專利名稱：一種單核釕配合物及其制備方法和在活細胞染色中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細胞成像試劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種單核釕配合物及其制備方法和在活細胞染色中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著激光共聚焦熒光顯微鏡技術(shù)的不斷發(fā)展，人們對細胞的研究日益深入，適合的生物成像試劑的開發(fā)激起科學(xué)家們的極大興趣。目前，應(yīng)用于細胞成像領(lǐng)域的商用熒光染料大部分是一些有機小分子，如PI，DAPI, EB, Hoechst等。然而，這些有機分子存在一些缺點水溶性比較低，容易產(chǎn)生沉淀或者與細胞作用后即刻析出，影響染色效果；具有比較高的細胞毒性，染料與細胞作用后，導(dǎo)致細胞的死亡，影響對細胞正常狀態(tài)的觀測；光穩(wěn)定性低，因受空氣中或介質(zhì)中活性劑基團(單線態(tài)氧等)的作用，染料在激發(fā)波長照射后，熒光不斷減弱，光漂泊現(xiàn)象嚴(yán)重，不利于成像穩(wěn)定；激發(fā)和發(fā)射光譜的交叉嚴(yán)重(stoke shif 小)，一般在幾十個納米左右，不利于區(qū)分內(nèi)源熒光和降低染料本身的自淬滅?；谟袡C染料存在的若干缺點，人們更多的把目光轉(zhuǎn)向具有優(yōu)良光電屬性的過渡金屬配合物上。金屬配合物憑借著其優(yōu)良的光化學(xué)性質(zhì)，用于細胞成像試劑方面具有其獨特的優(yōu)點。近年來，釕多吡啶配合物與DNA作用得到廣泛的研究。釕多吡啶配合物在水溶液中不發(fā)射熒光，但與DNA作用后，熒光大大增強，具有明顯的光開關(guān)效應(yīng)。這種具有分子光開關(guān)效應(yīng)的釕配合物具有背景熒光低、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、水溶性強、激發(fā)和發(fā)射光譜stoke位移大且在長波區(qū)的特點，可直接用于細胞內(nèi)核酸的染色，是潛在的優(yōu)良的DNA染色試劑(M. Matson, F. R. Svensson, B. Norden and P. Lincoln. J. Phys. Chem. B 2011，115，1706—1711; )。這些具有分子光開關(guān)性質(zhì)配合物的細胞吸收及其細胞染色研究已經(jīng)初步開始。 Barton J. K.工作組研究[Ru(bpy)2dppz]2+和[Ru(phen)2dppz]2+的細胞吸收發(fā)現(xiàn)配合物穿越細胞膜比較困難。配合物進入細胞的能力與其疏水性成正比，配合物主要集中在細胞質(zhì)部位，細胞核內(nèi)熒光并沒有發(fā)現(xiàn)增強(A. Puckett Cindy and K. Barton Jacqueline. J. Am. Chem. Soc. 2007，129，46—47)。Palaniandavar Μ.工作組發(fā)現(xiàn)[Ru (phen)2dppz]2+ 可以快速進入死細胞，可以區(qū)別不同的細胞組分，是良好的死細胞染料(V. Rajendiran, M. Palaniandavar, V. S. Periasamy and Μ. A. Akbarsha. J. Inorg. Biochem. 2010, 104，217-220)。對dppz配體上修飾燒基醚后，可以加強其細胞膜滲透性(F. R. Svensson, M. Li, B. Norden and P. Lincoln. J. Phys. Chem. B 2008，112，10969—10975; F. R. Svensson, Μ. Matson, Μ. Li and P. Lincoln. Biophys. Chem. 2010, 149, 102—106)。 將dppz的苯環(huán)末端修飾不同長度的烷基醚(-OC2H5，-OC4H9，-OC6H13),其表現(xiàn)不同的染色效果。對甲醇固定后的細胞，親脂性最強的配合物(-OC6H13)傾向于染細胞膜，中等親脂性的配合物(-OC4H9)富集在核仁的RNA區(qū)域，而親脂性最弱的(-OC2H5)專染核仁的DNA區(qū)域。 其細胞內(nèi)定域的選擇性與鍵合的選擇性有關(guān)(M. Ardhammar, P. Lincoln and B. Norden. J. Phys. Chem. B 2001，105，11363-11368)。
由于釕多吡啶配合物因其較弱的細胞遷移率，很難超越完整的細胞膜，因此限制其在活細胞生物成像領(lǐng)域的研究，目前發(fā)現(xiàn)雙核Ru-dppz配合物作為DNA的雙插入試劑在電穿孔的條件下可以對V79 Chinese hamster cells活細胞的細胞質(zhì)染色(Μ. Ε. Jimenez-Hernandez, G. Orellana, F. Montero and Μ. Τ. Portoles. Photochem. Photobiol. 2000， 72， 28—34; B. Onfelt, L. Gostring, P. Lincoln, B. Norden and A. Onfelt. Mutagenesis 2002, 17，317_320)。dppz衍生物橋連的雙核[Ru(phen)2tpphz] (tpphz = tetrapyrido[3, 2~a:2' , 3' -c:3' ' , 2' ' -h:2' ' ' , 3' ' ' -j] phenazine)，可以作為活細胞DNA染料(Μ· R. Gill, J. Garcia-Lara, S. J. Foster, C. Smythe, G. Battaglia and J. A. Thomas. Nat. Chem. 2009, 1，662-667)，是優(yōu)良的活細胞成像試劑。單核釕多吡啶配合物作為活細胞染色則很少有報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，提供一種具有良好分子光開關(guān)性能的噻二唑配體的釕多吡啶配合物，在無需細胞預(yù)處理(電穿孔或溶劑固定)的條件下，可以成功的對活細胞中細胞核著色，且具有培育時間短，染色靈敏度高的特點，在生物標(biāo)記和細胞成像方面將有極大的應(yīng)用潛力。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)上述目的
一種單核釕配合物，其陽離子部分為[Ru(tdp)3] 2+或[RU(tdp)2dppz]2+，[Ru(tdp)3] 2+ 結(jié)構(gòu)式如I，[Ru(tdp)2dppz]2+結(jié)構(gòu)式如II，陰離子部分為
權(quán)利要求
1. 一種單核釕配合物，其特征在于陽離子部分為[Ru(tdp)3] 2+或[RU(tdp)2dppz]2+， [Ru(tdp)3] 2+結(jié)構(gòu)式如I，[Ru(tdp)2dppz]2+結(jié)構(gòu)式如II，陰離子部分為(ClO4)、Cl—或 (PF6) 一，式I式II。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單核釕配合物，其特征在于該配合物化學(xué)式為[Ru(tdp)3] (ClO4)2 或[Ru(tdp)2dppz] (ClO4) 2。
3.權(quán)利要求1所述單核釕配合物的制備方法，其特征在于當(dāng)單核釕配合物陽離子部分為[Ru(tdp)3] 2+時，制備步驟如下(1)以1，10-鄰菲羅啉為原料，合成5，6-二氨基-鄰菲羅啉，產(chǎn)物溶于CH2Cl2中，加入三乙胺攪拌、溶解，滴加SOCl2，繼續(xù)回流4小時，減壓濃縮除掉溶劑后再加入水中，加入鹽酸調(diào)至酸性，混合液用CH2Cl2萃取3次，再用水洗滌兩次，再用無水Na2SO4干燥過夜，過濾， 得到tdp ；(2)以RuCl3·ηΗ20和DMSO為原料，合成Ru (DMSO)4C12，再與tdp溶于甲醇中，加熱攪拌回流反應(yīng)6小時，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除掉甲醇，剩余產(chǎn)物溶于丙酮，再加入乙醚，過濾后用乙醚洗滌， 干燥，得[Ru (DMSO) 4tdp] 2+；(3)[Ru(DMSO)4tdp] 2+和tdp加入到乙二醇中，氬氣保護下120°C加熱回流6小時，得紫紅色清液，冷卻至室溫后過濾去除不溶物，將濾液濃縮至原體積的一半，再加水稀釋至原體積，然后滴加權(quán)利要求1所述陰離子無機鹽的飽和溶液產(chǎn)生沉淀，抽濾，先后用水、乙醇和乙醚洗滌，過柱用甲苯與乙腈體積比為1:2的混合液沖洗，真空干燥，得[Ru(tdp)3] 2+。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于步驟(1)所述酸性是pH值為2。
5.權(quán)利要求1所述單核釕配合物的制備方法，其特征在于當(dāng)單核釕配合物陽離子部分為[Ru(tdp)2dppz] 2+時，制備步驟如下(1)以RuCl3· ηΗ20和DMSO為原料，合成Ru (DMSO) 4C12，再與dppz溶于甲醇中，加熱攪拌回流反應(yīng)30分鐘，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除掉甲醇，剩余產(chǎn)物溶于丙酮，再加入乙醚，過濾后用乙醚洗滌，干燥，得[Ru(DMSO)4dppz] 2+；(2)將[Ru(DMSO)4dppz]2+和dppz加入到乙二醇中，氬氣保護下120°C加熱回流6小時， 得紫紅色清液，冷卻至室溫，過濾去除不溶物，將濾液濃縮至原體積的一半，再加水稀釋至原體積，滴加權(quán)利要求1所述陰離子無機鹽的飽和溶液產(chǎn)生沉淀，抽濾，先后用水、乙醇和乙醚洗滌，過柱用甲苯與乙腈體積比為1:3的混合液沖洗，真空干燥，得[Ru(tdp)2dppz] 2+。
6.權(quán)利要求1所述單核釕配合物在活細胞染色中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述活細胞染色為活細胞的細胞核染色。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種單核釕配合物及其制備方法和在活細胞染色中的應(yīng)用。該配合物陽離子部分為[Ru(tdp)3]2+或[Ru(tdp)2dppz]2+，陰離子部分為(ClO4)－、Cl－或(PF6)－，其中陽離子為[Ru(tdp)3]2+的配合物制備方法是以tdp與Ru(DMSO)4Cl2反應(yīng)得[Ru(DMSO)4tdp]2+，再和tdp加入到乙二醇中加熱回流反應(yīng)，冷卻后過濾，滴加NaClO4飽和溶液到濾液中沉淀，經(jīng)抽濾、洗滌、過柱得[Ru(tdp)3]2+的配合物。將tdp替換為dppz即得陽離子為[Ru(tdp)2dppz]2+的配合物。本發(fā)明的單核釕配合物無需細胞預(yù)處理即可對活細胞中細胞核著色，且培育時間短，染色靈敏度高，在生物標(biāo)記和細胞成像方面將有極大的應(yīng)用潛力。
文檔編號C12Q1/02GK102260296SQ20111015058
公開日2011年11月30日 申請日期2011年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月7日
發(fā)明者巢暉, 李呂瑩, 計亮年, 許文超 申請人:中山大學(xué)