專利名稱：一種含有l(wèi)oxP-kan^r-loxP片段的重組質(zhì)粒載體p18-kan^±的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
在進行真核生物基因敲除、替換等實驗過程中，往往會用到karf基因作為篩選標記，應用IoxP位點作為去除抗性標記基因工具位點。在實際應用中，這一功能片段通常是應用融合PCR等互補PCR手段與目的基因重組連接的。但是，在實際操作中往往會因為PCR 錯配及引物特異性等不足，使得連接失敗或產(chǎn)物基因失活，最終導致實驗失敗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種含有l(wèi)oxP-karf-loxP片段的重組質(zhì)粒載體plS-kaf 的構(gòu)建方法。含有l(wèi)oxP-karf-loxP片段的重組質(zhì)粒載體plS-kaf的構(gòu)建方法按以下步驟進行一、采用PCR技術(shù)從pUG6質(zhì)粒中獲得loxP-karf-loxP片段；二、膠回收1.6Kb的 loxP-kanr-loxP片段，然后以2. 7Kb的pMD18_T載體作為骨架，通過T-A末端連接，獲得連接產(chǎn)物；三、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，然后涂布于氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，挑取陽性克隆，接種于氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)后采用堿裂解法提取重組質(zhì)粒，即完成含有l(wèi)oxP-karf-loxP片段的重組質(zhì)粒載體plS-kar^的構(gòu)建。本發(fā)明利用pMDIS-T載體作為模板，向其多克隆位點上引入loxP-karf-loxP基因片段，同時構(gòu)建出一對連接方向相反的重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒loxP-karf-loxP位點兩端具有多個常用酶切位點，外源基因便于與loxP-karf-ΙοχΡ片段連接，為真核生物基因敲除、替換提供了新的操作途徑。本發(fā)明PCR獲得loxP-karf-loxP基因片段，將其連入到質(zhì)粒載體pMD18_T多克隆位點中，獲得重組質(zhì)粒，經(jīng)轉(zhuǎn)化、藍白篩選后獲得含有l(wèi)oxP-karf-loxP片段的重組質(zhì)粒載體 plS-kaf，經(jīng)PCR及酶切鑒定，結(jié)果與預期結(jié)果相符，測序結(jié)果顯示loxP-karf-loxP片段以兩個不同方向成功連入質(zhì)粒中，含有l(wèi)oxP-karf-loxP片段的重組質(zhì)粒載體plS-kar^構(gòu)建成功。
具體實施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式含有l(wèi)oxP-karf-loxP片段的重組質(zhì)粒載體plS-kaf的構(gòu)建方法按以下步驟進行一、采用PCR技術(shù)從pUG6質(zhì)粒中獲得 loxP-kanr-loxP 片段；二、膠回收 1. 6Kb 的 loxP-karf-loxP 片段，然后以 2. 7Kb 的 pMD18_T 載體作為骨架，通過T-A末端連接，獲得連接產(chǎn)物；三、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，然后涂布于氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，挑取陽性克隆，接種于氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)后采用堿裂解法提取重組質(zhì)粒，即完成含有l(wèi)oxP-karf-loxP 片段的重組質(zhì)粒載體Pl8-kan±的構(gòu)建。本實施方式中pUG6質(zhì)粒、大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞、pMD18_T載體均為購買得到(NewEngland Biolabs Inc. ,MA,USA)；本實施方式在具體操作中涉及使用的各種反應試劑或試劑盒均為購買得到(寶生物工程有限公司)，且使用均按說明書操作。本實施方式步驟二中連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，然后涂布于氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)的具體過程將大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細胞從-70°C取出，在冰上融化后加入5μ 1連接產(chǎn)物，冰中放置30分鐘，然后42°C熱休克90秒，再冰浴 2-3分鐘，加入37°C預熱的S. 0. C培養(yǎng)基900 μ 1，37°C振蕩培養(yǎng)1小時(160-200rpm)，然后 4000r/min離心3分鐘，棄上清，保留200 μ 1培養(yǎng)基，將沉淀重新混勻后，涂布于氨芐抗性的 LB固體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜。本實施方式步驟三中采用堿裂解法提取重組質(zhì)粒的具體過程隨機挑取生長于氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基上的數(shù)個白色菌落分別接種于氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37°C 振蕩培養(yǎng)過夜；取1. 5ml培養(yǎng)液于微量離心管中，10, OOOg離心30秒，棄上清，將沉淀重懸于100 μ 1冰預冷的溶液I (50mM葡萄糖，25mMTris_HCI，IOmM EDTA, pH8. 0)中，劇烈振蕩以分散沉淀；再加入200 μ 1新配制的溶液II (0. 2Μ NaOH, 1 % SDS)，顛倒混勻幾次后置冰浴5分鐘，然后加入150 μ 1溶液III (5Μ乙酸鉀60ml，冰乙酸11. 5ml，水28. 5ml配制而成)， 顛倒混勻數(shù)次，冰浴10分鐘后于4°C 12000r/min離心10分鐘，取上清加入等體積的酚、氯仿各抽提一次，取上層水相加入1倍體積的異丙醇，-20°C沉淀10分鐘；4°C 12000r/min離心15分鐘，棄上清，沉淀用70% (體積)乙醇洗滌1次后真空干燥；沉淀用適量含RNA酶 (20 μ g/ml)的 TE(10mM Tris-HCI, ImM EDTA, ρΗ8· 0)(不含 DNA 酶)溶解，37°C作用 30 分鐘。本實施方式步驟三中提取的重組質(zhì)粒進行PCR鑒定PCR的反應體系為18 μ L反應體系，由下列成分組成
成分
模板 DNA pUG6 20pmol/L 引物 1 5'- GTACGCTGCAGGTCGAC -3' 20pmol/L 引物 2 5'- GCCACTAGTGGATCTGATATC -3 10 X擴增緩沖液 2.5mM mmol/L dNTP 混合液 5υ/μ1 U Taq DNA 聚合酶 ddH20
4
用量
Ιμ Ιμ
Ιμ
2.5μL Ιμ 0.5|iL ΙΙμ
PCR 條件為94°C預變性 5min，94°C變性 10s，57°C退火 15s，72°C延伸 2min，共 30 個循環(huán)，再72°C延伸10min，4°C保溫。重組質(zhì)粒進行單酶切鑒定PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，進行Hind III單酶切，酶切體系如下
重組質(zhì)粒2μ1
HindlllΙμ
IOXMBuffer2μ1
ddH20補至終體積為15μ1重組質(zhì)粒進行序列測定測序工作交由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。含有l(wèi)oxP-karf-loxP片段的重組質(zhì)粒載體pl8-kan±中kan抗性及兩端酶切位點測序結(jié)果如下可見同原始序列中沈 1619bp部分相同(原始序列參見pUG6質(zhì)粒的全長編碼序列，見SEQ ID No. 1)，沒有變化；測序結(jié)果顯示loxP-karf-loxP片段以兩個不同方向
成功連入質(zhì)粒中，含有l(wèi)oxP-karf- οχΡ片段的jI組質(zhì)粒載體Pl8-kan±構(gòu)建成功。
GTACGCTGCAGGTCGACAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTA
TTAGGTCTAGAGATCTGTTTAGCTTGCCTCGTCCCCGCCGGGTCACCCGGCCAGCGACAT
GGAGGCCCAGAATACCCTCCTTGACAGTCTTGACGTGCGCAGCTCAGGGGCATGATGTGA
CTGTCGCCCGTACATTTAGCCCATACATCCCCATGTATAATCATTTGCATCCATACATTT
TGATGGCCGCACGGCGCGAAGCAAAAATTACGGCTCCTCGCTGCAGACCTGCGAGCAGGG
AAACGCTCCCCTCACAGACGCGTTGAATTGTCCCCACGCCGCGCCCCTGTAGAGAAATAT
AAAAGGTTAGGATTTGCCACTGAGGTTCTTCTTTCATATACTTCCTTTTAAAATCTTGCT
AGGATACAGTTCTCACATCACATCCGAACATAAACAACCATGGGTAAGGAAAAGACTCAC
GTTTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCT
CGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCG
CCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATG
GTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGT
ACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGCAAAACAGCATTCCAGGTA
TTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGC
CGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTC
GCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAG
CGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAGCTTTTGCCATTCTCA
CCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGG
AAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTT
GCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAA
AAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAG
TTTTTCTAATCAGTACTGACAATAAAAAGATTCTTGTTTTCAAGAACTTGTCATTTGTAT
AGTTTTTTTATATTGTAGTTGTTCTATTTTAATCAAATGTTAGCGTGATTTATATTTTTT
TTCGCCTCGA CATCATCTGC CCAGATGCGA AGTTAAGTGC GCAGAAAGTA ATATCATGCGTCAATCGTAT GTGAATGCTG GTCGCTATAC TGCTGTCGAT TCGATACTAA CGCCGCCATCCAGTGTCGAA AACGAGCTCT CGAGAACCCT TAATATAACT TCGTATAATG TATGCTATACGAAGTTATTA GGTGATATCA GATCCACTAG TGGC。
具體實施方式
二 本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟一中PCR的反應體系為18 μ L反應體系，由下列成分組成
成分
用量 Ιμ Ιμ
模板 DNA pUG6 20pmol/L 引物 1 5'- GTACGCTGCAGGTCGAC -3'
20pmol/L 引物 2l|iL
5'- GCCACTAGTGGATCTGATATC -3'
10 X擴增緩沖液2.5|iL
2.5mM mmol/L dNTP 混合液l|iL
5υ/μ1 U rTaq DNA 聚合酶0.5|iL
ddH20ΙΙμ PCR 條件為94°C預變性 5min，94°C變性 10s，57°C退火 15s，72°C延伸 2min，共 30 個循環(huán)，再72°C延伸10min，4°C保溫。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一相同。
下
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟二中連接的體系如
成分用量
pMD18-T 載體l|iL
loxP-kanr"loxP 片段4|iL
Solutionl5 μι連接條件為16°C連接池。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一相同。本實施方式中Solutionl是商品化產(chǎn)品，購買自TAKARA公司，是一種連接酶及緩沖液的混合物，購買試劑盒中標配試劑，按照說明書操作使用。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟三中氨芐抗性的 LB固體培養(yǎng)基每IOOOmL由100 μ g的氨芐青霉素、IOg的胰蛋白胨、5g的酵母浸粉、20g的瓊脂、IOg的NaCl和余量的水組成，pH值為6. 0 8. 0。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟三中氨芐抗性的 LB液體培養(yǎng)基每IOOOmL由100 μ g的氨芐青霉素、IOg的胰蛋白胨、5g的酵母浸粉、IOg的NaCl和余量的水組成，pH值為6. 0 8. 0。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一相同。
權(quán)利要求
1.一種含有l(wèi)oxP-karf-loxP片段的重組質(zhì)粒載體pl8-kan±的構(gòu)建方法，其特征在于含有l(wèi)oxP-karf-loxP片段的重組質(zhì)粒載體pl8-kan±的構(gòu)建方法按以下步驟進行一、采用 PCR技術(shù)從pUG6質(zhì)粒中獲得loxP-kanr-loxP片段；二、膠回收1. 6Kb的loxP-kanr-loxP片段，然后以2. 7Kb WpMDlS-T載體作為骨架，通過T-A末端連接，獲得連接產(chǎn)物；三、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細胞，然后涂布于氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，挑取陽性克隆，接種于氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)后采用堿裂解法提取重組質(zhì)粒， 即完成含有l(wèi)oxP-kar^-loxP片段的重組質(zhì)粒載體plS-kaf的構(gòu)建。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種含有l(wèi)oxP-karf-loxP片段的重組質(zhì)粒載體plS-kaf的構(gòu)建方法，其特征在于步驟一中PCR的反應體系為18 μ L反應體系，由下列成分組成成分用量模板 DNA pUG6Ιμ 20pmol/L 引物 1l|iL 5'- GTACGCTGCAGGTCGAC -3'20pmol/L 引物 2l|iL 5'- GCCACTAGTGGATCTGATATC -3'10 X擴增緩沖液2.5|iL2.5mM mmol/L dNTP 混合液1 μ 5υ/μ1 Taq DNA 聚合酶0.5|iLddH20ΙΙμ PCR條件為94°C預變性5min，94°C變性10s，57°C退火15s，72°C延伸2min，共30個循環(huán)，再72°C延伸10min，4°C保溫。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種含有l(wèi)oxP-karf-loxP片段的重組質(zhì)粒載體plS-kaf的構(gòu)建方法，其特征在于步驟二中連接的體系如下成分用量pMD18-T 載體l|iLloxP-kanr"loxP 片段4|iLSolutionl5 μι連接條件為16°C連接池。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種含有l(wèi)oxP-karf-loxP片段的重組質(zhì)粒載體plS-kaf的構(gòu)建方法，其特征在于步驟三中氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基每IOOOmL由100 μ g的氨芐青霉素、IOg的胰蛋白胨、5g的酵母浸粉、20g的瓊脂、IOg的NaCl和余量的水組成，pH值為6. 0 8. 0。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種含有l(wèi)oxP-karf-loxP片段的重組質(zhì)粒載體pl8-kan±的構(gòu)建方法，其特征在于步驟三中氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基每IOOOmL由100 μ g的氨芐青霉素、IOg的胰蛋白胨、5g的酵母浸粉、IOg的NaCl和余量的水組成，pH值為6. 0 8. 0。
全文摘要
一種含有l(wèi)oxP-kanr-loxP片段的重組質(zhì)粒載體p18-kan±的構(gòu)建方法，它涉及一種重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法。方法1、從pUG6質(zhì)粒中獲得loxP-kanr-loxP片段；2、以pMD18-T載體作為骨架，通過T-A末端連接獲得連接產(chǎn)物；3、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，提取重組質(zhì)粒即完成。本發(fā)明利用pMD18-T載體作為模板，向其多克隆位點上引入loxP-kanr-loxP基因片段，同時構(gòu)建出一對連接方向相反的重組質(zhì)粒，質(zhì)粒loxP-kanr-loxP位點兩端具有多個常用酶切位點，外源基因便于與loxP-kanr-loxP片段連接，為真核生物基因敲除、替換提供了新的操作途徑。
文檔編號C12N15/64GK102250937SQ20111014284
公開日2011年11月23日 申請日期2011年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月30日
發(fā)明者原韜, 張曉彥, 沙長青, 谷軍, 趙曉龍, 陳兵 申請人:黑龍江省科學院微生物研究所