專利名稱：一種去除免疫球蛋白的新生牛血清生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新生牛血清的生產(chǎn)方法，特別是一種能去除免疫球蛋白的新生牛血清生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
新生牛血清是指出生14h之內(nèi)的未吃初乳的犢牛血清，也有人稱之為小牛血清或犢牛血清。新生牛血清具有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入適量新生牛血清可以補(bǔ)充細(xì)胞生長所需的生長因子、激素、貼附因子等；新生牛血清還具有解毒作用，能解除脂肪酸、重金屬和某些蛋白酶的毒性；此外，新生牛血清還具有抑制胰蛋白酶的作用，可以保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損傷。因此，新生牛血清對細(xì)胞的生長有重要促進(jìn)作用，是細(xì)胞培養(yǎng)基的重要組成部分。牛血清中的免疫球蛋白(抗體)對細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生毒性作用，如果新生牛血清含有大量免疫球蛋白(抗體)則會(huì)嚴(yán)重影響細(xì)胞的生長；其次，國內(nèi)麻疹、風(fēng)疹、腮腺炎、乙型腦炎、 水痘、狂犬病等諸多病毒性疫苗均采用細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)，細(xì)胞培養(yǎng)液中必須加入一定量新生牛血清，如果新生牛血清中有抗相應(yīng)病毒的免疫球蛋白(抗體)存在，將會(huì)嚴(yán)重影響病毒性疫苗的質(zhì)量。目前，在新生牛血清產(chǎn)品生產(chǎn)領(lǐng)域，多數(shù)廠家只采取微濾除細(xì)菌、除支原體的工藝，所用微濾膜膜孔徑為0. 1 0. 2微米范圍。中國專利號92103702. 3公開了無支原體新生牛血清生產(chǎn)工藝，在除菌過濾工序后，再使用0.08-0. 12微米的濾膜進(jìn)行過濾。由于微濾膜孔孔徑較大，此工藝僅能夠去除血清中的細(xì)菌、霉菌、支原體等微生物，但不能去除血清中的免疫球蛋白。牛的胎盤屏障不能通過母源免疫球蛋白，健康新生牛如果不吃初乳，其血清中免疫球蛋白含量很低。但如果有傳染因子進(jìn)入時(shí)，新生牛血清中就會(huì)出現(xiàn)大量免疫球蛋白。以牛病毒性腹瀉/黏膜病(BVDV/MDV)感染為例，母牛在妊娠期感染牛病毒性腹瀉病毒(BVDV) 時(shí)、在出生14h以內(nèi)的新生牛血清中可以檢出BVDV/MDV抗體。據(jù)有關(guān)調(diào)查資料報(bào)道，目前國內(nèi)荷斯坦新生牛血清BVDV/MDV抗體平均陽性率分別達(dá)25%和30%。BVDV是細(xì)胞培養(yǎng)和生物制品的首要污染因素之一，BVDV與豬瘟病毒(CSFV)同屬黃病毒科瘟病毒屬，親緣關(guān)系密切，在血清學(xué)上有交叉反應(yīng)，新生牛血清中如有BVDV抗體存在，將嚴(yán)重影響豬瘟疫苗的效價(jià)和保護(hù)率。中國專利號200510042714. X公開了一種豬瘟疫苗生產(chǎn)用/牛病毒性腹瀉病毒抗體陰性新生牛血清生產(chǎn)工藝，采用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，篩選出BVDV抗體陰性的粗制血清進(jìn)行加工生產(chǎn)，此工藝BVDV抗體檢測過程操作繁瑣、耗材多、對每份血清都需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)檢測，工作量大、生產(chǎn)成本高。該工藝對于新生犢牛來源集中、小批量生產(chǎn)新生牛血清尚可實(shí)施，而對于目前國內(nèi)新生犢牛來源分散、需要大批量生產(chǎn)新生牛血清的現(xiàn)實(shí)情況， 則很難實(shí)施
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對上述方法提出的不足，提供了一種能耗低、操作簡便、能去除免疫球蛋白并實(shí)現(xiàn)大批量生產(chǎn)的新生牛血清生產(chǎn)方法。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種去除免疫球蛋白的新生牛血清生產(chǎn)方法，其工藝流程包括無菌采血，分離血清，膜過濾，所述膜過濾使用的膜為陶瓷復(fù)合膜。所述陶瓷復(fù)合膜膜管由合肥世杰膜工程有限責(zé)任公司提供。所述陶瓷復(fù)合膜材質(zhì)為氧化鋯、氧化鋁和氧化鈦。所述陶瓷復(fù)合膜的性能參數(shù)分別為①耐壓強(qiáng)度1. OMpa ；②適用pH值0_14 ；③ 適用溫度-10°C -650°c。所述膜過濾包括三道過濾工序，按以下先后步驟進(jìn)行①將分離血清后得到的新生牛血清用膜孔徑0. 2-0. 4微米的陶瓷復(fù)合膜進(jìn)行第一次過濾，去除新生牛血清融凍時(shí)形成的凝固物；過濾前先將膜管置高溫蒸汽壓力滅菌鍋內(nèi)，在蒸汽溫度115°C _125°C、壓力0. IMpa-O. 15Mpa條件下滅菌20-30分鐘，待膜管冷卻至常溫時(shí)過濾新生牛血清，過濾過程中，調(diào)節(jié)回流管閥門控制回流液流量，使膜管進(jìn)口流體壓力與出口流體壓力差保持在0. 2MPa，流體溫度彡40°C，將第一次過濾收集得到的新生牛血清濾液立即進(jìn)行第二次過濾；②第二次過濾用膜孔徑0. 1-0. 2微米的陶瓷復(fù)合膜進(jìn)行過濾，去除牛血清中的細(xì)菌、霉菌、支原體等大分子物質(zhì)；過濾前將膜管置高溫蒸汽壓力滅菌鍋內(nèi)，在蒸汽溫度 115°C _125°C、壓力0. IMpa-O. 15Mpa條件下滅菌20-30分鐘，待膜管冷卻至常溫時(shí)過濾新生牛血清，過濾過程中，調(diào)節(jié)回流管閥門控制回流液流量，使膜管進(jìn)口流體壓力與出口流體壓力差保持在0. 2MPa，流體溫度< 40°C，將第二次過濾收集得到的新生牛血清濾液立即進(jìn)行第三次過濾；③第三次過濾用膜孔徑0. 01-0. 05微米的陶瓷復(fù)合膜進(jìn)行過濾，去除牛血清中的免疫球蛋白；過濾前將膜管置高溫蒸汽壓力滅菌鍋內(nèi)，在蒸汽溫度115°C _125°C、壓力 0. IMpa-O. 15Mpa條件下滅菌20-30分鐘，待膜管冷卻至常溫時(shí)過濾新生牛血清，過濾過程中，調(diào)節(jié)回流管閥門控制回流液流量，使膜管進(jìn)口流體壓力與出口流體壓力差保持在 0. 2MPa，流體溫度< 40°C ；過濾收集得到的血清濾液即為無免疫球蛋白的新生牛血清，其免疫球蛋白去除率達(dá)100%。第一次過濾優(yōu)選膜孔徑0. 2微米的陶瓷復(fù)合膜。第二次過濾優(yōu)選膜孔徑0. 1微米的陶瓷復(fù)合膜。第三次過濾優(yōu)選膜孔徑0. 05微米的陶瓷復(fù)合膜。該方法在細(xì)胞培養(yǎng)用新生牛血清、小牛血清、犢牛血清或胎牛血清生產(chǎn)的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果是1.本發(fā)明根據(jù)新生牛血清白蛋白和免疫球蛋白兩組蛋白質(zhì)的分子大小存在差異的特點(diǎn)(新生牛血清白蛋白的平均分子量約75-65kD;免疫球蛋白IgG平均分子量為 150kD、IgM分子量為1000kD、IgA分子量為400kD)，采用膜孔孔徑0. 01-0. 05微米的陶瓷復(fù)合膜過濾新生牛血清，可以將新生牛血清中的白蛋白和免疫球蛋白分離。經(jīng)陶瓷復(fù)合膜過濾后的新生牛血清，去除了對細(xì)胞生長有害的免疫球蛋白，保留了對細(xì)胞生長有益的血清白蛋白、小分子肽、氨基酸、微量元素等小分子物質(zhì)。
2.本發(fā)明使用陶瓷復(fù)合膜過濾，無需對每份血清都進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)檢測，能耗低，操作簡便，可實(shí)現(xiàn)無免疫球蛋白新生牛血清的大批量生產(chǎn)。3.本發(fā)明所使用的陶瓷復(fù)合膜是以無機(jī)陶瓷材制備而成的非對稱膜，具有耐酸、 耐堿、耐高溫的特點(diǎn)，膜管能承受高溫和高壓、通過蒸汽高溫高壓消毒，能夠殺死存在于膜管的細(xì)菌及芽孢，可避免過濾血清時(shí)由膜管造成的污染。同時(shí)，陶瓷復(fù)合膜管的抗污染能力強(qiáng)，分離過程中無二次溶出物產(chǎn)生，不會(huì)造成血清異物污染。陶瓷復(fù)合膜管還具有機(jī)械強(qiáng)度大，不會(huì)發(fā)生膜孔溶漲而導(dǎo)致截留性能的變化，膜再生性能好，清洗后膜通量恢復(fù)穩(wěn)定。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不局限于實(shí)施例表示的范圍。實(shí)施例1.新生牛血清采集首先對新生牛血清來源的牛群進(jìn)行健康狀況調(diào)查，選擇無特定病原的黑白花奶牛生下的健康新生公牛(新生公牛不能吃初乳)，通過無菌手術(shù)的方法在新生公牛頸靜脈采血，將采集到的新生牛血液用大容量冷凍離心機(jī)分離血清，將分離得到的牛血清置_20°C冷凍保存?zhèn)溆谩?.新生牛血清過濾將冷凍保存的新生牛血清解凍后進(jìn)行過濾。①第一次過濾新生牛血清，選取膜孔徑0. 2微米、膜管面積0. 5m2的陶瓷復(fù)合膜過濾裝置，膜管置高溫蒸汽壓力滅菌鍋內(nèi)，在蒸汽溫度120°C、壓力0. IMPa條件下滅菌30分鐘，待膜管冷卻至常溫時(shí)過濾新生牛血清，過濾時(shí)，調(diào)節(jié)回流管閥門控制回流液流量，使膜管進(jìn)口流體壓力與出口流體壓力差保持在0. 2MPa，流體溫度彡40°C ；將收集得到的濾液立即進(jìn)行第二次過濾。②第二次過濾新生牛血清，選取膜孔徑0. 1微米、膜管面積0. 5m2的陶瓷復(fù)合膜過濾裝置，膜管置高溫蒸汽壓力滅菌鍋內(nèi)，在蒸汽溫度120°C、壓力0. IMPa條件下滅菌30分鐘，待膜管冷卻至常溫時(shí)過濾新生牛血清，過濾時(shí)，調(diào)節(jié)回流管閥門控制回流液流量，使膜管進(jìn)口流體壓力與出口流體壓力差保持在0. 2MPa，流體溫度彡40°C ；將收集得到的濾液立即進(jìn)行第三次過濾。③第三次過濾新生牛血清，選取孔徑0. 05微米、膜管面積0. 5m2的陶瓷復(fù)合膜過濾裝置，膜管置高溫蒸汽壓力滅菌鍋內(nèi)，在蒸汽溫度120°C、壓力0. IMPa條件下滅菌30分鐘，待膜管冷卻至常溫時(shí)過濾新生牛血清，過濾時(shí)，調(diào)節(jié)回流管閥門控制回流液流量，使膜管進(jìn)口流體壓力與出口流體壓力差保持在0. 2MPa，流體溫度彡40°C ；收集得到的濾液為無免疫球蛋白新生牛血清。3.膜過濾后的新生牛血清產(chǎn)品檢測感官判斷取新生牛血清樣品透光觀察新生牛血清液體有無混有異物及判斷液體澄明度，襯白色背景觀察新生牛血清樣品顏色，注意有無溶血。無菌檢驗(yàn)
(1)需氧菌的檢測抽取8份新生牛血清樣品，將新生牛血清接種于含5%鮮兔血酪胨瓊脂斜面2支，每支接種新生牛血清0. 2毫升，1支置于37°C，1支置于25°C ；另用1支葡萄糖蛋白胨水(G. P)，接種0. 2毫升，置25°C，均培養(yǎng)5天，觀察有無細(xì)菌生長。(2)厭氧菌的檢測抽取8份新生牛血清樣品，將新生牛血清接種于厭氣肉肝湯1 支，接種新生牛血清0. 2毫升，置于37°C培養(yǎng)3天，觀察有無菌生長。支原體檢測抽取8份新生牛血清樣品，將新生牛血清接種于改良Frey氏液體培養(yǎng)瓶2管，每瓶含培養(yǎng)液10毫升，接種新生牛血清0. 2毫升，放37°C培養(yǎng)，每天觀察有無顏色變化。如在 5-7天內(nèi)未見變化再從培養(yǎng)瓶取0. 5毫升接種于含培養(yǎng)液30毫升的培養(yǎng)瓶中，37°C培養(yǎng)觀察，如此重復(fù)3次，若無變化則在最后一次接種的培養(yǎng)管經(jīng)14天觀察，若無顏色變化為無支原體污染血清。細(xì)菌內(nèi)毒素檢測抽取3份新生牛血清樣品，使用廈門市鱟試劑試驗(yàn)廠生產(chǎn)的內(nèi)毒素檢測試劑盒 (終點(diǎn)顯色法)檢測新生牛血清內(nèi)毒素含量。免疫球蛋白含量測定抽取3份新生牛血清樣品，使用南京建成生物工程研究所提供的血清總蛋白質(zhì)含量檢測試劑盒(雙縮脲法)和血清白蛋白含量檢測試劑盒(溴甲酚綠法)，分別檢測新生牛血清總蛋白質(zhì)含量和新生牛血清白蛋白含量。血清免疫球蛋白含量=血清總蛋白質(zhì)含量-血清白蛋白含量。牛病毒性腹瀉/黏膜病(BVDV/MDV)抗體檢測抽取3份新生牛血清樣品，使用IDEXX公司提供的HerdChek牛病毒性腹瀉抗體檢測試劑盒(ELISA法)檢測牛病毒性腹瀉/黏膜病(BVDV/MDV)抗體。細(xì)胞生長曲線峰值檢測(1)取生長良好接近匯合的細(xì)胞，用胰酶消化，用新培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液后計(jì)數(shù)。(2)將細(xì)胞以2X IO4濃度接種于2個(gè)對孔板，分別用含10%新生牛血清血清的 DMEM，37 °C、5 % 二氧化碳、飽和濕度下進(jìn)行培養(yǎng)。(3) 24h后開始計(jì)數(shù)細(xì)胞，以后每隔24h計(jì)數(shù)一次，每次取3孔細(xì)胞，分別進(jìn)行計(jì)數(shù)。 計(jì)算平均值，連續(xù)計(jì)數(shù)8d。(4)根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，以單位細(xì)胞數(shù)(細(xì)胞數(shù)/mL)為縱坐標(biāo)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制生長曲線。細(xì)胞倍增時(shí)間檢測按生長曲線計(jì)算細(xì)胞的倍增時(shí)間。取細(xì)胞峰值前一天計(jì)得的數(shù)(Y)、接種細(xì)胞數(shù) ⑴及生長時(shí)間⑴計(jì)算。倍增時(shí)間=T/AA = Iog2 Υ/Χ細(xì)胞克隆率檢測(1)取對數(shù)生長期SP2/0細(xì)胞，用0. 25%胰蛋白酶消化，待細(xì)胞收縮變圓，用吸管吹打，制成單個(gè)細(xì)胞懸液。(2)對細(xì)胞計(jì)數(shù)，并對其倍數(shù)稀釋。(3)進(jìn)一步稀釋，使?jié)舛葹?0細(xì)胞/ml。
(4)將細(xì)胞接種于兩塊96孔板，每孔加入0. 1ml，分別用含10%小牛血清和胎牛血清的DMEM進(jìn)行培養(yǎng)。(5) 24h后用顯微鏡觀察各孔細(xì)胞數(shù)，挑選只含一個(gè)細(xì)胞的孔，做好標(biāo)記并進(jìn)行記錄。(6)對標(biāo)記孔進(jìn)行觀察并持續(xù)培養(yǎng)。(7)培養(yǎng)兩周后，記數(shù)含單克隆的培養(yǎng)孔數(shù)?？寺÷?含單克隆培養(yǎng)孔數(shù)目/培養(yǎng)24h含單個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)孔數(shù)目X 100%4.膜過濾后的新生牛血清檢測結(jié)果外觀性狀淡黃色澄明液體、無溶血無菌檢驗(yàn)無需氧菌和厭氧菌生長支原體檢測無支原體污染細(xì)菌內(nèi)毒素檢測細(xì)菌內(nèi)毒素< 0. lEu/ml免疫球蛋白含量免疫球蛋白含量< 0. 01mg/ml牛病毒性腹瀉/黏膜病(BVDV/MDV)抗體陰性細(xì)胞最大濃度1. 86 X IO6SP2/0細(xì)胞倍增時(shí)間3. 12h單克隆效率50/66X100%= 75. 8%。
權(quán)利要求
1.一種去除免疫球蛋白的新生牛血清生產(chǎn)方法，其工藝流程包括無菌采血，分離血清和膜過濾，其特征是所述膜過濾采用的膜為陶瓷復(fù)合膜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的去除免疫球蛋白的新生牛血清生產(chǎn)方法，其特征是所述膜過濾包括三道過濾工序，按以下先后步驟進(jìn)行①將分離血清后得到的新生牛血清用膜孔徑0.2-0. 4微米的陶瓷復(fù)合膜進(jìn)行第一次過濾；②將第一次過濾后得到的新生牛血清用膜孔徑0.1-0. 2微米的陶瓷復(fù)合膜進(jìn)行第二次過濾；③將第二次過濾后得到的新生牛血清用膜孔徑0.01-0. 05微米的陶瓷復(fù)合膜進(jìn)行第三次過濾，所得濾液即為無免疫球蛋白的新生牛血清。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的去除免疫球蛋白的新生牛血清生產(chǎn)方法，其特征是第一次過濾用膜孔徑0. 2微米的陶瓷復(fù)合膜；第二次過濾用膜孔徑0. 1微米的陶瓷復(fù)合膜；第三次過濾用膜孔徑0. 05微米的陶瓷復(fù)合膜。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的去除免疫球蛋白的新生牛血清生產(chǎn)方法，其特征是 第一次過濾前先將膜管置高溫蒸汽壓力滅菌鍋內(nèi)，在蒸汽溫度115°C _125°C、壓力 0. IMpa-O. 15Mpa條件下滅菌20-30分鐘，待膜管冷卻至常溫時(shí)過濾新生牛血清，過濾過程中，調(diào)節(jié)回流管閥門控制回流液流量，使膜管進(jìn)口流體壓力與出口流體壓力差保持在 0. 2MPa，流體溫度彡40°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的去除免疫球蛋白的新生牛血清生產(chǎn)方法，其特征是第二次過濾前將膜管置高溫蒸汽壓力滅菌鍋內(nèi)，在蒸汽溫度115°C _125°C、壓力0. IMpa-O. 15Mpa 條件下滅菌20-30分鐘，待膜管冷卻至常溫時(shí)過濾新生牛血清，過濾過程中，調(diào)節(jié)回流管閥門控制回流液流量，使膜管進(jìn)口流體壓力與出口流體壓力差保持在0. 2MPa，流體溫度彡 40°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的去除免疫球蛋白的新生牛血清生產(chǎn)方法，其特征是第三次過濾前將膜管置高溫蒸汽壓力滅菌鍋內(nèi)，在蒸汽溫度115°C _125°C、壓力0. IMpa-O. 15Mpa 條件下滅菌20-30分鐘，待膜管冷卻至常溫時(shí)過濾新生牛血清，過濾過程中，調(diào)節(jié)回流管閥門控制回流液流量，使膜管進(jìn)口流體壓力與出口流體壓力差保持在0. 2MPa，流體溫度彡 40°C。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的去除新生牛血清免疫球蛋白的方法，其特征是所述陶瓷復(fù)合膜材質(zhì)為氧化鋯、氧化鋁和氧化鈦。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的去除新生牛血清免疫球蛋白的方法，其特征是所述陶瓷復(fù)合膜的性能參數(shù)分別為①耐壓強(qiáng)度1. OMpa;②適用pH值0-14;③適用溫度-10°C -650°C。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的去除新生牛血清免疫球蛋白的方法，其特征是該方法在細(xì)胞培養(yǎng)用新生牛血清、小牛血清、犢牛血清或胎牛血清生產(chǎn)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新生牛血清的生產(chǎn)方法，特別是一種能去除免疫球蛋白的新生牛血清生產(chǎn)方法。本方法先后采用膜孔徑為0.2-0.4微米、0.1-0.2微米以及0.01-0.05微米的陶瓷復(fù)合膜過濾新生牛血清。使用本方法過濾新生牛血清，能截流新生牛血清中的細(xì)菌、霉菌、支原體、細(xì)菌內(nèi)毒素、免疫球蛋白等大分子物質(zhì)，而新生牛血清中的血清白蛋白、小分子肽、氨基酸、微量元素等小分子物質(zhì)被保留。過濾后的新生牛血清，免疫球蛋白去除率達(dá)100％，能夠滿足細(xì)胞生長的營養(yǎng)要求。
文檔編號C12N5/00GK102268401SQ201110151000
公開日2011年12月7日 申請日期2011年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月8日
發(fā)明者周貞兵, 龐觀龍 申請人:龐觀龍