專利名稱：一種含有人胰島素基因的表達載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含有人胰島素基因的表達載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，特別是涉及一種含有人胰島素基因的表達載體及其構(gòu)建方法和利用該載體在油葵中制備人胰島素的方法。
背景技術(shù)：
近年來，糖尿病的發(fā)病率逐年升高，呈現(xiàn)流行勢態(tài)。糖尿病已成為世界上許多國家的常見病和多發(fā)病。世界衛(wèi)生組織的近期數(shù)字指出，全世界每年約有320萬人死于糖尿病， 即每分鐘6個人。在糖尿病用藥中，胰島素是最有效的治療藥物之一，也是I型糖尿病患者唯一的治療藥物。此外，還有30% 40%的II型糖尿病患者最終需要使用胰島素。目前，全球胰島素市場基本由諾和諾德公司、禮來公司和賽諾菲-安萬特公司所壟斷。三大巨頭都采用微生物發(fā)酵的方法生產(chǎn)人胰島素類產(chǎn)品，但利用微生物發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)有其局限性，如成本高，難以擴大再生產(chǎn)。相比之下，植物生物反應(yīng)器就凸顯出其特有的優(yōu)勢成本低廉，且易于規(guī)?；a(chǎn)。利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)具有醫(yī)用和商業(yè)價值的外源蛋白質(zhì)，特別是用于醫(yī)療和診斷的藥用蛋白，在近年來受到人們的廣泛關(guān)注。利用植物種子表達目的蛋白，再將種子經(jīng)粉碎 —液體抽提一離心處理一回收上層油相即可將融合蛋白與細胞內(nèi)其它組分分開，再經(jīng)進一步純化獲得目的蛋白。這樣大大簡化了目的蛋白的提取純化過程，克服了目前微生物表達系統(tǒng)難以規(guī)模化生產(chǎn)、安全性差的困難，并且大幅度降低了生產(chǎn)成本，表達具有高保真性， 是生物工程制藥領(lǐng)域中的一場重要革命。在國內(nèi)，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院利用轉(zhuǎn)基因工程技術(shù)將一種新型鮭魚降鈣素類似物成功地在油菜和棉花種子中進行了表達，獲得了轉(zhuǎn)基因植株和株系。目前，加拿大賽姆生物系統(tǒng)遺傳公司已率先開展了在轉(zhuǎn)基因紅花中生產(chǎn)胰島素的研究，把嵌合核酸構(gòu)建體導(dǎo)入紅花中，在種子中表達胰島素。該項研究已經(jīng)完成了全部的臨床前工作，并獲得FDA注冊。已在英國申請了 I期和II期臨床試驗。但是紅花植物其種子體積較小，整株植物含油率較低，導(dǎo)致最終產(chǎn)物蛋白的量少，成本高。因此，現(xiàn)有技術(shù)仍然需要一種方法穩(wěn)定、產(chǎn)率高、成本低、步驟簡單的制備胰島素的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的申請人通過長期研究，付出大量的創(chuàng)造性勞動，通過構(gòu)建一種含有人胰島素基因的特異型的表達載體，并選擇油葵作為生物反應(yīng)器，穩(wěn)定、高效地生產(chǎn)出人胰島素，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明涉及以重組DNA技術(shù)生產(chǎn)人胰島素的方法，特別涉及以油葵作為宿主生產(chǎn)人胰島素的方法。具體的說，本發(fā)明涉及利用花生油體蛋白與人胰島素的融合蛋白基因在油葵油體中表達從而可以大量生產(chǎn)制備治療糖尿病的重要藥物胰島素。首先，本發(fā)明提供了一種種子特異型表達載體，含有人胰島素與花生油體蛋白融合基因，其中，該載體的啟動子為油菜油體蛋白基因啟動子。以上載體用以在油葵中制備人胰島素。另外，本發(fā)明還提供了一種構(gòu)建上述種子特異型表達載體的方法，包括如下步驟1)分離克隆油菜油體蛋白基因啟動子和花生油體蛋白基因；2)按照植物偏愛的密碼子設(shè)計合成人胰島素基因；3)構(gòu)建以油菜油體蛋白基因啟動子驅(qū)動的花生油體蛋白與人胰島素融合基因的植物表達載體。具體步驟包括1)躺雄舊艦口靴艦艦用PCR方法自油菜 (Brassica campestris)基因組DNA中擴增20kD油體蛋白基因的啟動子，并將該啟動子克隆到pUC19 (購自MBI公司)上得到重組質(zhì)粒pUCN，以花生基因組DNA為模板PCR方法擴增終止密碼子缺失的花生油體蛋白基因。其中，油菜品種可以是目前現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)公開或使用的油菜品種，例如，可以是青油14品種、互豐101、耐寒高油王、早油100天和秦油2號等，優(yōu)選青油14品種。以上油菜油體蛋白啟動子可以克隆到PUC19的適合位點之間，優(yōu)選克隆到pUC19的HindIII和BamHI位點之間。所述的花生品種可以是目前現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)公開或使用的花生品種，例如，可以是冀花4號、冀油7號、白沙、魯花11、?；ê拓S花1號等，優(yōu)選冀花4號。2)桉照棺物偏愛的密碼子設(shè)計合成人胰島素基因，桉照油葵密碼子使用頻率優(yōu)化人胰島素合成基因，優(yōu)選優(yōu)化的基因為人胰島素基因，頻率小于10%的密碼子一律認為是稀有密碼子被排除，其余的各密碼子按油葵密碼子使用頻率優(yōu)化，并在基因的5’端添加了胰蛋白酶識別序列Klip27，構(gòu)建成klip27-insulin, 327bp。優(yōu)化前基因的分子量為201. 6， 優(yōu)化前后序列的一致性為大于60%，優(yōu)選大于65%，最優(yōu)選為73%，優(yōu)化后基因的分子量優(yōu)選為201.6。油葵密碼子使用頻率可參考http//www, kazusa. or. ip/codon/cRi-bin/ showcodon. cgi ？ species = 4232。
植物表達載體利用重疊PCR技術(shù)將花生油體蛋白基因和klip27-insUlin基因構(gòu)建成融合基因01e-klip27-insulin，將該融合基因連入pUCN得到重組質(zhì)粒pUCNOI，優(yōu)選連入的位點為pUCN的BamHI和&icl酶切位點之間，雙酶切重組質(zhì)粒pUCNOI，優(yōu)選HindIII和&icl雙酶切重組質(zhì)粒PUCN0I，回收1779bp的外源片段，并將該外源片段連入植物轉(zhuǎn)基因工程中常用的植物雙元表達載體PBI121的HindIII和McI位點之間獲得pBINOI，即油菜油體蛋白基因啟動子驅(qū)動的花生油體蛋白與人胰島素融合基因的植物表達載體。最后，本發(fā)明還提供了利用以上種子特異型植物表達載體制備人胰島素的方法， 包括如下步驟1)將上述構(gòu)建表達載體導(dǎo)入受體植物外植體內(nèi)；2)將上述受體植物材料培養(yǎng)為完整的植株，得到種子；3)從上述種子中分離純化得到人胰島素。
其中，所述的受體植物優(yōu)選為油葵。具體步驟包括1)將攜帶人胰島素基因的種子特異型植物表達載體導(dǎo)入油葵恢復(fù)系外植體。將種子特異型植物表達載體導(dǎo)入油葵恢復(fù)系的方法可以是本領(lǐng)域常規(guī)的導(dǎo)入方法，包括但不限于基因槍法、花粉管通道法、子房注射法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，優(yōu)選的是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法中，將攜帶人胰島素基因的種子特異型植物表達載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌，由農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化油葵恢復(fù)系外植體。所述外植體包括無菌苗莖尖、子葉、子葉節(jié)、去掉一片子葉的實生株四種形式，其中優(yōu)選去掉一片子葉的實生株；2)轉(zhuǎn)基因后獲得的再生植株經(jīng)抗性篩選得到抗性苗，待抗性苗生根后移栽入溫室進行培養(yǎng)，直至成熟收獲種子。其中，抗性苗生根后移栽入溫室進行蛭石和營養(yǎng)土混合物培養(yǎng)，在幼苗期進行PCR檢測和Southern blotting檢測，收獲籽粒后進行油體蛋白和人胰島素融合蛋白的Astern blotting檢測；3)將含人胰島素的種子在緩沖液中研磨，離心將油體和種子的其他成分分離，洗滌油體，通過酶切反應(yīng)將人胰島素自油體表面釋放，經(jīng)HPLC純化獲得人胰島素，并對其進行鑒定。在本發(fā)明的載體和方法中，選擇了油菜油體蛋白基因啟動子。經(jīng)實驗研究表明，該啟動子可大大提高人胰島素基因的表達效率。優(yōu)選地，在油體蛋白基因起始密碼子周圍還可以設(shè)計Kozak序列表達控制元件，可以更加進一步提高基因表達效率。在本發(fā)明的載體和方法中，還選擇了油體蛋白和人胰島素的融合表達。目的蛋白在轉(zhuǎn)基因植物中是以融合蛋白的形式與油體蛋白共同在油體中特異表達，利用油體親脂疏水的特性，將轉(zhuǎn)基因植物種子粉碎，液體抽提，離心處理，回收上層油相即可將融合蛋白與細胞內(nèi)其它組分分開，可去除90%以上的種子蛋白。優(yōu)選地，在油體蛋白和人胰島素之間設(shè)計了胰蛋白酶識別序列Klip27，用以從油體上釋放人胰島素，簡化了表達產(chǎn)物的純化工藝， 提高了純化效率。其中，優(yōu)選的油體蛋白為花生油體蛋白。花生油體蛋白和人胰島素的融合表達，表達效率高，效果好。本發(fā)明公開的載體和發(fā)方中，為了提高人胰島素基因的表達效率，根據(jù)人胰島素基因序列和油葵偏愛的密碼子、GC含量對人胰島素基因密碼子進行了優(yōu)化和全基因的人工合成。在本發(fā)明公開的人胰島素的生產(chǎn)方法中，優(yōu)選的植物生物反應(yīng)器為油葵。油葵作為我國一種重要的油料作物，在我國具有悠久的種植歷史，具有其它作物不可替代的優(yōu)勢。 油葵產(chǎn)量高，作為耐旱作物，可以在鹽堿地、干旱地區(qū)甚至沙漠等惡劣環(huán)境下種植，因此適于大面積推廣種植，不僅不會與糧食“爭地”，而且還有利于提高我國山嶺薄地、干旱貧瘠之地的利用率，緩解國家耕地緊張的壓力。因此，選擇油葵作為生物反應(yīng)器，大規(guī)模地生產(chǎn)人胰島素是適合我國國情的生產(chǎn)藥用蛋白的方式。最有優(yōu)勢的是，采用油葵作為生物反應(yīng)器， 與目前已作為人胰島素生產(chǎn)反應(yīng)器的大豆和紅花相比，具有顯著的生產(chǎn)效率提高，產(chǎn)率增加的效果。采用此發(fā)明方法生產(chǎn)人胰島素具有以下優(yōu)點1、植物表達的外源蛋白，類似于哺乳動物表達的蛋白，能夠進行正確的折疊，這對于必須具有體內(nèi)活性的藥用蛋白的生產(chǎn)尤為重要。
2、采用植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)的人胰島素更安全，因為避免了大腸桿菌中的內(nèi)毒素和動物病原菌的的污染。3、利用轉(zhuǎn)基因植物的油體表達系統(tǒng)表達人胰島素，大大簡化了純化工藝，降低了成本，有利于將來的產(chǎn)業(yè)化。較之已經(jīng)被kmBioSys Genetics公司采用的擬南芥以及紅花具有很大的優(yōu)勢。4、采用本發(fā)明的種子特異型植物表達載體和制備方法，大大提高了人胰島素的表達量，能達到種子總蛋白含量的1.3%。5、采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，不僅可以降低成本、提高轉(zhuǎn)化效率，還提高了轉(zhuǎn)基因植株的遺傳穩(wěn)定性。本發(fā)明是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)開發(fā)高效表達的植物生物反應(yīng)器，所生產(chǎn)人胰島素是治療糖尿病的特效藥物。除有特殊說明，在本發(fā)明中出現(xiàn)術(shù)語均具有本領(lǐng)域通常的含義，其中的縮寫代表的內(nèi)容如下pUC19 (購自MBI公司)常用的大腸桿菌克隆載體pBI121 植物轉(zhuǎn)基因工程中常用的植物雙元表達載體pUCN 攜帶油菜油體蛋白基因啟動子(NOP)的pUC19載體，插入位點HindIII和 BamHI01eosin-klip27-insulin 花生油體蛋白、klip27和人胰島素融合基因pUCNOI 攜帶油菜油體蛋白基因啟動子(NOP)驅(qū)動的花生油體蛋白、klip27和人胰島素融合基因的PUC19載體，插入位點HindIII和McIpBINOI攜帶油菜油體蛋白基因啟動子(NOP)驅(qū)動的花生油體蛋白、klip27和人胰島素融合基因的PBI121載體，插入位點HindIII和McI


圖1種子特異型植物表達載體pBINOI結(jié)構(gòu)示意圖；圖2種子特異型植物表達載體pBINOI構(gòu)建流程示意圖；圖3pUCN載體的酶切鑒定及PCR檢測；圖 401eosin-klip27-insulin 融合基因的構(gòu)建；圖5pUCN0I載體的酶切鑒定；圖6種子特異型植物表達載體pBINOI的酶切鑒定；圖7轉(zhuǎn)基因油葵nptll基因的PCR檢測；圖8轉(zhuǎn)基因油葵的01eOSin-klip27-inSulin融合基因的PCR檢測；圖9轉(zhuǎn)基因油葵PCR-Southern雜交結(jié)果；圖10轉(zhuǎn)基因油葵籽粒油體中油體蛋白-人胰島素融合蛋白的Western檢測；圖11油葵作為生物反應(yīng)器和紅花作為生物反應(yīng)器制備人胰島素的比較
具體實施例方式以下具體實施方式
僅是對于本發(fā)明進行進一步說明，并不用于限定本發(fā)明的范圍。在了解本發(fā)明的內(nèi)容后，本領(lǐng)域技術(shù)人員在不背離本發(fā)明精神的前提下對本發(fā)明進行
6改變，這些技術(shù)方案均落在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。除有特殊說明外，下列實施例中所述的方法均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。實施例1 種子特異型棺物表汰載體本發(fā)明中首先采用PCR方法擴增了油菜油體蛋白基因啟動子(NOP)，將該啟動子插入pUC19的HindIII和BamHI酶切位點之間得到pUCN。同時依據(jù)人胰島素基因序列和油葵偏愛的密碼子設(shè)計并人工合成了人胰島素基因，并將該合成的基因插入花生油體蛋白基因(Ole)的3’末端，獲得花生油體蛋白和人胰島素融合基因，同時在花生油體蛋白基因和人胰島素基因之間添加了胰蛋白酶識別序列Klip27。進而將該融合基因插入pUCN的BamHI 和Mel酶切位點之間得到pUCNOI，HindIII和&icl雙酶切pUCNOI，瓊脂糖凝膠回收1779bp 的外源片段，并將該外源片段插入植物雙元表達載體PBI121的HindIII和McI酶切位點之間，獲得本發(fā)明提供的植物表達載體pBINOI，pBINOI的表達盒為以油菜油體蛋白基因啟動子(NOP)驅(qū)動的01e-Klip27-insulin融合基因，pBINOI結(jié)構(gòu)如圖1所示，1 油菜油體蛋白基因啟動子，2 花生油體蛋白基因，3 :KLIP-27，4 人胰島素基因。將pBINOI進行測序獲得表達盒的序列，長度為1779bp。t施例2 種子特異型棺物表汰裁彳本DBINOI的構(gòu)律植物表達載體pBINOI構(gòu)建流程如圖2所示，具體步驟如下油菜油體蛋白基因啟動子的克隆，油菜是重要的油料作物，含油量高02 45% )，而且油菜油體中20kD油體蛋白的量為MkD油體蛋白量的10倍。根據(jù)油菜油體蛋白啟動子核苷酸序列(Genbank No. AF134411)設(shè)計正向引物pBINOI-1 :CCC AAG CTT TTC AAC GTGGTC GGA TCA TGA CG (SEQ ID NO :1)和反向引物 pBINOI-2 CGC-GGA TCC GAA TTGAGA GAG ATC GAA GAG (SEQ ID NO :2)，用于PCR擴增油菜20kD油體蛋白基因的啟動子，在引物上分別引入了 HindIII和BamHI酶切位點(下劃線表示酶切位點)，以油菜 (Brassicacampestris)品種青油14基因組DNA為模板，以ρΒΙΝΟΙ-l和pBINOI-2為引物， PCR 的條件為:94°C lmin、63-73°C lmin、68°C lmin，30 個循環(huán)后，68°C延伸 lOmin，擴增油菜油體蛋白基因啟動子。瓊脂糖凝膠電泳并回收擴增產(chǎn)物，進而用HindIII和BamHI雙酶切， 瓊脂糖凝膠電泳回收所得產(chǎn)物，并將其與HindIII和BamHI雙酶切的pUC19連接，將連接產(chǎn)物與200 μ L DH5 α感受態(tài)細胞(購自天根生化科技(北京)有限公司)混勻，冰浴30min， 42°C熱擊1. 5min,冰浴3min，加入800 μ L LB培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)45min，涂布含50 μ g/mL氨芐青霉素的LB平板，37°C培養(yǎng)過夜。PCR方法篩選轉(zhuǎn)化子，pBINOI-1和pBIN0I-2為引物， PCR 的條件為94°C lmin,60-73 °C lmin,72 °C lmin，30 個循環(huán)后，72 °C 延伸 IOminJfPCR 產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳檢測篩選結(jié)果，將陽性轉(zhuǎn)化子命名為PUCN，將陽性轉(zhuǎn)化子進行液體震蕩培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒進行HindIII單酶切鑒定和Hindlll、BamHI雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳顯示鑒定結(jié)果如圖 3 所示，M :DNA Molecular Weight Marker λ DNA/EcoT14I, Ll Hindlll酶切pUCN質(zhì)粒的產(chǎn)物為356^p的片段，L2 =HindIII和BamHI雙酶切pUCN質(zhì)粒的產(chǎn)物為2662bp的載體片段和90!3bp的啟動子，L3 :PCR檢測pUCN質(zhì)粒得到90!3bp的啟動子。將pUCN質(zhì)粒進行測序，測序步驟如下(1)以pUCN為模板，PUC19通用測序引物進行 PCR反應(yīng)，得到PCR產(chǎn)物；(2)純化PCR產(chǎn)物，以去除酶、熒光染料、引物和其他離子；(3)純化后的PCR產(chǎn)物經(jīng)變性和冰浴處理后上3730測序儀(ABI公司)進行測序；(4)儀器自動分析并打印出彩色測序圖譜和DNA序列。pUCN中外源片段長度為90!3bp，序列如SEQ ID N0:3所示，分子量為556. 7kDa。酶切結(jié)果和測序結(jié)果表明已將油菜油體蛋白基因啟動子成功克隆到PUC19上。人胰島素的人工合成，依據(jù)人胰島素基因序列(SEQ ID NO :4，ABI63346. 1)，氨基酸序列如SEQ ID NO 5所示，同時參照油葵密碼子使用頻率http://www, kazusa. or. ip/ codon/cgi-bin/showcodon. cgi ？ species = 4232設(shè)計優(yōu)化人胰島素合成基因，并在基因的5’端添加了胰蛋白酶識別序列(Klip27)，核苷酸序列如SEQ ID NO :6所示，氨基酸序列為SEQ ID NO 7所示(klip27-insulin的核苷酸序列如SEQ ID NO 8所示，327bp，分子量為201. 6，氨基酸序列如SEQ ID NO 9所示，分子量為11. 752kDa)經(jīng)密碼子優(yōu)化并人工合成后的klip 27-insulin基因核苷酸序列如SEQ ID NO 10所示，分子量為201. 6，密碼子優(yōu)化前后基因的一致性為73%。01eosin-klip27-insulin融合蛋白基因的擴增，依據(jù)花生油體蛋白基因序列 (Genbank No. AF325917)和 klip27_insulin 基因序列(SEQ ID NO 10)設(shè)計了兩對特異性引物 pBIN0I-3/pBIN0I-4 和 pBIN0I-5/pBIN0I-6(分別如 SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ IDNO 13, SEQ ID NO 14)pBINOI-3 和 pBINOI-6 中分別引入 BamHI 和 SacI 酶切位點 (帶下劃線的堿基為酶切位點)，且pBINOI-3引物中在油體蛋白基因起始密碼子周圍設(shè)計了 Kozak序列(序列中加粗部分，功能是提高轉(zhuǎn)錄和表達效率)；pBINOI-4和pBIN0I_5互為反向互補序列。pBINOI-3 :CGC GGA TCC AGC AAA GCC GCC ACCATGGCT ACT GCT ACT GAT CGpBINOI-4 :AGG CTG AAA TTT AGA CGA TGA TGA TGA CCT CTT AACpBINOI-5 :GTT AAG AGG TCA TCA TCA TCG TCT AAA TTT CAG CCTpBINOI-6 :C GAG CTC TTA GTT GCA GTA ATT TTC TAG以pBIN0I-3/pBIN0I_4為引物，花生(品種冀花4號)基因組DNA為模板擴增終止密碼子缺失的花生油體蛋白基因，PCR的條件為94°C lmin、56-60°C lmin、68°C lmin， 30 個循環(huán)后，68°C延伸 IOmin ；以 ρΒΙΝ0Ι_5/ρΒΙΝ0Ι_6 為引物，優(yōu)化后的 klip27_insulin 基因為模板擴增 klip27-insulin 基因，PCR 的條件為94°C lmin,55-73°C lmin,68°C lmin，30個循環(huán)后，68°C延伸IOmin ；瓊脂糖凝膠電泳并回收兩種PCR產(chǎn)物合并作為模板，以 pBIN0I-3/pBIN0I-6 為引物進行重疊PCR，獲得 01esin-klip27-insulin 融合基因(PCR 的條件為:94°C lmin、68. 5°C lmin、68°C lmin，30個循環(huán)后，68°C延伸IOmin)，瓊脂糖凝膠電泳并回收擴增產(chǎn)物獲得01eosin-klip27-insulin融合基因。01eosin-klip27_insulin融合基因的構(gòu)建如圖4所示，M :DNA Molecular Weight Marker DL2000，L1 :pBIN0I-3/pBIN0I_4 為引物，花生(品種冀花4號)基因組DNA為模板擴增終止密碼子缺失的花生油體蛋白基因528bp的片段，L2 以pBIN0I-5/pBIN0I-6為引物，優(yōu)化后的klip27-insulin基因為模板擴增klip27-insulin基因327bp，L3 以pBIN0I-3/pBIN0I_6為引物進行重疊PCR，獲得的 01eosin-klip27-insulin 融合基因 855bp。將 01eosin-klip27_insulin 融合基因進行測序，測序結(jié)果如SEQ ID NO :15所示，長85^ρ，分子量527. IkDa0預(yù)測的氨基酸序列如SEQ ID NO 16所示，由沘4個氨基酸殘基組成，分子量30. 161kDa。01eosin-klip27_insulin融合基因的構(gòu)建結(jié)果和測序結(jié)果表明已得到01eosin-klip27-insulin融合基因。中間載體pUCNOI的構(gòu)建，將01eosin-klip27-insulin融合基因進行BamHI和 McI雙酶切后與同樣雙酶切的pUCN連接，將連接產(chǎn)物與200 μ LDH5 α感受態(tài)細胞(購自天根生化科技(北京)有限公司)混勻，冰浴30min, 42°C熱擊1. 5min,冰浴3min,加入800 μ L LB培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)45min，涂布含50 μ g/mL氨芐霉素的LB平板，37 °C培養(yǎng)過夜。PCR方法篩選轉(zhuǎn)化子，pBINOI-3和pBINOI-6為引物，PCR的條件為-MV lmin,60-73°C Imin, 720C 1. 5min, 30個循環(huán)后，72°C延伸lOmin，將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳檢測篩選結(jié)果，將陽性轉(zhuǎn)化子命名為PUCNOI，將陽性轉(zhuǎn)化子進行液體震蕩培養(yǎng)，堿裂解法提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒進行HindIII單酶切鑒定、HindIII和BamHI雙酶切鑒定以及BamHI和&icl雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳顯示鑒定結(jié)果如圖5所示，M :DNA Molecular Weight Marker λ DNA/EcoT 141, Ll =HindIII酶切pUCNOI質(zhì)粒的產(chǎn)物為442^3ρ的片段，L2 =HindIII和SacI雙酶切pUCNOI 質(zhì)粒的產(chǎn)物為2647bp的載體片段和1799bp的外源片段(包含油菜油體蛋白基因啟動子和 01eosin-klip27-insulin 融合基因)L3 =BamHI 和 SacI 雙酶切 pUCNOI 質(zhì)粒的產(chǎn)物為!3571bp 的載體片段和85^p的外源片段(01eosin-klip27-insulin融合基因)。將pUCNOI質(zhì)粒進行測序，測序結(jié)果SEQ ID N0:17。全長1779bp，分子量1096. 8kDa。，包括油菜油體蛋白基因啟動子和01eosin-klip27-insulin融合基因。酶切結(jié)果(如圖5所示)和測序結(jié)果 (如序列表中SEQ ID N0:17所示)表明已獲得了油菜油體蛋白基因啟動子驅(qū)動的花生油體蛋白與人胰每素融合基因的表達盒，并已將該表達盒成功克隆到載體PUC19上。種子特異型植物表達載體pBINOI的構(gòu)建，堿裂解法提取pUCNOI質(zhì)粒DNA，用 HindIII和SacI雙酶切，回收1779bp的外源片段，將其與經(jīng)HindIII和SacI雙酶切的 PBI121連接，將連接產(chǎn)物與200yL DH5 α感受態(tài)細胞(購自天根生化科技(北京)有限公司)混勻，冰浴30min，42°C熱擊1. 5min，冰浴3min，加入800 μ L LB培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)45min， 涂布含100 μ g/mL卡那霉素的LB平板，37 °C培養(yǎng)過夜。PCR方法篩選轉(zhuǎn)化子，pBIN0I-l 和 pBINOI-6 為引物，PCR 的條件為:94V lmin、60_73°C lmin、72°C 1. 5min，30 個循環(huán)后， 72°C延伸lOmin，將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳檢測篩選結(jié)果，將陽性轉(zhuǎn)化子命名為pBINOI， 將陽性轉(zhuǎn)化子進行液體震蕩培養(yǎng)，堿裂解法提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒進行HindIII單酶切鑒定以及HindIII和Mel雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳顯示鑒定結(jié)果如圖6，M =DNA Molecular Weight Marker λ DNA/EcoT 141, Ll =HindIII 酶切 pBINOI 質(zhì)粒的產(chǎn)物為 13782bp 的片段， L2 =HindIII和&icl雙酶切pBINOI質(zhì)粒的產(chǎn)物為12003bp的載體片段和1779bp的外源片段(包含油菜油體蛋白基因啟動子和01eosin-klip27-insulin融合基因)。將pBINOI質(zhì)粒進行測序，測序結(jié)果SEQ IDNO 17，整個表達盒長1779bp，分子量為1096. 8kDa，包括油菜油體蛋白基因啟動子和01eosin-klip27-insulin融合基因。載體的全長核苷酸序列如SEQ ID N0:18所示。油菜油體蛋白基因啟動子是種子特異型的強啟動子，在轉(zhuǎn)基因植物的種子中驅(qū)動人胰島素以融合蛋白的形式與花生油體蛋白共同在油體中特異表達，花生油體蛋白攜帶人胰島素錨定在油體表面。利用油體親脂疏水的特性，將轉(zhuǎn)基因植物種子粉碎，液體抽提，離心處理，回收上層油相即可將融合蛋白與細胞內(nèi)其它組分分開，可去除90%以上的種子蛋白。并在花生油體蛋白和人胰島素之間設(shè)計了胰蛋白酶酶切位點，用以從油體上釋放人胰島素。實施例3 利用該載體制備人胰島素3. 1上述構(gòu)建的種子特異型表達載體導(dǎo)入受體植物外植體內(nèi)；3. 1. 1農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的制備(1)挑取根癌農(nóng)桿菌LBA4404單菌落于3mL的YEB液體培養(yǎng)基(含鏈霉素Sm125mg/L)中，28°C振蕩培養(yǎng)過夜；(2)取過夜培養(yǎng)菌液500 μ L接種于50mL YEB (Sm 125mg/L)液體培養(yǎng)基中，2g°C振蕩培養(yǎng)至OD6tltl為0. 5 ；(3) 5，OOOrpm,離心 5min ；(4)加 IOmL 0. 15M NaCl 懸浮農(nóng)桿菌細胞，5，OOOrpm,離心 5min ；(5) ImL預(yù)冷的20mM CaCl2懸浮細胞，冰浴，24h內(nèi)使用，或分裝成每管200 μ L，液氮中速凍Imin，置_70°C保存?zhèn)溆谩?. 1. 2種子特異型植物表達載體向農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化取200 μ L感受態(tài)細胞，加入Iyg構(gòu)建好的質(zhì)粒DNA，液氮中速凍lmin，37°C水浴 5min,然后加入ImLYEB培養(yǎng)基，慢速振蕩培養(yǎng)4h ；1, OOOrpm離心30sec，棄上清，加入 0. ImLYEB培養(yǎng)基重新懸浮細胞，涂布于含有100mg/L Kan和125mg/L Sm的YEB平板上，28°C 培養(yǎng)約4他。陽件克降的鑒定挑取平板上長出的單菌落，接種于YEB液體培養(yǎng)液(含有100mg/L Kan和125mg/ L Sm)中，28°C振蕩培養(yǎng)過夜；堿裂解法小量提取質(zhì)粒DNA，以質(zhì)粒DNA為模板，pBINOI-1和 pBINOI-6 為引物，進行 PCR擴增鑒定，PCR 的條件為-MV lmin、60_73°C lmin、72°C 1. 5min， 30個循環(huán)后，72°C延伸lOmin，將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳檢測篩選結(jié)果獲得陽性轉(zhuǎn)化子。用于轉(zhuǎn)化油葵的農(nóng)桿菌菌液的準備從平板上挑取含pBINOI質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單菌落，接種到5mLYEB液體培養(yǎng)基中(含有100mg/L Kan和125mg/L Sm)，振蕩培養(yǎng)過夜，取ImL菌液接種到100_200mL YEB液體培養(yǎng)基(含有100mg/L Kan和125mg/LSm)中，劇烈振蕩培養(yǎng)至OD600為0. 4 0. 8，3500rpm 離心lOmin，菌體用MS (不含植物生長調(diào)節(jié)劑和抗生素)液體培養(yǎng)基重懸，使0D_為0. 6左右，以進行侵染。3. 1. 3農(nóng)桿菌介導(dǎo)的油葵外植體的遺傳轉(zhuǎn)化將發(fā)芽3 4d的油葵種子實生幼苗的莖尖、子葉、子葉節(jié)和去掉一片子葉的實生株四種形式的外植體，在上述農(nóng)桿菌菌液中浸泡6 8min，轉(zhuǎn)至MS固體培養(yǎng)基上共培養(yǎng) 3d(25°C黑暗)。其中優(yōu)選的方式是去掉一片子葉的實生株。3. 2將上述受體植物材料培養(yǎng)為完整的植株，得到種子并進行目的基因和蛋白的檢測；3. 2. 1受體植物材料培養(yǎng)為完整的植株，得到種子將上述轉(zhuǎn)化過的外植體到含頭孢霉素300mg/L的MS培養(yǎng)基上繼續(xù)進行培養(yǎng)，約 7d后，轉(zhuǎn)至MS含頭孢霉素300mg/L和卡那霉素70mg/L的抗性篩選培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng)， 每15 20d更換培養(yǎng)基，篩選三次后獲得抗性芽，將2 3厘米抗性芽轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基 MS2 (MS+IBA0. lmg/L+Kan 70mg/L+cef 300mg/L)，待抗性苗生根后移栽入溫室進行蛭石和營養(yǎng)土混合物培養(yǎng)，直至成熟收獲種子。3.2.2目的基因和蛋白的檢測在幼苗期對油體蛋白和人胰島素融合基因進行PCR檢測和E^-Southern blotting檢測，收獲籽粒后對油體蛋白和人胰島素融合蛋白進行Western blotting檢測。轉(zhuǎn)基因油葵幼苗的PCR檢測和PCR-Southern blotting檢測
采用SDS法提取抗性油葵幼苗幼嫩真葉的基因組DNA作為模板，以nptIIF/ nptnR和pBIN0I-3/pBIN0I-6兩對引物進行PCR擴增檢測，引物序列分別為nptIIF =ATG AAC TGCAGG ACG AGG(SEQ ID NO 19)nptIIR :GCG ATA CCG TAA AGC ACG(SEQ ID NO :20) nptllF/nptUR 和 pBIN0I_3/pBIN0I_6 的 PCR 擴增的條件均為為94°C lmin、60°C lmin、 72°C lmin, 30個循環(huán)后，72°C延伸lOmin，分別擴增出預(yù)期為567bp的片段(部分nptll基因)和855bp的01e-klip27-insulin融合基因片段。結(jié)果如圖7和圖8所示。圖7中，M DNAMolecularffeight Marker DL2000，L1_L3 :nptIIF/nptnR為引物，以自卡那抗性的油葵所提基因組DNA為模板擴增出567bp的片段，即為抗性植株。L4 φΒΙΝΟΙ作模板進行PCR 作為陽性對照，增出567bp的片段。L5 以自非抗性油葵所提基因組DNA為模板作為陰性對照。圖 8 中，M =DNA Molecular Weight Marker DL2000, L1-L3 :pBIN0I-3/pBIN0I_6 為引物，以自卡那抗性的油葵所提基因組DNA為模板擴增出855bp的片段，即為陽性植株L4 以 PBINOI作模板進行PCR作為陽性對照，增出的片段。L5 以自非抗性油葵所提基因組DNA為模板作為陰性對照。PCR-Southern blotting 檢泖丨1)采用SDS法提取nptll和01eOSin-klip27-inSulin均為陽性的轉(zhuǎn)基因油葵幼苗真葉的基因組DNA，以pBIN0I-3/pBIN0I-6為引物對基因組DNA進行PCR擴增。PCR反應(yīng)條件為 94°C lmin、60°C lmin、72°C lmin，30 個循環(huán)后，72°C延伸 lOmin。2)將PCR產(chǎn)物從凝膠轉(zhuǎn)移至尼龍膜，電泳完畢，進行變性、中和后，進行半干轉(zhuǎn)膜， 將膜晾干，真空80°C干烤1. 2hrs。3) DNA探針標(biāo)記回收pBINOI質(zhì)粒的BamHI和SacI雙酶切片段，取3 μ gDNA用于標(biāo)記4)雜交63°C預(yù)雜交膜30minS，63°C雜交過夜，用充足的2XSSC，0. SDS洗膜2次；用預(yù)熱到65°C的0. 5 X SSC, 0. 1% SDS條件下洗膜2次。5)檢測雜交和洗過的膜用沖洗緩沖液沖洗，簡單淋洗一次；在IOOmL封閉液中浸泡 30min ；在20mL抗體溶液中浸泡30min ；用IOOmL沖洗緩沖液沖洗2次，各15min ；在 20mL檢測緩沖液中平衡2-5min ；將膜的DNA面向上放到雜交袋中，加入ImLCSPD ；37 °C 溫浴濕潤的膜lOmin，以使化學(xué)熒光充分反應(yīng)；在X光片上室溫曝光。結(jié)果如圖9所示，M :DL2000, L1-L3 以PCR檢測陽性植株基因組為模板以pBIN0I-3/pBIN0I-6為引物擴增產(chǎn)物的Southern blotting結(jié)果，0. 851Λ處顯示雜交信號，與預(yù)期結(jié)果一致，表明 01eosin-klip27-insulin融合基因已經(jīng)整合到油葵基因組中，L4 以pBINOI作模板進行 PCR產(chǎn)物作為陽性對照，L5 以自非抗性油葵所提基因組DNA為模板作為陰性對照。轉(zhuǎn)基因油葵籽粒中油體蛋白和人胰島素融合蛋白的Western blottim 檢測將轉(zhuǎn)基因油葵籽粒子5V研磨緩沖液(50mM Tris-HCl pH 7. 5,0. 4M sucrose, 0.5M NaCl)中研磨，離心IOXg 30min，分為三部分，取油相，重新懸浮于等體積的研磨緩沖液中，混勻，輕輕加入5V預(yù)冷的50mM Tris-HCl pH 7. 5緩沖液，離心10 X g 30min，取油相。將上述過程重復(fù)2次，用以進一步去除剩余的水溶性成分和不溶性成分，得到純凈的油體(油體的成分包括中性脂類磷脂、油體蛋白)。在油體中加入2V乙醚，離心，中性脂
11類留在了上層乙醚相中，磷脂在下層的水相中，取中間的蛋白層，以0. IM的蔗糖緩沖液重懸，加入氯仿甲醇O 1)混合物，抽提兩次，取中間蛋白層，乙醚抽提一次，溶于無菌水中， 進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜后用山羊抗兔人胰島素的多克隆抗體進行Western blotting分析。結(jié)果如圖10所示，M 蛋白分子量標(biāo)準，Ll 為自轉(zhuǎn)基因油葵的種子中提取的油體蛋白，有胰島素的表達，表達產(chǎn)物大小約為30kDa，與預(yù)期的大小一致(花生油體蛋白18. 4kDa+01eosin-klip27-insulin 11. 7kDa)L2 非轉(zhuǎn)基因油葵對照。胰島素表達量占種子總蛋白的1.3%，超過了重組藥物蛋白在植物中表達的最低商業(yè)化要求(1%)，因此利用植物油體表達系統(tǒng)來實現(xiàn)胰島素的產(chǎn)業(yè)化，具有可行性和廣闊的應(yīng)用前景。3. 3從上述種子中分離純化得到人胰島素。第一步將油體與種子中的其它成分分開將種仁于5V研磨緩沖液(50mMTris-HCl pH 7. 5，0. 4M蔗糖，0. 5M NaCl)中研磨， 離心(10Xg)30min，分為三部分最底部是不可溶沉淀(籽殼、纖維質(zhì)材料、不溶糖、蛋白質(zhì)和其它不溶性污物)，中間是水相，內(nèi)含可溶的細胞成分(儲藏蛋白)，最上層是油體和與之結(jié)合的油體蛋白。第二步洗滌油體取第一步所得油相，重新懸浮于等體積的研磨緩沖液中，混勻，加入5V預(yù)冷的 50mMTris-HCl pH 7. 5緩沖液，離心(10 X g) 30min，取油相。將上述過程重復(fù)2次，用以進一步去除剩余的水溶性成分和不溶性成分，洗滌過的油體重懸于等體積預(yù)冷的50mM Tris HCl pH7. 5中，這樣所得的油體是基本純凈的油體制品，僅存的蛋白質(zhì)是油體蛋白。第三步酶切反應(yīng)釋放人胰島素用胰蛋白酶酶切緩沖液洗滌油體兩次，加入適量的胰蛋白酶，37°C過夜，離心，人胰島素存在于水相中。第四步HPLC純化人胰島素上反相色譜柱C18(5y，0. 24*25cm)，紫外波長214nm，緩沖液々(10%乙腈0. 1%H 氟乙酸)平衡柱子，將上一步所得水相上樣，對柱子施以19min緩沖液8(5-50%乙腈0. 1% 三氟乙酸)線性梯度洗脫，得人胰島素，純度高于99. 8%。^MM 4勿反應(yīng)器禾Π禾Π紅勿反應(yīng)器泡丨備人B夷島素的產(chǎn)率比較取相同質(zhì)量QSOmg)的轉(zhuǎn)人胰島素基因的油葵種子和紅花種子，依據(jù)實施例3分離純化獲得人胰島素，上樣量為所得總量的十分之一，進行Western blotting檢測，結(jié)果如圖11所示，M 蛋白分子量標(biāo)準，Ll 自轉(zhuǎn)基因油葵純化的胰島素，大小為5. 7kDa,與預(yù)期大小一致，定量為60ng。L2 自轉(zhuǎn)基因紅花純化的人胰島素，大小為5. 7kDa,與預(yù)期大小一致， 定量為50ng，由此推算Ikg轉(zhuǎn)基因油葵種子可獲得0. 996g胰島素，同等條件下Ikg轉(zhuǎn)基因紅花種子可獲得0825g胰島素。而且油葵的畝產(chǎn)量約250kg.紅花的畝產(chǎn)量約200公斤， 無論是從種子胰島素產(chǎn)率還是單位面積種植作物的胰島素的產(chǎn)量來看，油葵都要優(yōu)先于紅花。
權(quán)利要求
1.一種表達載體，含有人胰島素與花生油體蛋白融合基因，其中啟動子為油菜油體蛋白基因啟動子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的載體，其具有SEQID N0:17所示序列。
3.一種構(gòu)建權(quán)利要求1所述的表達載體的方法，其包括如下步驟1)分離克隆油菜油體蛋白基因啟動子和花生油體蛋白基因。2)按照植物偏愛的密碼子設(shè)計合成人胰島素基因，其特征是按照油葵偏愛的密碼子優(yōu)化人胰島素基因。3)構(gòu)建以油菜油體蛋白基因啟動子驅(qū)動的花生油體蛋白與人胰島素融合基因植物表達載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中的油菜油體蛋白啟動子可以克隆到pUC19的HindIII 和BamHI位點之間。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，在步驟( 中將頻率小于10%的密碼子一律認為是稀有密碼子被排除，其余的各密碼子按油葵密碼子使用頻率優(yōu)化。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，優(yōu)化前后的一致性大于60%。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，優(yōu)化前后的一致性為73%。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，在步驟(3)中利用重疊PCR技術(shù)將花生油體蛋白基因和人胰島素基因構(gòu)建成融合基因Ole-klip 27-insulin，將該融合基因連入pUCN得到重組質(zhì)粒 pUCNOI，優(yōu)選連入的位點為pUCN的BamHI和&icl酶切位點之間，雙酶切重組質(zhì)粒pUCNOI， 優(yōu)選HindIII和Mel雙酶切重組質(zhì)粒pUCNOI，回收1779bp的外源片段，并將該外源片段連入植物表達載體的HindIII和Mel位點之間。
9.一種制備人胰島素的方法，其包括如下步驟1)將權(quán)利要求1或2所述表達載體導(dǎo)入受體植物外植體內(nèi)；2)將上述受體植物材料培養(yǎng)為完整的植株，得到種子；3)從上述種子中分離純化得到人胰島素。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中受體植物為油葵。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述方法，其中所述油葵種子為卡那霉素抗性表型。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，所制備的是人胰島素。
13.根據(jù)權(quán)利要求9所述方法，其中步驟1)中的導(dǎo)入方法為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化。
14.根據(jù)權(quán)利要求9所述方法，其中所述純化方法為高效液相色譜法。
15.根據(jù)權(quán)利要求9所述方法，其中的分離純化方法包括將含人胰島素的種子在緩沖液中研磨，離心將油體和種子的其他成分分離，洗滌油體，通過酶切反應(yīng)將人胰島素自油體表面釋放，經(jīng)HPLC純化獲得人胰島素。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種含有人胰島素基因的表達載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，主要是在植物雙元表達載體pBI121的限制性內(nèi)切酶酶切位點HindIII和SacI的之間插入以油菜油體蛋白基因啟動子驅(qū)動的花生油體蛋白基因-人胰島素基因組成的融合蛋白表達盒，得到發(fā)明中所述的植物表達載體pBINOI。另外，提供了一種利用該表達載體轉(zhuǎn)化油葵構(gòu)建植物生物反應(yīng)器制備人胰島素的方法，該方法不僅可以提高人胰島素的產(chǎn)率，而且大大降低生產(chǎn)成本，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12N15/62GK102268451SQ201110142310
公開日2011年12月7日 申請日期2011年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月1日
發(fā)明者于成鋼, 劉培, 盧海剛, 安勝軍, 李雪, 柴錫慶, 溫昕, 焦展, 王崑聲, 胡良元, 許海民, 邵鐵梅 申請人:安勝軍, 柴錫慶, 王崑聲