉組織RNA的方法存在步驟繁瑣、耗時長、所用藥品多和成本高的問題。方法一、將人參葉組織在液氮中研磨成粉末，加提取緩沖液、β-巰基乙醇、Tris平衡酚和氯仿，震蕩后在離心；二、離心后取上清，加Tris平衡酚和氯仿，震蕩后離心，離心后取上清，加氯仿，震蕩后離心；三、離心后取上清，加異丙醇，沉淀后離心，棄去上清液；四、用乙醇洗滌RNA沉淀，空氣中晾干沉淀后即完成。本發(fā)明與傳統(tǒng)的CTAB法等相比，提取效果比較好，時間短，容易操作；比商業(yè)試劑盒提取成本低。
文檔編號C12N15/10GK102181435SQ20111013860
公開日2011年9月14日 申請日期2011年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月26日
發(fā)明者楊成君 申請人:東北林業(yè)大學(xué)