專利名稱：檢測(cè)kras突變的試劑及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及檢測(cè)KRAS突變的試劑及方法。
背景技術(shù)：
目前，靶向治療已經(jīng)成為腫瘤臨床治療的重要手段。表皮生長因子受體(EGFR)是靶向治療的主要作用靶點(diǎn)。EGFR的靶向藥物包括EGFR單克隆抗體藥西妥昔單抗、尼妥珠單抗、帕尼單抗，以及EGFR酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼和厄洛替尼。這些藥物能通過抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展中必須的表皮生長因子受體酪氨酸激酶阻斷腫瘤細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)，從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞的增生、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。但是，臨床試驗(yàn)表明這些靶向藥物僅對(duì)部分腫瘤患者有顯著的療效。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中KRAS基因發(fā)生突變(體細(xì)胞突變)的腫瘤患者對(duì)此類靶向藥物完全耐藥。因此，檢測(cè)腫瘤患者KRAS基因是否突變成為決定能否使用EGFR靶向藥物的必要前提條件。
Ras基因家族與人類腫瘤相關(guān)的基因有三種-H-ras、KRAS和N_ras，分別定位在11、12和I號(hào)染色體上。作為原癌基因的ras基因被激活后就變成有致癌活性的癌基因，ras基因通過突變而激活。其中，KRAS則對(duì)人類癌癥影響最大，正常時(shí)能控制調(diào)控細(xì)胞生長的路徑；發(fā)生異常時(shí)，則不受上游EGFR的信號(hào)影響，導(dǎo)致細(xì)胞持續(xù)生長，并阻止細(xì)胞凋亡。這是具有突變型KRAS基因患者對(duì)抗EGFR藥物治療無效的理論基礎(chǔ)。根據(jù)上述可見，臨床上準(zhǔn)確、快速地判斷腫瘤患者是否存在KRAS基因的突變是決定用藥策略的關(guān)鍵。因此，非常有必要優(yōu)化檢測(cè)突變型KRAS基因的新試劑，以快速、全面、準(zhǔn)確地鑒定出突變型KRAS基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供檢測(cè)KRAS突變的試劑及方法。在本發(fā)明的第一方面，提供一種檢測(cè)樣品中是否存在KRAS基因變異的試劑，所述的試劑是引物組合，選自下組用于檢測(cè)KRAS第12密碼子突變的引物組合正向引物SEQ ID NO :3、SEQID NO 4、SEQ ID NO 5, SEQ ID N0:6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8 和反向引物 SEQ ID NO 9 ；用于檢測(cè)KRAS第13密碼子突變的引物組合正向引物SEQ ID N0:18和反向引物SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :13、SEQ ID NO :14、SEQ ID NO :15、SEQID NO :16、SEQ ID NO 17 ;或用于檢測(cè)KRAS第61密碼子突變的引物組合正向引物SEQ ID NO 19, SEQ ID NO:20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO 24 和反向引物 SEQ ID NO 25。在另一優(yōu)選例中，SEQ ID N0:3、SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :5被制成混合的引物。在另一優(yōu)選例中，SEQ ID N0:6、SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8被制成混合的引物。在另一優(yōu)選例中，SEQ ID NO :12、SEQ ID NO 13和SEQ ID NO :14被制成混合的引物。在另 一優(yōu)選例中，SEQ ID NO :15、SEQ ID NO 16和SEQ ID NO 17被制成混合的引物。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑同時(shí)包括用于檢測(cè)KRAS第12密碼子突變的引物組合；用于檢測(cè)KRAS第13密碼子突變的引物組合和用于檢測(cè)KRAS第61密碼子突變的引物組合。在本發(fā)明的另一方面，提供所述的試劑的用途，用于制備檢測(cè)樣品中是否存在KRAS基因變異的試劑盒。在本發(fā)明的另一方面，提供一種檢測(cè)樣品中是否存在KRAS基因變異的試劑盒，所述的試劑盒中含有選自所述的一種或多種引物組合。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中同時(shí)含有用于檢測(cè)KRAS第12密碼子突變的引物組合；用于檢測(cè)KRAS第13密碼子突變的引物組合和用于檢測(cè)KRAS第61密碼子突變的引物組合。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還含有PCR擴(kuò)增試劑。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還含有核酸提取試劑。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還含有核酸序列分析軟件；和/或使用說明書。在本發(fā)明的另一方面，提供一種(體外非診斷性地)檢測(cè)樣品中是否存在KRAS基因變異的方法，所述的方法包括以核酸樣品為模板，利用所述的引物組合對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若是獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，則表明檢測(cè)樣品中存在KRAS突變。在另一優(yōu)選例中，通過瓊脂糖凝膠電泳來分析PCR擴(kuò)增后是否獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖I顯示了利用針對(duì)KRAS密碼子12的引物來檢測(cè)模板DNA突變情況的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果。圖2顯示了利用針對(duì)KRAS密碼子13的引物來檢測(cè)模板DNA突變情況的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果。圖3顯示了利用針對(duì)KRAS密碼子61的引物來檢測(cè)模板DNA突變情況的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果。圖4顯示了密碼子12突變(GGT — GCT)的DNA模板相應(yīng)位置的序列測(cè)定結(jié)果。圖5顯示了密碼子13突變(GGC — GAC)的DNA模板相應(yīng)位置的序列測(cè)定結(jié)果。圖6顯示了密碼子61突變(CAA — CAT)的DNA模板相應(yīng)位置的序列測(cè)定結(jié)果。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，找到了一類特別適合于擴(kuò)增和鑒定出KRAS密碼子12、13及61位置處基因突變的引物，所述引物經(jīng)過合理的設(shè)計(jì)、優(yōu)選而獲得，用于PCR擴(kuò)增時(shí)特異性良好，且擴(kuò)增效率高，可以快速地鑒定出同一密碼子的不同堿基的突變，也可以快速地鑒定出同一基因不同密碼子的突變。KRAS 基因KRAS基因是Ras基因家族中與人類腫瘤相關(guān)的基因。其全長基因序列參見GenBank登錄號(hào)NM_004985. 3 ;其編碼的蛋白的序列參見GenBank登錄號(hào)NP_004976. 2。KRAS突變的最常見的方式就是點(diǎn)突變，多發(fā)生在第12、13和61密碼子，占所有突變率的90%以上，其中又以第12密碼子突變最常見，密碼子GGT的前2個(gè)核苷酸可分別突變成A/C/T、A/C/T。第13密碼子GGC的前2個(gè)核苷酸可分別突變成A/C/T、A/C/T。第61密碼子CAA的3個(gè)核苷酸可分別突變?yōu)锳、T、T0 KRAS基因的突變導(dǎo)致細(xì)胞逃逸凋亡，這種異常在胰腸癌、大腸癌、肺癌等腫瘤組織中發(fā)生率較高。據(jù)國外文獻(xiàn)報(bào)道，最高為胰外分泌腺癌，達(dá)90%，結(jié)腸癌為40 50%，肺癌和膀胱癌為13%，而胃癌較低在10%以下。因此這幾種癌癥中KRAS基因野生型患者使用靶向EGFR藥物的療效也比較顯著，特別是結(jié)腸直 腸癌，美國癌癥綜合網(wǎng)絡(luò)(NCCN)已把KRAS突變的檢測(cè)列為《結(jié)腸癌臨床治療指南》與《直腸癌臨床治療指南》臨床用藥必檢項(xiàng)目。KRAS基因變異的檢測(cè)試劑或試劑盒基于KRAS基因與人類腫瘤的密切相關(guān)性，可以通過分析KRAS基因的變異情況
(i)進(jìn)行腫瘤的鑒別診斷、和/或易感性分析；(ii)早期評(píng)估相關(guān)人群腫瘤的患病風(fēng)險(xiǎn)，早期監(jiān)測(cè)早期防治。可采用各種技術(shù)來檢測(cè)KRAS基因變異位點(diǎn)，較為方便的是用KRAS基因突變型特異的引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，對(duì)KRAS基因進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，從而判斷是否發(fā)生變異。該技術(shù)也可檢測(cè)KRAS基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。在檢測(cè)KRAS基因變異時(shí)，檢測(cè)可以針對(duì)cDNA，也可針對(duì)基因組DNA。本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)KRAS基因突變時(shí)，利用一般的引物，PCR擴(kuò)增時(shí)往往存在特異性差，擴(kuò)增效率低下；并且，由于KRAS基因存在多個(gè)密碼子多個(gè)堿基位點(diǎn)的突變，一般的引物難以快速高效地測(cè)定。因此，需要設(shè)計(jì)和篩選特異性好的引物，且需要巧妙地設(shè)計(jì)出多種組合應(yīng)用的引物以提高檢測(cè)效率。經(jīng)過大量的試驗(yàn)和比較，本發(fā)明人找到了分別對(duì)應(yīng)于KRAS基因的密碼子12、13和61的引物。所述引物用于PCR擴(kuò)增時(shí)特異性良好，且擴(kuò)增效率高，可以快速地鑒定出同一密碼子的不同堿基的突變，也可以快速地鑒定出同一基因不同密碼子的突變。KRAS基因變異的檢測(cè)試劑盒本發(fā)明還提供了用于在分析物中檢測(cè)含有KRAS基因變異的試劑盒，該試劑盒包括裝在適當(dāng)容器中的、用于特異性擴(kuò)增KRAS基因的引物，并且用所述引物擴(kuò)增出的擴(kuò)增產(chǎn)物含有KRAS基因相關(guān)密碼子上疾病相關(guān)的變異部位。此外，所述的試劑盒中還可包括用于提取DNA、PCR擴(kuò)增等所需的各種試劑，包括但不限于抽提液、擴(kuò)增液、雜交液、酶、洗液等。這些試劑均是本領(lǐng)域人員所了解的。此外，所述的試劑盒中還可包括使用說明書和/或核酸序列分析軟件等，便于本領(lǐng)域人員使用和分析。測(cè)定KRAS基因突變的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明人還提供了一種檢測(cè)樣品中是否存在KRAS基因變異的方法，所述的方法包括以核酸樣品為模板，利用本發(fā)明所述的引物組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。較佳地，在檢測(cè)KRAS基因變異時(shí)，還設(shè)置野生型的對(duì)照，以提高檢測(cè)的準(zhǔn)確率。通過本發(fā)明的檢測(cè)KRAS密碼子12、13及61突變情況的方法，可以快速確定癌癥患者對(duì)吉非替尼、厄洛替尼、西妥昔單抗、帕尼單抗等藥物的敏感性。對(duì)患者樣本進(jìn)行DNA的抽提，利用突變特異的組合引物進(jìn)行目標(biāo)片段的擴(kuò)增，電泳分析，檢測(cè)KRAS密碼子12、13和61的突變位點(diǎn)。本發(fā)明通過設(shè)計(jì)突變特異的引物，以組合引物擴(kuò)增目標(biāo)序列，電泳分析檢測(cè)KRAS密碼子12、13及61的突變，有助于更準(zhǔn)確地指導(dǎo)腫瘤患者對(duì)吉非替尼、厄洛替尼、西妥昔單抗、尼妥珠單抗、帕尼單抗等藥物的治療。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于
(I)首次針對(duì)KRAS基因的多個(gè)密碼子設(shè)計(jì)了合適的引物組合，所述引物組合在用于PCR擴(kuò)增時(shí)特異性良好，擴(kuò)增效率高。(2)本發(fā)明的引物組合可快速高效地確定KRAS基因多位點(diǎn)上多堿基突變情況，快速高效。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例I、引物的設(shè)計(jì)根據(jù)KRAS密碼子12、13和61的突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物。針對(duì)各個(gè)突變位點(diǎn)在基因結(jié)構(gòu)中所處的位置以及突變的特點(diǎn)，對(duì)于引物的序列長短、位置均作為考察的因素。本發(fā)明人經(jīng)過反復(fù)比較和優(yōu)化，獲得以下序列的引物針對(duì)KRAS密碼子12，引物序列為正向野生型WFl :5，-cttgtggtagttggagctg (SEQ ID NO 1)；野生型WF2 :5’ -cttgtggtagttggagctgg (SEQ ID NO 2)；突變型MFl :5，-cttgtggtagttggagct (a/c/t) (SEQ ID NO :3/4/5)；突變型MF2 :5，-cttgtggtagttggagctg (a/c/t) (S EQ ID NO :6/7/8)；反向Rl :5，-tgcacagagagtgaacatc(SEQ ID NO :9)。注以上MFl和MF2為混合的引物，即合成時(shí)在末端堿基同時(shí)產(chǎn)生a/c/t。針對(duì)KRAS密碼子13，引物序列為反向野生型WRl :5，-caaggcactcttgccatcgc (SEQ ID NO 10)；野生型WR2 :5，-caaggcactcttgccatcgcc (SEQ ID NO 11)；
突變型MRl :5，-caaggcactcttgccatcg (a/g/1) (SEQ ID NO :12/13/14)；突變型MR2 :5，-caaggcactcttgccatcgc (a/g/t) (SEQ ID NO :15/16/17)；正向F :5，-tacacgtctgcagtcaactg(SEQ ID NO :18)。注以上MRl和MR2為混合的引物，即合成時(shí)在末端堿基同時(shí)產(chǎn)生a/g/t。針對(duì)KRAS密碼子61，引物序列為正向野生型WF3 :5，-atattctcgacacagcaggtc-3，(SEQ ID NO :19)；野生型WF4 :5，-atattctcgacacagcaggtca-3’ (SEQ ID NO :20)；野生型WF5 :5，-atattctcgacacagcaggtcaa-3’ (SEQ ID NO :21)；突變型MF3 :5，-atattctcgacacagcaggta-3，(SEQ ID NO :22)；突變型MF4 :5，-atattctcgacacagcaggtct-3’ (SEQ ID NO :23)；突變型MF5 :5，-atattctcgacacagcaggtcat-3’ (SEQ ID NO :24)；反向R2 :5，-aattactccttaatgtcagc-3’ (SEQ ID NO :25)。實(shí)施例2、引物組合檢測(cè)通過表I所列的引物組合方式進(jìn)行檢測(cè)。表I
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)樣品中是否存在KRAS基因變異的試劑，其特征在于，所述的試劑是引物組合，選自下組 用于檢測(cè)KRAS第12密碼子突變的引物組合正向引物SEQ ID NO 3,SEQID NO :4、SEQID NO 5, SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID NO :8 和反向引物 SEQ ID NO :9 ;用于檢測(cè)KRAS第13密碼子突變的引物組合正向引物SEQ ID NO :18和反向引物SEQID NO 12,SEQ ID NO 13,SEQ ID NO 14,SEQ ID NO 15,SEQID NO 16,SEQ ID N0:17;或用于檢測(cè)KRAS第61密碼子突變的引物組合正向引物SEQ ID NO 19,SEQ ID NO :20、SEQ ID NO 2U SEQ ID NO 22, SEQ ID NO 23, SEQ ID NO :24 和反向引物 SEQ ID NO :25。
2.如權(quán)利要求I所述的試劑，其特征在于，所述的試劑同時(shí)包括用于檢測(cè)KRAS第12密碼子突變的引物組合；用于檢測(cè)KRAS第13密碼子突變的引物組合和用于檢測(cè)KRAS第61密碼子突變的引物組合。
3.權(quán)利要求I或2所述的試劑的用途，用于制備檢測(cè)樣品中是否存在KRAS基因變異的試劑盒。
4.一種檢測(cè)樣品中是否存在KRAS基因變異的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中含有選自權(quán)利要求I的一種或多種引物組合。
5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中同時(shí)含有用于檢測(cè)KRAS第12密碼子突變的引物組合；用于檢測(cè)KRAS第13密碼子突變的引物組合和用于檢測(cè)KRAS第61密碼子突變的引物組合。
6.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中還含有PCR擴(kuò)增試劑。
7.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中還含有核酸提取試劑。
8.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中還含有 核酸序列分析軟件；和/或 使用說明書。
9.一種檢測(cè)樣品中是否存在KRAS基因變異的方法，其特征在于，所述的方法包括 以核酸樣品為模板，利用選自權(quán)利要求I的引物組合對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若是獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，則表明檢測(cè)樣品中存在KRAS突變。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，通過瓊脂糖凝膠電泳來分析PCR擴(kuò)增后是否獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測(cè)KRAS突變的試劑及方法。揭示了一類特別適合于擴(kuò)增和鑒定出KRAS密碼子12、13及61位置處基因突變的引物，所述引物經(jīng)過合理的設(shè)計(jì)、優(yōu)選而獲得，用于PCR擴(kuò)增時(shí)特異性良好，且擴(kuò)增效率高，可以快速地鑒定出同一密碼子的不同堿基的突變，也可以快速地鑒定出同一基因不同密碼子的突變。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102796811SQ201110139498
公開日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2011年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月26日
發(fā)明者王明 申請(qǐng)人:上海賽安生物醫(yī)藥科技有限公司