專利名稱：一種用于檢測(cè)精脒/精胺N¹-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是涉及一種醫(yī)藥檢測(cè)技術(shù)，更具體地說是涉及一種精脒/精胺N1-乙酰轉(zhuǎn)移酶(簡(jiǎn)稱SSAT)活性的方法，再具體地說是涉及一種通過檢測(cè)SSAT底物的乙?；x物來分析SSAT活性的方法，其中SSAT底物是左旋多巴，左旋多巴的部分代謝是通過SSAT的誘導(dǎo)能夠產(chǎn)生乙酰化代謝物N-乙?；?L-多巴。
背景技術(shù)：
(一)左旋多巴的研究概況1、概述3-羥基-L-酪氨酸/L-β-(3，4-二羥基苯)丙氨酸/L_3_ (3，4_ 二羥基苯)丙氨酸/L-(3，4-二羥基苯)丙氨酸(Levodopa)，又稱L-多巴(簡(jiǎn)稱L-Dopa，L-D0PA)，為酪氨酸的羥化物，在體內(nèi)是左旋酪氨酸合成兒茶酚胺的中間產(chǎn)物。作為藥品，通用名為左旋多巴，又名左多巴，商品名為息寧、Parcopa、Atamet, Malevo、美多巴、Prolopa等。附左旋與右旋是指有機(jī)化合物的對(duì)映體對(duì)偏振光中分別使光向反時(shí)針或順時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)。會(huì)令偏振光左旋或右旋的異構(gòu)體會(huì)被稱為左旋體和右旋體。在有機(jī)化學(xué)中，通常用(+)表示左旋，(_)表示右旋。如L-構(gòu)型的左旋酒石酸，其全名可寫作L(+)_酒石酸。L-DOPA為抗震顫麻痹藥，適用于原發(fā)性震顫麻痹癥及非藥原性震顫麻痹綜合征。 L-DOPA通過血腦屏障進(jìn)入腦組織，發(fā)揮作用。L-DOPA服用后有惡心、嘔吐、食欲不振及失眠、幻覺等不良反應(yīng)。2、理化性質(zhì)英文另Ij 名3- (3,4-Dihydroxyphenyl) -L-alanine, L-3- (3,4-Dihydroxyphenyl) alanine化學(xué)名稱3-羥基-L-酪氨酸分子式=C9H11NO4分子量197.19CAS 登錄號(hào)59-92-7EINECS 登錄號(hào)200-445-2比旋光度-11. 7&ordm ； (c = 5. 3，IN HCl)熔點(diǎn)295°C3、藥物分析L-DOPA生產(chǎn)有化學(xué)合成、天然植物提取和微生物酶轉(zhuǎn)化法三條主要途徑，天然左旋多巴來源于豆科藜豆屬植物龍爪藜豆Mizotobium ochinchinensis (Lour). Tang etffang的種子，也可以在哺乳動(dòng)物體內(nèi)和大腦中由L-酪氨酸合成。(1)方法名稱左旋多巴原料藥-左旋多巴的測(cè)定-非水滴定法。應(yīng)用范圍本方法采用滴定法測(cè)定左旋多巴原料藥中左旋多巴的含量。本方法適用于左旋多巴原料藥。
方法原理供試品加無水甲酸溶解后，加入冰醋酸搖勻，加結(jié)晶紫指示液2滴，用高氯酸滴定液滴定至溶液顯綠色，并將滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正，根據(jù)滴定液使用量，計(jì)算左旋多巴的含量。試劑①冰醋酸，②無水甲酸，③高氯酸滴定液(0. lmol/L)，④結(jié)晶紫指示液，⑤ 基準(zhǔn)鄰苯二甲酸氫鉀。試樣制備①高氯酸滴定液(0. lmol/L)配制取無水冰醋酸(按含水量計(jì)算，每Ig水加醋酐5. 22mL) 750mL,加入高氯酸 (70 72% )8. 5mL，搖勻，放冷，加無水冰醋酸適量使成IOOOmL,搖勻，放置M小時(shí)。若所測(cè)供試品易乙?；?，則須用水分測(cè)定法測(cè)定本液的含水量，再用水和醋酐調(diào)節(jié)至本液的含水量為0. 01% 0. 2%0標(biāo)定取在105°C干燥至恒重的基準(zhǔn)鄰苯二甲酸氫鉀約0. 16g，精密稱定，加無水冰醋酸20mL使溶解，加結(jié)晶紫指示液1滴，用本液緩緩滴定至藍(lán)色，并將滴定結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每ImL高氯酸滴定液(0. lmol/L)相當(dāng)于20. 42mg的鄰苯二甲酸氫鉀。根據(jù)本液的消耗量與鄰苯二甲酸氫鉀的取用量，算出本液的濃度。②結(jié)晶紫指示液取結(jié)晶紫0. 5g，加冰醋酸IOOmL使溶解。操作步驟精密稱取供試品約0. Ig,加無水甲酸2mL使溶解，加冰醋酸20mL搖勻， 加結(jié)晶紫指示液2滴，用高氯酸滴定液(0. lmol/L)滴定至溶液顯綠色，并將滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每ImL高氯酸滴定液(0. lmol/L)相當(dāng)于19. 72mg的C9H11N04。注“精密稱取”系指稱取重量應(yīng)準(zhǔn)確至所稱取重量的千分之一?！熬芰咳　毕抵噶咳◇w積的準(zhǔn)確度應(yīng)符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)該體積移液管的精度要求。參考文獻(xiàn)中華人民共和國(guó)藥典，國(guó)家藥典委員會(huì)編，化學(xué)工業(yè)出版社，2005年版，一部，P. 85。(2)方法名稱左旋多巴膠囊-左旋多巴的測(cè)定-分光光度法應(yīng)用范圍本方法采用分光光度法測(cè)定左旋多巴膠囊中左旋多巴的含量。本方法適用于左旋多巴膠囊。方法原理供試品加鹽酸溶液制成供試液，置紫外可見分光光度計(jì)，于^Onm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，計(jì)算出其含量。試劑鹽酸溶液儀器設(shè)備紫外可見分光光度計(jì)試樣制備①鹽酸溶液取鹽酸9mL，加水適量使成IOOOmL,搖勻。②供試品溶液的制備取裝量差異項(xiàng)下的內(nèi)容物，混合均勻，精密稱取適量(約相當(dāng)于左旋多巴30mg)，置IOOmL量瓶中，加鹽酸溶液適量，振搖使左旋多巴溶解，用鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液IOmL置另一 IOOmL量瓶中，加鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。注“精密稱取”系指稱取重量應(yīng)準(zhǔn)確至稱取重量的千分之一?！熬芰咳　毕抵噶咳◇w積的準(zhǔn)確度應(yīng)符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)該體積移液管的精度要求。
操作步驟取供試品溶液照紫外分光光度法，于波長(zhǎng)^Onm處測(cè)定吸收度，按 C9H11N04的吸收系數(shù)(El% Icm)為141計(jì)算，即得。注分光光度法應(yīng)以配制供試品的同批溶劑為對(duì)照，采用Icm的石英吸收池。以吸收度最大的波長(zhǎng)作為測(cè)定波長(zhǎng)，一般供試品的吸收度讀數(shù)，以在0. 3 0. 7之間的誤差較小。儀器的狹縫波帶寬度應(yīng)小于供試品吸收帶的半寬度，否則測(cè)得的吸收度偏低。狹縫寬度的選擇，應(yīng)以減少狹縫寬度時(shí)供試品的吸收度不再增加為準(zhǔn)。由于吸收池和溶劑本身可能有空白吸收，因此測(cè)定供試品的吸收度后應(yīng)減去空白讀數(shù)，再計(jì)算含量。參考文獻(xiàn)中華人民共和國(guó)藥典，國(guó)家藥典委員會(huì)編，化學(xué)工業(yè)出版社，2005年版，一部，P. 86。4、藥理毒理本品為擬多巴胺類抗帕金森病藥，左旋多巴為體內(nèi)合成多巴胺的前體物質(zhì)，本身并無藥理活性，通過血腦屏障進(jìn)入中樞，經(jīng)多巴脫羧酶作用轉(zhuǎn)化成多巴胺而發(fā)揮藥理作用， 改善帕金森病癥狀。由于本品可以增加腦內(nèi)多巴胺及去甲腎上腺素等神經(jīng)遞質(zhì)，還可以提高大腦對(duì)氨的耐受，而用于治療肝昏迷，改善中樞功能，使病人清醒，癥狀改善。(1)抗帕金森病左旋多巴在腦內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)槎喟桶罚a(bǔ)充紋狀體中多巴胺的不足，因而具有抗帕金森病的療效。研究表明，曾用過大量左旋多巴治療的患者，死后紋狀體中多巴胺濃度比未用藥治療者高5 8倍；而且腦內(nèi)多巴胺濃度與左旋多巴的療效相一致。說明患者黑質(zhì)-紋狀體通路中殘存的多巴胺能神經(jīng)元仍有儲(chǔ)存多巴胺的能力。其紋狀體多巴脫羧酶仍有足夠的酶活性可使左旋多巴轉(zhuǎn)變?yōu)槎喟桶?。用左旋多巴治療后，約75%的患者獲得較好療效。治療初期療效更顯。左旋多巴的作用特點(diǎn)是①對(duì)輕癥及較年輕患者療效較好，而重癥及年老衰弱患者療效差；②對(duì)肌肉僵直及運(yùn)動(dòng)困難療效較好，而對(duì)肌肉震顫癥狀療效差，如長(zhǎng)期用藥及較大劑量對(duì)后者仍可見效；③作用較慢，常需用藥2 3周才出現(xiàn)客觀體征的改善，1 6個(gè)月以上才獲得最大療效，但作用持久，且隨用藥時(shí)間延長(zhǎng)而遞增。左旋多巴對(duì)其他原因引起的帕金森綜合征也有效。但對(duì)吩噻嗪類等抗精神病藥所引起的無效，因這些藥有阻斷中樞多巴胺受體的作用。(2)治療肝昏迷肝昏迷發(fā)病學(xué)說中的偽遞質(zhì)學(xué)說認(rèn)為，正常機(jī)體蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)物苯乙胺和酪胺都在肝內(nèi)被氧化解毒。肝功能障礙時(shí)，血中苯乙胺和酪胺升高，在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)經(jīng)羥化酶分別生成偽遞質(zhì)，苯乙醇胺和羥苯乙醇胺(蟑胺)，它們?nèi)〈苏＿f質(zhì)—— 去甲腎上腺素，妨礙神經(jīng)功能。用左旋多巴能在腦內(nèi)轉(zhuǎn)變?nèi)ゼ啄I上腺素。使正常神經(jīng)活動(dòng)得以恢復(fù)，患者可由昏迷轉(zhuǎn)為蘇醒。因不能改善肝功能，作用只是暫時(shí)性的。5、藥物使用L-DOPA為抗震顫麻痹藥。通過血腦屏障進(jìn)入腦組織，經(jīng)多巴脫羧酶脫羧而轉(zhuǎn)變成多巴胺，發(fā)揮作用。L-DOPA用于原發(fā)性震顫麻痹癥及非藥原性震顫麻痹綜合征，對(duì)中、輕度效果較好， 重度或老年人較差。(1)用法與用量
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制劑規(guī)格片劑或膠囊劑0. 25g。口服震顫麻痹，開始0. 25 0. 5g/次，3 4次/日，每隔3 4日增加0. 125 0.5g。維持量3 6g/日，分3 4次服，在劑量遞增過程中如出現(xiàn)惡心等，應(yīng)停止增量，待癥狀消失后再增。如與多巴脫羧酶抑制劑同用，劑量可降低50%。(2)藥代動(dòng)力學(xué)L-DOPA是生物體內(nèi)一種重要的生物活性物質(zhì)，是兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺、去甲腎上腺素或腎上腺素的前體，從L-酪氨酸到兒茶酚或黑色素的生化代謝途徑過程中的重要中間產(chǎn)物，可以直接被兒茶酚胺-0-甲基轉(zhuǎn)移酶(簡(jiǎn)稱C0MT)轉(zhuǎn)化成3-0-甲基多巴 (簡(jiǎn)稱3-0MD)，經(jīng)過脫羧生成多巴胺。這種代謝途徑不存在于健康者體內(nèi)，但是對(duì)于帕金森患者或L-芳香族氨基酸脫羧酶缺乏的病人用來監(jiān)測(cè)外周L-DOPA是很重要的。L-DOPA的代謝途徑如下
權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)精脒/精胺N1-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步驟1)在哺乳動(dòng)物孵化一定量的一種藥物；2)從哺乳動(dòng)物獲得一定組織、細(xì)胞或體液等分析樣品；3)檢測(cè)分析樣品中的乙?；x物，乙?；x物與SSAT活性存在正相關(guān)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)精脒/精胺N1-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的方法，其特征在于，所述的哺乳動(dòng)物包括人或其他動(dòng)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于檢測(cè)精脒/精胺N1-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的方法，其特征在于，所述的其他動(dòng)物包括小鼠、大鼠、羊、猴、牛、豬、馬、兔、犬、黑猩 猩、狒狒、狨、獼猴或恒河猴中的一種或多種。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于檢測(cè)精脒/精胺N1-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的方法，其特征在于，所述的其他動(dòng)物是人、小鼠、大鼠、猴、豬、兔或犬中的一種或多種。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于檢測(cè)精脒/精胺N1-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的方法，其特征在于，所述的其他動(dòng)物是人、大鼠或猴中的一種或多種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)精脒/精胺N1-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的方法，其特征在于，所述的藥物即SSAT底物，是L-多巴。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)精脒/精胺N1-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的方法，其特征在于，所述的孵化是指通過藥物與哺乳動(dòng)物組織或細(xì)胞共孵育。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的用于檢測(cè)精脒/精胺N1-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的方法，其特征在于，所述的藥物的劑量范圍是1 10mg/kg。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用于檢測(cè)精脒/精胺N1-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的方法，其特征在于，所述的藥物的劑量范圍是3 6mg/kg。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)精脒/精胺N1-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的方法，其特征在于，所述的分析樣品是來源于O 24h共孵育的哺乳動(dòng)物的體液樣品或細(xì)胞樣品中的一種或多種。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的用于檢測(cè)精脒/精胺N1-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的方法，其特征在于，所述的分析樣品是來源于10 60min共孵育的哺乳動(dòng)物的體液樣品或細(xì)胞樣品中的一種或多種。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的用于檢測(cè)精脒/精胺N1-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的方法，其特征在于，所述的分析樣品是來源于10 60min共孵育的大鼠肝細(xì)胞。
13.孩、、|艮棚15^丨廁10腿酬〒·_米/撤安N1-&雌誦細(xì)勺規(guī)，胃特征在于，所述的0 24h共孵育的哺乳動(dòng)物的體液樣品是L-多巴進(jìn)入哺乳動(dòng)物體內(nèi)2 24h內(nèi)收集尿液樣本。Η.哲、作艮棚1 駄14腿酬〒翻撒米/撤安Ν1- Z^tmmmmmiim,
14.其特征在于，所述的0 Mh共孵育的哺乳動(dòng)物的體液樣品是L-多巴進(jìn)入哺乳動(dòng)物體內(nèi)他內(nèi)收集尿液樣本。
15.^艮棚1 縣15腿酬〒翻■月米/碰N1- &腦誦刪勺施其特征在于，所述的0 24h共孵育的哺乳動(dòng)物的體液樣品是L-多巴進(jìn)入哺乳動(dòng)物體內(nèi)4h 內(nèi)收集尿液樣本。
16.^/[^ tx^js^ 16 戶；白勺ffl〒&月米 / mm Ν1- ^mwmmij^,其特征在于，所述的0 24h共孵育的哺乳動(dòng)物的體液樣品是L-多巴進(jìn)入哺乳動(dòng)物體內(nèi)池內(nèi)收集尿液樣本。
17.根據(jù)權(quán)利要求1或10所述的用于檢測(cè)精脒/精胺N1-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的方法，其特征在于，所述的體液樣品是包括血液、尿液或唾液中的一種或多種。
18.根據(jù)權(quán)利要求18所述的用于檢測(cè)精脒/精胺N1-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的方法，其特征在于，所述的0 24h共孵育的哺乳動(dòng)物的體液樣品是L-多巴進(jìn)入哺乳動(dòng)物體內(nèi)2 24h內(nèi)收集尿液樣本。
19.；根據(jù)權(quán)利要求19所述的用于檢測(cè)精脒/精胺N1-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的方法，其特征在于，所述的0 24h共孵育的哺乳動(dòng)物的體液樣品是L-多巴進(jìn)入哺乳動(dòng)物體內(nèi)他內(nèi)收集尿液樣本。 ■ Λο
20.@、t根據(jù)權(quán)利要求20所述的用于檢測(cè)精脒/精胺N1-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的方法，其特征在于，所述的0 24h共孵育的哺乳動(dòng)物的體液樣品是L-多巴進(jìn)入哺乳動(dòng)物體內(nèi)4h 內(nèi)收集尿液樣本。
21.^ymmmM 2i腿酬棚則撒米/撤安Ν1- &腦誦刪勺施其特征在于，所述的0 24h共孵育的哺乳動(dòng)物的體液樣品是L-多巴進(jìn)入哺乳動(dòng)物體內(nèi)內(nèi)收集尿液樣本。
22.◎'、Jg根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)精脒/精胺N1-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的方法，其特征在于，所述的檢測(cè)分析樣品中的乙?；x物方法是根據(jù)哺乳動(dòng)物樣品中乙?；x物的測(cè)定量，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定SSAT在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的活性。
23.根據(jù)權(quán)利要求23所述的用于檢測(cè)精脒/精胺N1-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的方法，其特征在于，所述的哺乳動(dòng)物樣品中乙酰化代謝物含量的測(cè)定技術(shù)是包括色譜檢測(cè)方法、 放射性標(biāo)記、質(zhì)譜、紅外、近紅外或紫外檢測(cè)中的一種或多種。
24.根據(jù)權(quán)利要求M所述的用于檢測(cè)精脒/精胺N1-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的方法，其特征在于，所述的色譜檢測(cè)方法是包括氣相色譜、高效液相色譜、薄層色譜、特異性抗體色譜或抗體親和色譜中的一種或多種。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種精脒/精胺N1-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的方法，即通過檢測(cè)SSAT底物的乙?；x物分析SSAT活性的定量技術(shù)。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)SSAT通路中主要或只通過SSAT調(diào)節(jié)N-乙酰化的特異性底物是左旋多巴，而該底物的部分代謝通過SSAT的誘導(dǎo)能產(chǎn)生乙?；x物N-乙酰基-L-多巴，SSAT上調(diào)與癌癥呈正相關(guān)，因此，左旋多巴能作為SSAT上調(diào)所調(diào)節(jié)的癌癥標(biāo)志物，為腫瘤的早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療等方面提供了一種新的檢測(cè)方法。本發(fā)明方法安全有效，實(shí)用性較強(qiáng)，其操作方法方便快捷，使用簡(jiǎn)便，陽性率高，效果顯著，可用于預(yù)防、診斷、檢測(cè)、保護(hù)、治療和研究各類腫瘤的輔助手段。
文檔編號(hào)C12Q1/48GK102344950SQ201110145069
公開日2012年2月8日 申請(qǐng)日期2011年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月31日
發(fā)明者周輝, 李鐵軍, 鄭啟明, 阿曼得·拉希德 申請(qǐng)人:上海拜瑞曼克生物科技有限公司