專利名稱：豬瘟抗體ppa-elisa檢測試劑盒及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種豬瘟抗原重組E2蛋白的制備方法及用這種重組蛋白制備豬瘟抗體PPA-ELISA檢測試劑盒的方法。
背景技術(shù)：
豬痕(Classicalswine fever, CSF)是由豬痕病毒(Classical swine fevervirus, CSFV)引起豬的一種高度接觸性、致死性的傳染病，臨床上主要以稽留高熱、皮膚和粘膜出現(xiàn)大量出血點(diǎn)為主要特征。豬瘟具有高度傳染性，主要通過呼吸道和消化道傳染，不分季節(jié)，傳播速度快，發(fā)病率和死亡率高，流行廣泛，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，是嚴(yán)重危害我國養(yǎng)豬業(yè)的最重要的疫病之一。世界動物衛(wèi)生組織將其列為A類傳染病，我國也將其列為一類傳染病。 豬瘟病毒E2囊膜蛋白參與病毒對細(xì)胞的感染過程，攜帶有能刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫的抗原決定簇，是CSFV的主要保護(hù)性抗原蛋白，可誘導(dǎo)動物機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性的中和抗體。因此，E2被作為CSFV特異性抗原研究的首選蛋白。目前，豬瘟的診斷方法主要包括病毒的分離與鑒定、血清學(xué)方法及分子生物學(xué)檢測方法。其中，血清學(xué)檢測方法是檢測CSFV血清抗體重要手段之一，在CSFV的早期檢測、流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)測等方面有著重要的作用，也是免疫豬群抗體水平監(jiān)測的主要方法。ELISA診斷方法具有敏感性和特異性強(qiáng)、操作簡單、檢測快速、重復(fù)性好、高通量、無輻射、價格低廉等特點(diǎn)，在病毒學(xué)、免疫學(xué)、血清學(xué)、寄生蟲學(xué)、細(xì)菌學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，是當(dāng)前動物傳染病檢疫、流行病學(xué)調(diào)查和免疫監(jiān)測廣泛采用的血清學(xué)診斷技術(shù)。但目前ELISA檢測所用的抗原為細(xì)胞培養(yǎng)的病毒，豬瘟病毒在細(xì)胞培養(yǎng)上濃度低，導(dǎo)致該法生產(chǎn)的豬瘟抗原產(chǎn)量有限，成本較高，難以滿足國內(nèi)豬瘟診斷和免疫檢測的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種制備豬瘟抗原重組蛋白的方法，同時提供利用這種豬瘟抗原重組蛋白作為包被抗原研制豬瘟抗體PPA-ELISA檢測試劑盒的方法。本發(fā)明的豬瘟抗原重組蛋白的制備方法是參照已發(fā)表的豬瘟病毒C株基因組序列，利用01igo6. O和DNAstar生物學(xué)軟件對E2基因的抗原區(qū)進(jìn)行分析，選取了 E2基因的包含A、B、C、D共4個中和抗原區(qū)在內(nèi)的基因片段，設(shè)計了一對擴(kuò)增E2基因片段的引物，并引入酶切位點(diǎn)擴(kuò)增去掉E2基因的跨膜區(qū)及疏水區(qū)后550bp的目的基因片段。將擴(kuò)增的E2基因片段克隆到PMD18-T載體上，鑒定正確后，將目的片段進(jìn)一步定向克隆到PGEX-6P-1原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化BL21表達(dá)菌。取轉(zhuǎn)化菌培養(yǎng)，用IPTG誘導(dǎo)，獲得了以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白。重組蛋白純化后，經(jīng)免疫印跡檢測證明具有良好的抗原性和特異性。本發(fā)明的豬瘟抗體PPA-ELISA檢測試劑盒的制備方法是利用前述重組豬瘟抗原重組蛋白為包被抗原，以辣根過氧化物酶標(biāo)記葡萄球菌A蛋白(SPA)為二抗，經(jīng)過間接ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立檢測豬瘟病毒抗體的間接ELISA方法，并組裝檢測豬瘟抗體的PPA-ELISA試劑盒。通過與正向間接血凝試驗(yàn)盒(IHA)和IDEXXELISA試劑盒的比較對本發(fā)明的豬瘟抗體PPA-ELISA檢測試劑盒進(jìn)行評價。本發(fā)明的優(yōu)越性包括以下方面本發(fā)明中所用的抗原為基因工程方法表達(dá)出的重組抗原，具有很強(qiáng)的特異性，能真實(shí)準(zhǔn)確地反應(yīng)豬群中豬瘟的抗體水平。本發(fā)明中所用的表達(dá)載體為PGEX-6P-1高效原核表達(dá)載體，該表達(dá)載體具有GST標(biāo)簽，易于融合表達(dá)后重組蛋白的分離純化。本發(fā)明中所用的表達(dá)菌株為大腸桿菌BL21 (DE3) pLysS,表達(dá)性能穩(wěn)定，且具有成本低廉，操作簡單，易于培養(yǎng)，生產(chǎn)周期短等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明中用重組抗原(包含E2蛋白A、B、C、D共4個中和抗原區(qū))作為試劑盒的包被抗原，比已有的用純化的豬瘟全病毒做為包被抗原，具有易于制備、成分均一的優(yōu)點(diǎn)， 適合于規(guī)模化生產(chǎn)制備。本發(fā)明中試劑盒所用酶標(biāo)二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記葡萄球菌A蛋白(SPA)，SPA不僅與豬的血清IgG的Fe段有很強(qiáng)的結(jié)合力，同時還能與血清中少量的IgM和IgA結(jié)合，使本試劑盒很高的敏感性。本發(fā)明中試劑盒所用酶標(biāo)二抗SPA與用辣根過氧化物酶標(biāo)記IgG作為二抗相比，具有制備容易、性質(zhì)穩(wěn)定、易純化、與抗原結(jié)合力強(qiáng)、易于被辣根過氧化物酶標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)，有助于提高試劑盒的保存期和利于其規(guī)?；M裝生產(chǎn)。本發(fā)明中試劑盒特異性檢測針對豬瘟病毒保護(hù)性結(jié)構(gòu)蛋白的E2蛋白的抗體，其檢測結(jié)果對各種豬瘟疫苗免疫效果評價具有重要的參考價值。本發(fā)明中試劑盒在符合率試驗(yàn)中，與正向間接血凝試驗(yàn)盒(IHA)和IDEXX ELISA試劑盒相比較，使本試劑盒具有極高的準(zhǔn)確性和權(quán)威性。本發(fā)明中的試劑盒可局限性的診斷豬瘟野毒感染。出生后超過50日齡，未免疫過豬瘟弱毒疫苗，用本發(fā)明中的試劑盒檢測出豬瘟抗體陽性可診斷為豬瘟野毒感染。本發(fā)明的試劑盒具有操作簡單，檢測快速、成本低廉等特點(diǎn)，適合于大量動物血清的普查，可在實(shí)際生產(chǎn)中廣泛推廣使用。


圖I為E2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果，泳道I為DL2000marker，泳道2為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道3為陰性對照。圖2為E2基因與pMD18-T載體連接的PCR及酶切鑒定結(jié)果，泳道I為PCR陰性對照，泳道2為pMD18-T-E2PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道3為DL2000marker，泳道4為pMD18-T-E2EcoRI/XhoI 雙酶切，泳道 5 為 DL15000marker圖3為E2基因與PGEX-6p-l載體連接的PCR及酶切鑒定結(jié)果，泳道I為PCR陰性對照，泳道2為PGEX-E2PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道3為DL2000marker，泳道4為PGEX_E2EcoRI/XhoI雙酶切，泳道5為PGEX-6p-l載體雙酶切，泳道6為DL15000marker圖4為E2重組蛋白的SDS-PAGE分析，泳道I為PGEX-E2未誘導(dǎo)菌對照，泳道2為PGEX-6P-1誘導(dǎo)菌對照，泳道3為PGEX-E2誘導(dǎo)菌，泳道4為超生破碎后上清，泳道5為超生破碎后沉淀，泳道6為蛋白marker,泳道7純化蛋白
圖5為表達(dá)產(chǎn)物的免疫印跡分析，泳道I為PGEX-E2重組蛋白與陽性血清反應(yīng)，泳道2為PGEX-6P-1誘導(dǎo)菌與陽性血清反應(yīng)
具體實(shí)施例方式I、病毒基因組RNA的提取豬瘟病毒的病毒液200 μ 1，加TRIzoI試劑1ml，按TRIzol試劑說明提取病毒基因組RNA。TRIzol購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。2、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA以提取的病毒基因組RNA為模板，首先反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按20 μ I體系操作，取提取的10 μ I RNA, 2. 5 μ I下游引物(5’-CGGAATTCGAAGATTACAGGTATGCGATA-3’)，4μ I 5XM-MLV Buffer,O. 5 μ IRibonuclease Inhibitor,2 μ I 2. 5mM ΝΤΡ,Ιμ I M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，42°C作用50min后，95°C 5min滅活反應(yīng)。M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、Ribonuclease Inhibitor、dNTP購自寶生物工程(大連)有限公司。3、PCR擴(kuò)增以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系為0· 5 μ I Ex Taq(5U/μ1)、5μ1 10 X Ex Taq Buffer, 4 μ I dNTP (2· 5mmol/L)、I. O μ I 上游引物(5，-CGGAATTCG AAGATTACAGGTATGCGATA-3’)、1· Ομ I 下游引物(5，-GGCCCTCGAGTTCCACACATGTCCAAT-3’ )、10 μ I cDNA，加水至 50 μ I。PCR 反應(yīng)條件為94°C 4min ；94°C 45s, 54°C 45s, 72°C 45s, 30個循環(huán)；72°C 10min，4°C終止反應(yīng)。Ex Taq酶、dNTP購自寶生物工程(大連)有限公司。4、E2基因克隆載體的構(gòu)建與鑒定PCR產(chǎn)物純化后與pMD18_T載體于4°C過夜連接，然后轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，堿裂解法提取質(zhì)粒，EcoRI/XhoI雙酶切鑒定得到陽性重組質(zhì)粒pMD 18-T-E2。5、E2基因表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定陽性重組質(zhì)粒PMD18-T-E2用EcoRI/XhoI雙酶切，回收目的片段，將其定向克隆到經(jīng)EcoRI/XhoI雙酶切的PGEX-6P-1表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5 a，堿裂解法提取質(zhì)粒，EcoRI/XhoI雙酶切鑒定得到陽性重組質(zhì)粒PGEX-E2。6、PGEX-E2重組蛋白的表達(dá)將鑒定正確的PGEX-E2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，取轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)單菌落接種于5ml含卡那霉素的LB中，37°C培養(yǎng)過夜。1%接種于3ml含卡那霉素的LB中培養(yǎng)至0D600值至O. 6-0. 7，加誘導(dǎo)劑異丙基-B-D硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度分別為I. 0mmol/Lo 37°C繼續(xù)培養(yǎng)4h，取Iml菌液，離心收集細(xì)菌加入2 X SDS-PAGE樣品處理液，煮沸5min，取10 μ I進(jìn)行SDS-PAGE分析。7、PGEX-E2重組蛋白表達(dá)形式的鑒定以最佳條件誘導(dǎo)表達(dá)后，超聲波破碎細(xì)胞，12000r/min離心15min，分別收集上清及沉淀進(jìn)行SDS-PAGE，鑒定目的蛋白是以可溶性形式存在于上清中還是以包涵體形式存在于沉淀中。8、PGEX-E2重組蛋白的純化對以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白按蛋白質(zhì)純化試劑GSTrapTM HP的使用說明書進(jìn)行純化。蛋白質(zhì)純化試劑GSTrapTM HP購自GE Healthcare公司。9、重組蛋白的免疫印跡檢測純化后的重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉4°C封閉過夜，加CSFV陽性血清(I 100稀釋)37°C作用lh，TBST緩沖液洗3次，加入兔抗豬IgG辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記抗體(I 5000稀釋)37°C作用50min, TBST緩沖液洗3次，在二氨基聯(lián)苯胺(DAB)緩沖溶液中顯色lOmin。10、豬瘟抗體的PPA-ELISA檢測方法的建立在相同的反應(yīng)條件下，分別將重組抗原的不同包被濃度與待檢樣品的不同稀釋倍數(shù)、不同封閉液與不同封閉時間、二抗不同稀釋倍數(shù)與不同作用時間組成方陣，經(jīng)方陣滴定試驗(yàn)分別確定重組抗原最佳包被濃度與待檢樣品最佳稀釋倍數(shù)、最佳封閉液與最佳封閉時間、二抗最佳稀釋倍數(shù)與最佳作用時間，原則是陽性血清OD45tlnm I. O,陰性血清OD45tlnm < O. 2，選取P/N值最大的各個組合。在相同反應(yīng)條件下，與待檢樣品分別作用30、60、90、12011^11，底物分別顯色5、10、15、201^11，選擇陽性血清OD45tlnm I. O,陰性血清OD45tlnm < O. 2，P/N值最大的一抗?jié)舛?、底物作用時間。11、豬瘟抗體PPA-ELISA檢測試劑盒的組裝試劑盒由抗原包被板、陽性對照血清、陰性對照血清、10X SPA酶標(biāo)抗體、10X樣品稀釋液、20X濃縮洗滌液、TMB底物溶液、終止液、使用說明書組成。12、試劑盒使用方法示例①在Al和A2孔中分別加入100μ I陰性對照血清；在A3和Α4孔中分別加入100 μ I陽性對照血清；②取100 μ I經(jīng)I : 100稀釋好的待檢樣品液加入相應(yīng)孔中，并做好記錄；室溫或37°C 孵育 Ih ； ③將各孔的液體棄入廢液桶。每孔再加約300 μ I的洗滌液(試劑盒內(nèi)20 X濃縮洗滌液需用蒸餾水或去離子水稀釋后方可使用。如有結(jié)晶，需先溶解后，方可進(jìn)行稀釋。)進(jìn)行洗板，重復(fù)3 5次，每次2 3min ；④每孔加入100 μ I使用樣品稀釋液I : 10稀釋好的酶標(biāo)抗體；室溫或37°C孵育Ih ；⑤重復(fù)步驟④； ⑥每孔加100 μ I底物溶液；⑦室溫孵育5min (盡量避開強(qiáng)光照射);⑧每孔加100 μ I的終止液；立刻于450nm波長處測定各孔的吸光度值，即OD45tol值。⑨臨界值(C. O.)的計算正常情況下，陽性對照孔OD45tl值彡O. 4 ;陰性對照孔OD450值< O. 2 ;臨界值=O. 19+陰性對照孔均值；陰性對照孔OD450值大于O. 2時應(yīng)舍棄，如所有陰性對照孔OD45tl值都大于O. 2時須重復(fù)實(shí)驗(yàn)；陰性對照孔低于O. 05時以O(shè). 05計算。⑩結(jié)果判定檢測樣品OD45tl值>臨界值判定該檢測樣品為陽性；檢測樣品OD450值<臨界值判定該檢測樣品為陰性。依據(jù)農(nóng)業(yè)部豬瘟免疫和監(jiān)測方案，免疫21天后，豬瘟抗體PPA-ELISA檢測試驗(yàn)抗體陽性判定為免疫合格。13、交叉反應(yīng)試驗(yàn)用本發(fā)明的試劑盒檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬乙型腦炎病毒(JEV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)的陽性血清，結(jié)果均無交叉反應(yīng)，試劑盒具有極高的特異性。14、重復(fù)性試驗(yàn)用本發(fā)明的試劑盒檢測8份CSFV抗體水平不同的血清，每份血清樣本平行做8個重復(fù)，得出批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)為2. 00% 4. 44%，均小于5% (見表I)。用4個批次的本試劑盒檢測8份CSFV抗體水平不同的血清，得出批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)為3. 51% 8. 36%，均小于10% (見表2)。說明本發(fā)明的PPA-ELISA試劑盒具有良好的重復(fù)性。表I批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一對用于擴(kuò)增豬瘟病毒(CSFV)部分E2基因的特異性引物，其特征在于所述引物的序列為 CSFV 上游引物5’ -CGGAATTCGAAGATTACAGGTA TGCGATA-3’ CSFV 下游引物5’ -GGCCCTCGAGTTCCACACATGTCCAAT-3’ 擴(kuò)增目的片段大小為550bp。
2.一種用于豬瘟抗體ELISA檢測試劑盒包被抗原的制備方法，其特征是用權(quán)利要求I所述引物從豬瘟病毒(CSFV)E2基因中擴(kuò)增包含A、B、C、D共4個中和抗原區(qū) A 中和抗原區(qū)的氨基酸序列為5 ‘-SVTFELLFDGTNPSTEEMGDDFRSGLCPFDTSPVVKGKYNTTLLNGSAFYLVCPIGWTGVIECTAVSPTTLRTEVVKTFRRDKPFPHRMDCVTTIVENEDL-3， ；B 中和抗原區(qū)的氨基酸序列為5 ‘-RLACKEDYRYAIS STDEIGLLGAGGLTTT WKEYNHDLQLNDGTVKAS CVAGSFK VTALNVVSRRYLASLHKKALPT SVTFELLF-3’；C 中和抗原區(qū)的氨基酸序列為5 ‘-RLACKEDYRYAIS STDEIGLLGAGGLTTTffKEYNHDLQLNDGTVKASCVAGSFKVTALNVVSRRYLASLHKKALPTSVTFELLFDGTNPSTEEMGDDFRSGLCPFDTSPVV-3’ ；D中和抗原區(qū)的氨基酸序列為5 ‘-SVTFELLFDGTNPSTEEMGD DFRSGLCPFDTSPVV-3’在內(nèi)的550bp基因片段，將擴(kuò)增的E2基因片段克隆到pMD18_T載體上，鑒定正確后，將目的片段進(jìn)一步定向克隆到PGEX-6P-1原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化BL21表達(dá)菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，采用親和層析法從表達(dá)產(chǎn)物中分離純化重組蛋白，免疫印跡檢測純化蛋白的抗原性和特異性。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述表達(dá)載體為PGEX-6p-l高效原核表達(dá)載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述表達(dá)菌株為大腸桿菌BL21(DE3)pLysSo
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述純化方法采用親和層析法。
6.一種豬瘟抗體PPA-ELISA檢測方法，其特征是以權(quán)利要求2-6中任一項(xiàng)的純化重組蛋白為包被抗原，以辣根過氧化物酶標(biāo)記葡萄球菌A蛋白(SPA)為二抗，經(jīng)過間接ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立檢測豬瘟抗體的間接ELISA方法。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所用的包被抗原采用權(quán)利要求2所述的制備方法制備。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所用的酶標(biāo)二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記葡萄球菌A蛋白(SPA)，并用其對各種豬瘟病毒E2蛋白(A、B、C、D共4個中和抗原區(qū))產(chǎn)生的抗體進(jìn)行特異性檢測。
9.一種豬瘟抗體PPA-ELISA檢測試劑盒，其特征在于，試劑盒中要有抗原包被板、陽性對照血清、陰性對照血清、10X SPA酶標(biāo)抗體、10X樣品稀釋液、20X濃縮洗滌液、底物溶液、終止液、使用說明書。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測試劑盒，其特征在于，用正向間接血凝試驗(yàn)盒(IHA)和IDEXX ELISA試劑盒進(jìn)行符合率試驗(yàn)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種豬瘟抗體PPA-ELISA檢測試劑盒及制備方法，該試劑盒的制備是采用RT-PCR擴(kuò)增E2基因包含A、B、C、D共4個中和抗原區(qū)在內(nèi)的550bp基因片段，將擴(kuò)增的E2基因片段克隆到pMD18-T載體上，鑒定正確后，將目的片段進(jìn)一步定向克隆到PGEX-6P-1原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化BL21表達(dá)菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，獲得了以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白。采用親和層析法分離純化重組蛋白，免疫印跡檢測純化蛋白的抗原性和特異性。以該重組蛋白為包被抗原，以辣根過氧化物酶標(biāo)記葡萄球菌A蛋白(SPA)為二抗，經(jīng)過間接ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立檢測豬瘟病毒抗體的間接ELISA檢測方法，并組裝豬瘟抗體PPA-ELISA檢測試劑盒。
文檔編號C12N15/40GK102807980SQ20111014267
公開日2012年12月5日 申請日期2011年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月30日
發(fā)明者沈志強(qiáng), 王金良, 李嬌, 祖立闖 申請人:山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院