專利名稱：調(diào)控水稻分蘗的一個dhhc型鋅指蛋白基因及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種調(diào)控水稻分蘗的一個DHHC型鋅指蛋白基因，同時，本發(fā)明還涉及所述基因的應(yīng)用，屬于植物基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
20世紀(jì)50年代后期，矮稈基因sd-Ι的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用引發(fā)了作物生產(chǎn)的“綠色革命””，實現(xiàn)了水稻單產(chǎn)的第一次飛躍。70年代中期，我國發(fā)現(xiàn)水稻野敗型不育系并成功選育了三系配套的雜交水稻。使得我國的水稻單產(chǎn)水平實現(xiàn)了第二次飛躍。以理想株型塑造與雜種優(yōu)勢利用相結(jié)合的新株型水稻品種選育是進一步提高水稻單產(chǎn)的重要方法和有效途徑(程式華等，中國水稻科學(xué)，19 =280-284,2005)。水稻株型是發(fā)揮水稻高產(chǎn)性狀基因的載體，而分蘗是創(chuàng)新水稻株型研究的關(guān)鍵因素之一。分蘗數(shù)目和分蘗角度是水稻分蘗的兩個主要研究內(nèi)容。水稻分蘗調(diào)控基因的分離和鑒定對于水稻分蘗調(diào)控分子機制的解析以及水稻理想株型塑造育種等具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。水稻分蘗的形成過程可分為兩個主要步驟，即分蘗芽的形成和分蘗芽的伸長。目前，在水稻中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多與分蘗形成過程相關(guān)的基因，其中與分蘗芽的形成相關(guān)的基因有MOCl, LAX和SPA等；與分蘗芽的伸長相關(guān)的基因有D3，D10, THD1, OsTBl, 0sNAC2等 (Wang Y, Li J，Annu Rev Plant Biol，59 :253_279，2008)。Li 等(The Plant Journal, 58 :592-605,2009)通過研究小粒多分蘗突變體spl分離出了 SPl基因，發(fā)現(xiàn)該基因編碼一個肽轉(zhuǎn)運蛋白，主要調(diào)節(jié)稻穗的分枝和粒徑的大小。近年研究發(fā)現(xiàn)，獨腳金內(nèi)酯是MAX途徑產(chǎn)生的一種控制植物分枝的新的激素，是腋芽生長調(diào)控途徑中位于生長素下游的負調(diào)節(jié)因子(Gomeζ-Roldan, et al. Nature, 455 189-194，2008)。Lin 等(The Plant Cell, 21 1512-1525,2009)通過研究矮化多分蘗突變體d27分離出了 D27基因，發(fā)現(xiàn)該基因編碼一個狗離子蛋白，參與獨腳金內(nèi)酯(strigolactones)的生物合成，從而調(diào)控水稻的分蘗。最近， Jiao等(NatureGenetics，42 =541-545,2010)分離鑒定了一個理想株型IPA1，發(fā)現(xiàn)該基因編碼OsSPLH蛋白，當(dāng)對OsSPLH基因定點突變后，轉(zhuǎn)化株系分蘗數(shù)減少，表現(xiàn)出明顯的理想株型。水稻分蘗角度是指植株主莖與分蘗之間的夾角，它是決定水稻株型的另一重要因素之一。外界環(huán)境是影響水稻分蘗角度大小的重要因素，尤其光照條件對水稻分蘗角度的形成影響較大。迄今為止，許多與分蘗角度相關(guān)的突變體被分離鑒定出來，如分蘗平臥生長的突變體la，分蘗直立生長的突變體er，株型分散矮化突變體d20等(Wang Y，Li J，Annu RevPlantBiol, 59 :253-279,2008) 李培金等(科學(xué)通報，48 :2271_22741，2003)通過圖位克隆分離了 LAZYl基因，并發(fā)現(xiàn)該基因?qū)χ参锷L激素的極性運輸具有負調(diào)控作用。Yu 等(The Plant Journal, 52 =891-898,2007)分離出一個控制水稻分蘗角度的新基因TAC1， 發(fā)現(xiàn)TACl mRNA水平?jīng)Q定著分蘗角度的大小。Tan等(Nature Genetics, 40 :1360-13641, 2008)克隆了控制野生稻匍匐生長習(xí)性的C2H2型鋅指蛋白基因PR0G1， 發(fā)現(xiàn)該基因主要在腋芽分裂組織表達。
鋅指蛋白在調(diào)控RNA的結(jié)合、轉(zhuǎn)錄、細胞凋亡、蛋白質(zhì)相互作用的生命過程中發(fā)揮重要作用。根據(jù)Cys和His與鋅離子結(jié)合的位點和數(shù)量，有C2H2，，C2C2，，C2HC，C2C2C2C2， C2HCC2C2和DHHC等不同類型的鋅指結(jié)構(gòu)域。其中DHHC型鋅指蛋白是鋅指蛋白大家族中較小的一類，具有DHHC(Asp-His-His-Cys)富含半胱氨酸高度保守的鋅指結(jié)構(gòu)域，多數(shù)家族成員具有蛋白質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶(protein acyltransferase,PAT)活性。目前，DHHC型鋅指蛋白的研究主要集中于酵母和哺乳動物(Jessica, et al. Cell Biology, 170 :1091-1099, 2005)，而在植物中的研究較少。Hemsley 等(The Plant Cell, 17 :2554-2563, 2005)從 tipl突變體中分離和克隆了一個DHHC型鋅指蛋白基因TIP1，發(fā)現(xiàn)鋅指蛋白TIPl有PAT活性，參與調(diào)節(jié)植物細胞的生長。當(dāng)該基因缺失時則會造成根尖的根毛發(fā)育不良。最近，本發(fā)明人通過研究擬南芥多分枝突變體scclO-D分離和鑒定了一個新的DHHC型鋅指蛋白基因AtDHHCl (GenBank accession no. At5g04270)，初步發(fā)現(xiàn)該基因?qū)σ秆康纳L起正調(diào)控作用，同時也揭示了 DHHC型鋅指蛋白的一種全新功能(Xiang，et al. African Journal of Biotechnology, 45 :7759_7766，2010)。由此可見，DHHC型鋅指蛋白在植物的生長發(fā)育及株型調(diào)控中起著非常重要的作用。但是該家族其它成員的功能仍不清楚，特別是水稻中DHHC 型鋅指蛋白對株型調(diào)控的研究還未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種水稻分蘗蛋白及其編碼基因。本發(fā)明所提供的水稻分蘗蛋白，名稱為OsDHHCl，來源于水稻(Oryza sativavar L.)，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的 SEQ ID No 4 和 SEQ ID No 5 ；2)將序列表中SEQ ID No 4和SEQ ID No 5的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與水稻分蘗相關(guān)的蛋白質(zhì)。序列表中的序列4由223個氨基酸殘基組成。序列表中的序列5由272個氨基酸殘基組成。所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。如將序列4自氨基端第76位半光氨酸殘基取代為丙氨酸殘基的與水稻分蘗相關(guān)的蛋白質(zhì)；將序列4自氨基端第76位半光氨酸殘基取代為丙氨酸殘基且將序列4缺失自氨基端第73位-76位氨基酸殘基而得到的由223個氨基酸殘基組成的與水稻分蘗相關(guān)的蛋白質(zhì)；將序列5的自氨基端第125位半光氨酸殘基取代為丙氨酸殘基的與水稻分蘗相關(guān)的蛋白質(zhì)；將序列5的自氨基端第125位半光氨酸殘基取代為丙氨酸殘基且將序列5缺失自氨基端第121位-125位氨基酸殘基而得到的由272個氨基酸殘基組成的與水稻分蘗相關(guān)的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供OsDHHCI和0s02g0819100的編碼基因。OsDHHCI和0s02g0819100的cDNA基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中 SEQ ID No 2 或 SEQ ID No 3 的 DNA 序列；2)編碼序列表中SEQ ID No 4或No 5蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID No 1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；
4)與序列表中SEQ ID No 2或SEQ ID No 3限定的DNA序列具有70%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。序列表中的序列1由1293個堿基組成，其開放閱讀框架(ORF)為自5’端第66位至884位堿基。OsDHHCI的基因組基因，可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID No 1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID No 4或No 5蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID No 1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；4)與序列表中SEQ ID No 1限定的DNA序列具有70%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。序列表中的序列1為OsDHHCI的基因組序列，包含了 1293個堿基，該基因含有2個外顯子(序列1的5，端起:67-189,336-884)，1個內(nèi)含子(序列1的5，端起=190-335)。所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件可為在0. IXSSPE(或0. 1XSS)，0. 1 XSDS的溶液中，在65°C下雜交并洗膜。本發(fā)明還提供含有OsDHHCI和0s02g0819100基因的表達載體，以及含有所述載體的細胞系或宿主菌。OsDHHCI的基因表達為非組成型表達。擴增OsDHHCI和0s02g0819100基因中任意片段的引物也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。可利用所述水稻分蘗相關(guān)蛋白編碼基因中的15個或15個以上連續(xù)堿基的寡核苷酸選育水稻品種。利用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達的載體，將本發(fā)明所提供的水稻分蘗相關(guān)蛋白編碼基因OsDHHCI和0s02g0819100導(dǎo)入植物細胞，可獲得改變植物分枝的轉(zhuǎn)基因細胞系及轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明的基因在構(gòu)建到植物表達載體中時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種一般性啟動子、增強啟動子或誘導(dǎo)型啟動子。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物細胞進行鑒定及篩選，可對所使用的載體進行加工，如加入可選擇性標(biāo)記(GUS基因、GFP、YFP、AsRed和熒光素酶基因等)或具有抗性的抗生素標(biāo)記基因(潮霉素、慶大霉素、卡那霉素、氨芐青霉素、博萊霉素等)。為了轉(zhuǎn)基因植物釋放的安全性，在構(gòu)建植物表達載體時也可不攜帶任何標(biāo)記基因，在苗期進行特定PCR 分子標(biāo)記篩選。含有本發(fā)明的OsDHHCI和0s02g0819100的表達載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)
粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)或基因槍等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物，如水稻、小麥、玉
米、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草、苜蓿等。本發(fā)明的水稻分蘗基因及其蛋白正調(diào)節(jié)分蘗芽的伸長，在水稻理想株型塑和高產(chǎn)育種中具有很高的應(yīng)用價值。本發(fā)明人將該基因超強表達于水稻后，發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)化株系的分蘗數(shù)和有效穗數(shù)顯著增加，產(chǎn)量也顯著提高。因此，本發(fā)明的水稻分蘗基因可以通過基因工程的方法用于增加水稻分蘗數(shù)和有效穗數(shù)，從而達到水稻增產(chǎn)的目的。同時，還可以利用該水稻分蘗基因來調(diào)節(jié)分蘗的發(fā)生，從而使水稻的分蘗發(fā)生理想化，即早期分蘗發(fā)生快，中后期不發(fā)生分蘗，既保證每畝的穗數(shù)，又杜絕無效分蘗，避免浪費營養(yǎng)物質(zhì)，以最終達到光合物質(zhì)的經(jīng)濟產(chǎn)量產(chǎn)出最大化。另外，該水稻分蘗基因及其蛋白的分離和鑒定，可以作為一種重要的分子標(biāo)記用于水稻分子輔助選擇育種，加速水稻高產(chǎn)和理想株型塑造育種的進程。下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明做進一步說明。


圖1為水稻和擬南芥的DHHC型鋅指蛋白的聚類分析。圖2為AtDHHCl和0s02g0819100的氨基酸序列對比。圖3為0s02g0819100和OsDHHCI的基因序列對比。圖4為0s02g0819100和OsDHHCI的氨基酸序列對比。圖5為OsDHHCI的基因結(jié)構(gòu)分析。圖6為OsDHHCI在不同組織內(nèi)的表達分析。圖7為Ttl代OsDHHCI轉(zhuǎn)基因水稻中的Hpt基因檢測。圖8 OSDHHCI過表達植株的表型鑒定及分子檢測，其中，A. OSDHHCI轉(zhuǎn)基因株系的代表植株；B. OsDHHCI在野生型和過表達植株中的表達分析；C.野生型和OSDHHCI過表達植株的分蘗數(shù)統(tǒng)計。
具體實施例方式下述實施例中提到的實驗方法如無特別說明均為常規(guī)方法。1. OsDHHCI基因的克隆最近，我們研究組通過研究擬南芥多分枝突變體scclO-D分離和鑒定了一個新的DHHC型鋅指蛋白基因AtDHHCl (GenBank accession no. At5g04270)，初步發(fā)現(xiàn)該基因?qū)σ秆康纳L起正調(diào)控作用(Xiang，et al. African Journal of Biotechnology,45 7759-7766,2010)。于是我們利用同源對比的方式將AtDHHCl的氨基酸序列在NCBI的水稻數(shù)據(jù)庫中進行blast搜索，共找到了 27個DHHC型鋅指蛋白序列；同時也將AtDHHCl的序列在NCBI的擬南芥數(shù)據(jù)庫中進行blast搜索，共找到^fDHHC型鋅指蛋白序列。然后用分子遺傳進化分析軟件MEGA4. 0. 2對水稻和擬南芥DHHC型鋅指蛋白序列進行分析并構(gòu)建了分子進化樹(圖1)。從樹形圖中可以看出，AtDHHCl與0s02g0819100的序列相似性最高， 處在同一個小分支上，其氨基酸序列相似性高達53% (圖幻。由此可見在水稻中與擬南芥 AtDHHCl基因相似性最高的是0s02g0819100。我們已知AtDHHCl基因在擬南芥中能調(diào)控分枝，于是推測0s02g0819100基因在水稻中也能調(diào)控分蘗。用引物設(shè)計軟件I^rimer Premier 5設(shè)計了特異的引物OSDHHCIQ-F :5，-ATGGCGCGGAGGAGGGGAA-3，OsDHHCIQ-R 5' -TCAGTTGTTTGTGATCTGGAACTCAGTGCC-3，以水稻品種日本晴的cDNA為模板進行PCR擴增0s02g0819100基因的CDS序列。 結(jié)果在電泳檢測時發(fā)現(xiàn)有2條擴增產(chǎn)物帶，一條長約700bp，另一條長約SOObp。約700bp的擴增帶非常亮，而約SOObp的擴增帶比較弱。為了確定哪個片段是本發(fā)明所擴增的目的基因，將2條帶膠回收后亞克隆到pGEM-T vector，并送上海生工生物工程有限公司測序。測
6序結(jié)果顯示，約SOObp片段的序列與NCBI水稻數(shù)據(jù)庫中由電子克隆得到的0s02g0819100 基因序列完全相同；約700bp片段的序列與0s02g0819100基因序列相比少了 113-250位點之間的148bp片段，其他部位的序列完全一致(圖3)。該基因在GenBank中沒有收錄，它有完整的開放閱讀框(ORF)，編碼序列能夠通讀，與0s02g0819100編碼蛋白相比少了 38-86 位點之間的49個氨基酸(圖4)。該研究結(jié)果表明，0s02g0819100基因有2種不同的剪接方式一種較短序列的剪接方式在GenBank中沒有登記，而且是該基因的主要剪接方式，命名為OsDHHCI ；在GenBank中登記的剪接方式仍命名為0s02g0819100。由于GenBank中登記的0s02g0819100序列僅為水稻基因組測序完成后進行序列分析所得的序列，并且功能未知，而本發(fā)明中所提供的OsDHHCI和0s02g0819100經(jīng)過后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)該2種剪接方式均調(diào)控水稻分蘗。2. OsDHHCI基因的分子特征通過比較日本晴的0s02g0819100的cDNA及其基因組DNA序列，發(fā)現(xiàn)OsDHHCI共有 2個外顯子(序列3的5’端起1-112，251-819)，1個內(nèi)含子(序列1的5’端起=113-249)； 其基因組全長為U93bp (見SEQ ID No 1), cDNA全長為672bp (見SEQ ID No:2)，其開放閱讀框架為序列2自5’端第1至672位點共有672個堿基；該基因編碼蛋白長度為223個氨基酸(圖5B)。3. OsDHHCI的表達分析用已經(jīng)克隆出短片段的引物OsDHHClQ-F和OsDHHClQ-R考察水稻成年植株不同組織部位的OsDHHCI基因表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在根、莖和穗中都只能擴增出約700bp的片段， 但是在葉片中既能擴增出約700bp的片段又能擴增出約SOObp的片段(圖6)。為了進一步確認(rèn)該SOObp片段是否為該基因的另一種剪接方式，我們將該條帶通過膠回收后將其克隆到pGEM-T vector，然后送上海生工生物工程有限公司測序，測序結(jié)果顯示該片段序列與 NCBI水稻數(shù)據(jù)庫里的0s02g0819100基因序列完全相同。該結(jié)果說明，OsDHHCI均能在水稻各組織器官中穩(wěn)定表達，尤其在穗中表達量最高，相反0s02g0819100僅在葉片表達，或在其它組織器官表達量很低，以致無法檢測到。4. OsDHHCI基因的功能驗證(1)過量表達載體的構(gòu)建為了驗證OsDHHCI基因的功能，將OSDHHCI的⑶S序列亞克隆到具有相同酶切位點的雙元表達載體PCAMBIA1301上，得到重組質(zhì)粒pCAMBIA1301-0sDHHCl。然后再將該重組質(zhì)粒通過電激方法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(Agrobacterium)菌株EHA105中。(2)愈傷組織的誘導(dǎo)將野生型中花Il(WT)的成熟種子脫殼滅菌，接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 10天。(3)轉(zhuǎn)化和篩選用含有重組質(zhì)粒pCAMBIA1301-0sDHHCl的農(nóng)桿菌菌株浸染水稻愈傷組織，在黑暗處培養(yǎng)3天后，在含有50mg/L潮霉素和450mg/L羧芐青霉素的選擇培養(yǎng)基上篩選抗性愈傷組織，然后于含35mg/L潮霉素的分化培養(yǎng)基上進行分化培養(yǎng)以獲得轉(zhuǎn)基因植株。再生植株經(jīng)煉苗1周后移栽到大田中，并通過PCR檢測潮霉素抗性基因Hpt，確定Ttl代轉(zhuǎn)基因陽性植株(圖7)。本實施例中，共獲得了 23個獨立陽性轉(zhuǎn)化株系(Ttl)。
(4)表型鑒定單株收取Ttl代種子，在水中浸種2天后，移入37°C培養(yǎng)間催芽3天，然后將露白的種子播在裝有濾紙的培養(yǎng)皿中，用100 mg/L的潮霉素篩選1周。一周后統(tǒng)計各轉(zhuǎn)化株系潮霉素抗性苗和敏感性苗的分離比，根據(jù)孟德爾遺傳規(guī)律確定其T-DNA插入拷貝數(shù)。然后將抗性苗移栽至苗床上育秧，于4葉期移栽入大田。同時，還可以通過常規(guī)分子檢測以獲得 T1代轉(zhuǎn)基因植株。然后于整個生長發(fā)育期考察各轉(zhuǎn)基因植株的農(nóng)藝性狀，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在23個 OsDHHCI超強表達株系(OeOsDHHCl) (T1)中，共有15個株系的分蘗數(shù)和有效穗數(shù)比野生型明顯增加(圖8A-C，表1)，而且其產(chǎn)量也增加了 10-30% (圖8D和E，表1)。該結(jié)果說明， OsDHHCI能夠促進水稻的分蘗，從而達到增加有效穗數(shù)和產(chǎn)量的目的，在水稻理想株型塑和高產(chǎn)育種中具有很高的應(yīng)用價值。表1.部分OSDHHCI超強表達株系的農(nóng)藝性狀統(tǒng)計
權(quán)利要求
1.一種水稻分蘗相關(guān)蛋白，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID No 4 或 SEQ ID No 5 ；2)將序列表中SEQID No 4或SEQ ID No 5的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加，且仍然具有水稻分蘗相關(guān)蛋白活性。
2.—種權(quán)利要求1所述的水稻分蘗相關(guān)蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述水稻分蘗相關(guān)蛋白的cDNA基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQID No 2或SEQ ID No 3的DNA序列；2)編碼序列表中SEQID No 4或SEQ ID No 5蛋白質(zhì)序列的多核苷酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述水稻分蘗蛋白的基因組基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQID No 1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQID No 4或SEQ ID No 5蛋白質(zhì)序列的多核苷酸。
5.一種含有權(quán)利要求2至4任一項所述的水稻分蘗蛋白編碼基因的表達載體。
6.一種含有權(quán)利要求5所述表達載體的細胞系或宿主菌。
7.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，其特征在于利用權(quán)利要求5所述的表達載體導(dǎo)入植物細胞，培育出增加分蘗數(shù)和有效穗數(shù)的轉(zhuǎn)基因植物。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述植物是水稻。
全文摘要
本發(fā)明公開了一個調(diào)控水稻分蘗的一個DHHC型鋅指蛋白基因OsDHHC1及應(yīng)用，屬于植物基因工程領(lǐng)域。OsDHHC1基因具有正調(diào)控水稻分蘗從而構(gòu)建理想株型的能力。通過基因工程技術(shù)提高OsDHHC1基因的表達量能夠增加水稻分蘗的數(shù)量從而達到提高水稻產(chǎn)量的目的。因此，OsDHHC1的分離和鑒定對將來闡明水稻分蘗調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子機制具有一定的理論和現(xiàn)實意義，同時OsDHHC1基因在塑造理想水稻株型和培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的水稻品種兩個方面有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/63GK102229661SQ20111014839
公開日2011年11月2日 申請日期2011年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月3日
發(fā)明者劉選明, 周波, 唐冬英, 彭丹, 林建中 申請人:湖南大學(xué)