專利名稱：一種利用酶工程法生產(chǎn)γ-氨基丁酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用酶工程法生產(chǎn)Y-氨基丁酸的方法，屬于發(fā)酵法產(chǎn)酶技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
Y-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，簡(jiǎn)稱GABA)又名氨酪酸，化學(xué)名4_氨基丁酸，伽瑪氨基丁酸。外觀為幾乎白色結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，微臭，有強(qiáng)引濕性。GABA具有安定、 抗驚厥、降血壓、增進(jìn)腦活力、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞、促進(jìn)生長(zhǎng)激素分泌以及保肝利腎的作用。對(duì) GABA在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用研究結(jié)果表明，GABA對(duì)畜禽具有很好的抗熱應(yīng)激和促生長(zhǎng)的作用。Y-氨基丁酸的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法、固態(tài)發(fā)酵法和植物提取法?；瘜W(xué)合成法是采用吡咯烷酮、氫氧化鈉和水按一定比例混合后，在高溫下進(jìn)行反應(yīng)，然后通過(guò)樹(shù)脂分離純化，濃縮結(jié)晶而成。吡咯烷酮與氫氧化鈉都為腐蝕性物質(zhì)，影響人體健康。特別是吡咯烷酮在高溫下，有引起燃燒的危險(xiǎn)，且可分解釋放有毒的氧化氮煙氣，操作過(guò)程存在危險(xiǎn)性，不利于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。固態(tài)發(fā)酵法效率低下，產(chǎn)量?jī)H為0. 35mg/g，最終純度只有 45%，制作成本大，沒(méi)有市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。植物提取法利用有機(jī)溶劑從植物中萃取，有機(jī)溶劑危險(xiǎn)性大，易燃易爆，而且植物中Y -氨基丁酸的含量較低，而雜質(zhì)含量高，導(dǎo)致植物提取法生產(chǎn)的Y-氨基丁酸產(chǎn)量低，產(chǎn)品純度低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種酶工程法生產(chǎn)Y -氨基丁酸的方法。該方法生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)過(guò)程污染小，無(wú)危險(xiǎn)性，成本低廉，產(chǎn)品純度高，含量穩(wěn)定。本發(fā)明是通過(guò)如下方式實(shí)現(xiàn)一種利用酶工程法生產(chǎn)Y-氨基丁酸的方法，其特征是，包括以下步驟(1)、酶誘導(dǎo)發(fā)酵在培養(yǎng)基中接入大腸桿菌菌種進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，加入培養(yǎng)基質(zhì)量 0. 01-1 %的乳糖作為誘導(dǎo)劑，進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)酶，接種量為2-5 %，培養(yǎng)溫度為35-39°C，pH為 4. 0-7. 0，培養(yǎng)16-24h，得到菌液。所述大腸桿菌培養(yǎng)基為常規(guī)培養(yǎng)液，主要成分及其含量為玉米漿10. 0-30. Og/ L,酵母粉 5. 0-30. Og/L，酵母膏 2. 0-15. Og/L, KH2PO4 1. 0-10. Og/L, MgSO4 0. 05-5. Og/L。O)、陶瓷膜過(guò)濾收集菌體并在線洗菌體將步驟(1)得到的菌液經(jīng)陶瓷膜過(guò)濾收集菌體，并對(duì)菌體進(jìn)行在線洗滌；由于PH對(duì)酶活力影響比較大，在膜內(nèi)進(jìn)行菌體循環(huán)洗滌菌體時(shí)，需用酸(乙酸等)調(diào)節(jié)洗滌水PH使菌體pH保持在4. 0-7.0，控制洗滌溫度 35-45°C，當(dāng)透析液透光率在450nm下達(dá)到60%時(shí)終止洗滌，得到菌體，備用。(3)、酶催化谷氨酸脫羧轉(zhuǎn)化為Y -氨基丁酸將步驟O)陶瓷膜過(guò)濾洗滌得到的菌體加入乙酸溶液和乙酸鈉溶液，配制成濃度為0. 08-lmol/LpH值為3. 0-7. 0的乙酸-乙酸鈉緩沖液(轉(zhuǎn)化液)，按膜收集菌體前(陶瓷膜過(guò)濾洗滌前菌液)體積與轉(zhuǎn)化液體積比5 3的比例進(jìn)行轉(zhuǎn)化緩沖液的配制，進(jìn)行轉(zhuǎn)化前加入轉(zhuǎn)化液體積0. 01-0. 的吐溫80 ； 少量多次加入底物谷氨酸進(jìn)行轉(zhuǎn)化，使反應(yīng)體系中谷氨酸含量維持在30-50g/L，所述谷氨酸加入總量為轉(zhuǎn)化液的30-40% (w/v)；反應(yīng)溫度為30-40°C，反應(yīng)時(shí)間為30-50h。(4)、采用陶瓷膜在線過(guò)濾除菌體，陶瓷膜孔徑50nm，控制膜溫度65-90°C，進(jìn)膜壓力1.0-3. lbar。通過(guò)膜過(guò)濾可將料液中菌體除去。經(jīng)膜過(guò)濾出的菌渣，經(jīng)濃縮可做菌體蛋白。(5)、卷式有機(jī)膜脫色經(jīng)陶瓷膜處理的料液無(wú)法將料液中的色素去除，該工藝采用卷式有機(jī)膜截留分子量大于800的色素分子及大量蛋白分子，脫色過(guò)程控制過(guò)濾溫度在 20-450C，控制過(guò)濾壓力10-20bar，在脫色濾液450nm透光率達(dá)93%以上時(shí)，停止循環(huán)，收集濾液。(6)、三效濃縮與直接濃縮結(jié)晶采用三效濃縮，控制一效溫度60_95°C，二效溫度90-115 °C，三效溫度50-85 °C，控制真空度-0. 08Mpa -0. IMpa ；在濃縮產(chǎn)品含量達(dá) 550 600g/L時(shí)，停止?jié)饪s，將濃縮液打入真空濃縮結(jié)晶罐，控制真空濃縮結(jié)晶罐真空度-0. 08Mpa -0. IMpa，溫度為60_75°C，在濃縮產(chǎn)品含量達(dá)700 900g/L時(shí)，停止加熱， 常壓下自然降溫養(yǎng)晶1-1.紐，得到柱狀或粉末狀晶體。本發(fā)明的有益效果是整個(gè)Y-氨基丁酸發(fā)酵法為清潔生產(chǎn)工藝，三廢排放少(只有少量清洗設(shè)備、工具、場(chǎng)地的廢水)，經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單污水處理就能達(dá)標(biāo)排放，菌渣可作為飼料蛋白，洗菌水可以以一定比例與發(fā)酵用水混合做為發(fā)酵之用。本發(fā)明一次結(jié)晶得到的晶體純度> 99.0%，收率> 85%。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1在培養(yǎng)基中接入菌種進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)基的組成為每升培養(yǎng)液所含組分以g 計(jì)玉米漿10.0，酵母粉15.0，酵母膏10.0，KH2PO4 2.0，MgSO4 0. 5，誘導(dǎo)劑乳糖以50%濃度單獨(dú)滅菌(使加入發(fā)酵罐中最終濃度為0. 01 % )。將配制好的培養(yǎng)基加入發(fā)酵罐中，121°C, 滅菌30min。采用火焰接種法接入菌種，接種量為3%。發(fā)酵時(shí)間為18h，在1 時(shí)逐漸加入誘導(dǎo)劑，制得菌液；小試酶活檢測(cè)取IOOml菌液進(jìn)行離心，將菌體離心出來(lái)后倒掉上清，加入 0. lmol/L pH為5. 0的乙酸-乙酸鈉緩沖液，將菌體混勻，加吐溫800. 1ml，然后加入谷氨酸 IOg進(jìn)行轉(zhuǎn)化。反應(yīng)溫度40°C，反應(yīng)時(shí)間36h。檢測(cè)谷氨酸殘留為0.5g/L，將轉(zhuǎn)化液進(jìn)行提取，得到8. 59g氨基丁酸，收率85%，純度為99. 5% (國(guó)標(biāo)法)。生產(chǎn)處理將15t菌液過(guò)陶瓷膜過(guò)濾洗滌菌體，在所得菌體中加入乙酸溶液和乙酸鈉溶液，配制成9t 0. lmol/L pH為5. 0的乙酸-乙酸鈉緩沖液，進(jìn)行轉(zhuǎn)化前加入3L吐溫 80 ；少量多次共加入谷氨酸3t進(jìn)行轉(zhuǎn)化，使反應(yīng)體系中谷氨酸含量維持在30-50g/L。反應(yīng)溫度40°C，反應(yīng)時(shí)間36h。檢測(cè)谷氨酸殘留為0. 5g/L，將轉(zhuǎn)化液過(guò)陶瓷膜，得濾液450nm下透光率9%。濾液經(jīng)有機(jī)膜脫色，透光率上升為95. 3%，經(jīng)三效濃縮產(chǎn)品濃度達(dá)580g/L，將濃縮液快速打入真空濃縮罐中，繼續(xù)濃縮使產(chǎn)品濃度達(dá)850g/L，常壓下自然降溫養(yǎng)晶1.5h， 離心烘干得到2. 69t氨基丁酸，收率88.7%，純度為99% (國(guó)標(biāo)法)。實(shí)施例2
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在培養(yǎng)基中接入大腸桿菌進(jìn)行上罐常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)基的組成為每升培養(yǎng)液所含組分以g計(jì)玉米漿10. 0，酵母粉15. 0，酵母膏10. 0，KH2PO4 2. 0，MgSO4 0. 5，加入培養(yǎng)基質(zhì)量 0. 2%的乳糖作為誘導(dǎo)劑，進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)酶，接種量為3%，培養(yǎng)溫度35-39°C，pH為5. 0，培養(yǎng) Mh，制得菌液，放罐體積為15t。小試酶活檢測(cè)取IOOml菌液進(jìn)行離心，將菌體離心出來(lái)后倒掉上清，加入 0. lmol/L pH為5. 0的乙酸鈉-乙酸緩沖液，將菌體混勻，加入吐溫80 0. 03ml，加入IOg谷氨酸進(jìn)行轉(zhuǎn)化。反反應(yīng)溫度40°C，反應(yīng)時(shí)間36h。檢測(cè)谷氨酸殘留為0. 2g/L，將轉(zhuǎn)化液進(jìn)行提取，得到8. 6g氨基丁酸，收率85. 1%，純度為99. 5% (國(guó)標(biāo)法)。生產(chǎn)處理將15t菌液過(guò)陶瓷膜過(guò)濾洗滌菌體，在所得菌體中加入乙酸溶液和乙酸鈉溶液，配制成9t 0. lmol/L pH為5.0的乙酸-乙酸鈉緩沖液，加入吐溫80 2. 7L。少量多次共加入谷氨酸3t進(jìn)行轉(zhuǎn)化，使反應(yīng)體系中谷氨酸含量維持在30-50g/L。反應(yīng)溫度 40°C，反應(yīng)時(shí)間38h。檢測(cè)谷氨酸殘留為0. 3g/L。將轉(zhuǎn)化液過(guò)陶瓷膜，得濾液450nm下透光率11 %。濾液經(jīng)有機(jī)膜脫色，透光率上升為97. 3%，經(jīng)三效濃縮產(chǎn)品濃度達(dá)550g/L，將濃縮液快速打入真空濃縮罐中，繼續(xù)濃縮使產(chǎn)品濃度達(dá)900g/L，常壓下自然降溫養(yǎng)晶1.5h，離心烘干得到2. 8t氨基丁酸，收率89. 1 %，純度為99 % (國(guó)標(biāo)法)。
權(quán)利要求
1.一種利用酶工程法生產(chǎn)Y-氨基丁酸的方法，其特征是，包括以下步驟(1)、酶誘導(dǎo)發(fā)酵在培養(yǎng)基中接入大腸桿菌菌種進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，加入培養(yǎng)基質(zhì)量0.01.1%的乳糖作為誘導(dǎo)劑，進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)酶；接種量為2-5%，培養(yǎng)溫度為35-39°C，pH為 4. 0-7. 0，培養(yǎng)16-24h，得到菌液；O)、陶瓷膜過(guò)濾收集菌體并在線洗菌體將步驟(1)得到的菌液經(jīng)陶瓷膜過(guò)濾收集菌體，并對(duì)菌體進(jìn)行在線洗滌；洗滌菌體時(shí)用酸調(diào)節(jié)洗滌水PH使菌體pH保持在4. 0-7. 0，控制洗滌溫度35-45°C ；當(dāng)透析液透光率在450nm下達(dá)到60%時(shí)終止洗滌，得到菌體，備用；(3)、酶催化谷氨酸脫羧轉(zhuǎn)化為Y-氨基丁酸將步驟O)陶瓷膜過(guò)濾洗滌得到的菌體加入乙酸溶液和乙酸鈉溶液，配制成濃度為0. 08-lmol/L pH值為3. 0-7. 0的乙酸-乙酸鈉緩沖液，所述乙酸-乙酸鈉緩沖液即為轉(zhuǎn)化液，所述轉(zhuǎn)化液按陶瓷膜過(guò)濾洗滌前菌液體積與轉(zhuǎn)化液體積比5 3的比例配制，進(jìn)行轉(zhuǎn)化前加入轉(zhuǎn)化液體積0. 01-0. 的吐溫80 ；然后少量多次加入底物谷氨酸進(jìn)行轉(zhuǎn)化，使反應(yīng)體系中谷氨酸含量維持在30-50g/L，所述谷氨酸加入總量為轉(zhuǎn)化液的30-40% (W/V)；反應(yīng)溫度為30-40°C，反應(yīng)時(shí)間為30-50h;、采用陶瓷膜在線過(guò)濾除菌體，陶瓷膜孔徑50nm，控制膜溫度65-90°C，進(jìn)膜壓力1.0-3. Ibar ；(5)、卷式有機(jī)膜脫色采用卷式有機(jī)膜截留分子量大于800的色素分子及大量蛋白分子，脫色過(guò)程中控制過(guò)濾溫度在20-45°C，控制過(guò)濾壓力10-20bar ；在脫色濾液450nm透光率達(dá)93%以上時(shí)，停止循環(huán)，收集濾液；(6)、三效濃縮與直接濃縮結(jié)晶采用三效濃縮，控制一效溫度60-95°C，二效溫度90-115 °C，三效溫度50-85 °C，控制真空度-0. 08Mpa -0. IMpa ；在濃縮產(chǎn)品含量達(dá) 550 600g/L時(shí)，停止?jié)饪s，將濃縮液打入真空濃縮結(jié)晶罐，控制真空濃縮結(jié)晶罐真空度-0. 08Mpa -0. IMpa，溫度為60_75°C，在濃縮產(chǎn)品含量達(dá)700 900g/L時(shí)，停止加熱， 常壓下自然降溫養(yǎng)晶1-1.證，得到柱狀或粉末狀晶體。
2.如權(quán)利要求1所述的一種利用酶工程法生產(chǎn)Y-氨基丁酸的方法，其特征是，所述大腸桿菌培養(yǎng)基的主要成分及其含量為玉米漿10. 0-30. Og/L，酵母粉5. 0-30. Og/L，酵母膏2.0-15. Og/L, KH2PO4 1. 0-10. Og/L, MgSO4 0. 05-5. Og/L。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種利用酶工程法生產(chǎn)γ-氨基丁酸的方法，屬于發(fā)酵法產(chǎn)酶技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以乳糖作為誘導(dǎo)劑，進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)酶，通過(guò)陶瓷膜過(guò)濾收集菌體并在線洗菌體，然后在菌體中加入乙酸-乙酸鈉緩沖液，少量多次加入底物谷氨酸，使谷氨酸轉(zhuǎn)化為γ-氨基丁酸；然后采用陶瓷膜在線過(guò)濾除菌體，采用卷式有機(jī)膜脫色；最后采用三效濃縮至濃縮產(chǎn)品含量達(dá)550～600g/L時(shí)，停止?jié)饪s，將濃縮液打入真空濃縮結(jié)晶罐，繼續(xù)濃縮至產(chǎn)品含量達(dá)700～900g/L時(shí)，停止加熱，常壓下自然降溫養(yǎng)晶1-1.5h，得到柱狀或粉末狀晶體。一次結(jié)晶得到的晶體純度≥99.0％，收率≥85％。本發(fā)明為清潔生產(chǎn)工藝，三廢排放少，菌渣可作為飼料蛋白。
文檔編號(hào)C12P13/00GK102242161SQ20111015174
公開(kāi)日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2011年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月8日
發(fā)明者王震, 榮金雷, 鄭雄敏 申請(qǐng)人:山東恩貝生物工程有限公司