專利名稱：檢測皮膚活性物質(zhì)的檢測試劑盒和檢測皮膚活性物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種皮膚活性物質(zhì)檢測用試劑盒及利用該試劑盒檢測皮膚活性物質(zhì)的方法，具體地，涉及利用含有以長壽基因著稱的klotho基因的檢測試劑盒，從皮膚細胞中將誘導klotho基因表達的候選物質(zhì)分離、精制，從而檢測抗衰老及美白物質(zhì)等皮膚活性物質(zhì)的皮膚活性物質(zhì)檢測用試劑盒及利用該試劑盒檢測皮膚活性物質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
皮膚隨著年齡的增長或者暴露在太陽光下而老化。隨著老化，表皮的角質(zhì)層脫落并更新所需要的時間延長，角質(zhì)層增厚，真皮由于彈力纖維和保濕成分的含量下降或排列變化而產(chǎn)生皺紋。迄今為止，為了阻斷引起皮膚衰老的原因中的一種光老化，人們對預防紫外線照射引起的皮膚變化進行了各種研究。另外，人們還研究了防止隨著年齡增長的老化， 即由遺傳調(diào)節(jié)的老化的各種方法。這些研究都集中在尋找統(tǒng)籌調(diào)節(jié)老化的機制上。對klotho基因的研究就是其中之一。敲除(knock-out)klotho基因的小鼠出現(xiàn)伴隨1，25-(0H)2D3濃度上升出現(xiàn)動脈硬化、血管鈣化、管組織鈣化、肺氣腫、活動減退、生殖腺形成異常、不孕、皮膚萎縮、運動失調(diào)癥、低血糖癥及高磷酸血癥(Mutation of the mouse klotho gene leads to a syndrome resembling ageing. Nature 1997 ;390,45-51)。與此相反，klotho蛋白的表達增加時，出現(xiàn)壽命增加、胰島素抗性增加及IGF-I抗性增加 (Kurosu等，200 。在人體中，也有報道稱klotho蛋白的單核酸多態(tài)性與壽命減少、骨質(zhì)疏松、中風及冠狀動脈疾病有關(guān)(Arking等，2002 ；Kawano等，2002 ；Mullin等，2005 ；Ogata 等，2002 ；Yamada 等，2005)。根據(jù)之前的研究，klotho主要在人的腎臟表達，在胎盤、前列腺及小腸中也有表達。但在klotho越來越重要的情況下，迄今為止未見klotho在皮膚細胞，即角質(zhì)形成細胞、 成纖維細胞或黑色素細胞中表達的報道。因此，也沒有對增加klotho的表達的物質(zhì)的研究的報道。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的本發(fā)明的目的在于，制備一種能夠在皮膚細胞中增加klotho蛋白表達的試劑盒， 并利用該試劑盒測定在角質(zhì)形成細胞、成纖維細胞及黑色素細胞等皮膚細胞中的klotho 蛋白表達，發(fā)現(xiàn)能夠檢測抗老化物質(zhì)及美白物質(zhì)等皮膚活性物質(zhì)，從而完成了本發(fā)明。因此，本發(fā)明的目的在于提供一種通過在皮膚細胞中的klotho基因的表達與否， 從而篩選皮膚活性物質(zhì)的檢測試劑盒及利用該試劑盒檢測皮膚活性物質(zhì)的方法。技術(shù)方案為了達到上述目的，本發(fā)明提供一種檢測皮膚活性物質(zhì)的檢測試劑盒，該試劑盒含有klotho蛋白基因、用于擴增klotho蛋白基因的引物、探針和皮膚細胞，所述用于擴增klotho蛋白基因的引物具有SEQ ID No 1和SEQ ID No 2所示的序列，所述探針具有SEQ ID No 3所示的序列，在所述皮膚細胞中能夠篩選能夠增加klotho蛋白表達量的物質(zhì)，從而檢測皮膚活性物質(zhì)。此外，本發(fā)明還提供利用所述檢測試劑盒檢測活性物質(zhì)的方法。有益效果根據(jù)本發(fā)明的皮膚活性物質(zhì)檢測試劑盒，通過在皮膚細胞中的klotho基因的表達與否，可迅速簡便地篩選如抗老化物質(zhì)及美白物質(zhì)等皮膚活性物質(zhì)。


圖Ia是在人胚胎腎臟細胞(HEK293)、角質(zhì)形成細胞(NHK)及成纖維細胞(NHF)中測定klotho蛋白的RT-PCR擴增結(jié)果；圖Ib是在人黑色素細胞中測定klotho蛋白表達的 RT-PCR擴增結(jié)果；此時，NHM-增強黑(NHM-promoblack)及NHM-DP是源自黑人的黑色素細胞，NHM-MP是源自亞洲人的黑色素細胞。圖2是在人胚胎腎臟細胞(HEK293)、角質(zhì)形成細胞(NHK)及成纖維細胞(NHF)中檢測klotho蛋白表達量的圖。圖3是角質(zhì)形成細胞經(jīng)視黃酸(RA :retinoic acid)及視黃醇(R0L :retinol)處理后，在第2天及第8天檢測klotho蛋白表達量的圖。
具體實施例方式本發(fā)明涉及一種在皮膚細胞中檢測klotho蛋白表達量的方法，通過此在皮膚細胞中篩選能夠誘導長壽基因klotho蛋白表達的物質(zhì)，從而檢測皮膚活性物質(zhì)。所述皮膚活性物質(zhì)可包括改善皮膚皺紋或彈力或者改善粗糙皮膚的抗老化物質(zhì)；及提亮膚色或改善由于痣、雀斑、皮膚雜質(zhì)及太陽光線引起的皮膚曬黑等皮膚色素沉著現(xiàn)象的美白物質(zhì)。在皮膚細胞中能夠檢測klotho蛋白表達量的本發(fā)明的檢測試劑盒含有klotho蛋白基因、用于擴增klotho蛋白的引物、探針(參照表1)和皮膚細胞，所述用于擴增klotho 蛋白基因的引物具有SEQ ID No 1和SEQ ID No :2(序列號1和2)所示的序列，所述探針具有SEQ ID No :3(序列號幻所示的序列，在所述皮膚細胞中能夠篩選能夠增加klotho蛋白表達量的物質(zhì)，從而檢測抗老化物質(zhì)。表 權(quán)利要求
1.一種檢測皮膚活性物質(zhì)的檢測試劑盒，該試劑盒含有klotho蛋白基因、用于擴增 klotho蛋白基因的引物、探針和皮膚細胞，所述用于擴增klotho蛋白基因的引物具有SEQ ID No :1和SEQ ID No :2所示的序列，所述探針具有SEQ ID No :3所示的序列，在所述皮膚細胞中能夠篩選能夠增加klotho蛋白表達量的物質(zhì)，從而檢測皮膚活性物質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其中，所述皮膚活性物質(zhì)是抗老化物質(zhì)或者美白物質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其中，所述皮膚細胞是人角質(zhì)形成細胞、成纖維細胞或黑色素細胞。
4.一種檢測皮膚活性物質(zhì)的方法，其特征在于，該方法包括利用權(quán)利要求1-3中任意一項所述的檢測試劑盒，將皮膚細胞用候選物質(zhì)處理后，測定klotho蛋白表達與否的步驟，和，將增加klotho蛋白表達的物質(zhì)分離精制的步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種皮膚活性物質(zhì)檢測用試劑盒及利用該試劑盒檢測皮膚活性物質(zhì)的方法，具體地，涉及利用含有以長壽基因著稱的klotho基因的檢測試劑盒，從皮膚細胞中將誘導klotho基因表達的候選物質(zhì)分離、精制，從而檢測抗衰老及美白物質(zhì)等皮膚活性物質(zhì)的皮膚活性物質(zhì)檢測用試劑盒及利用該試劑盒檢測皮膚活性物質(zhì)的方法。
文檔編號C12Q1/68GK102465182SQ201110142379
公開日2012年5月23日 申請日期2011年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月29日
發(fā)明者孫義東, 崔向兌, 李真锳, 羅勇柱, 金漢坤 申請人:株式會社愛茉莉太平洋