專利名稱：腫瘤細(xì)胞微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)的復(fù)合擴(kuò)增體系及檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及病癥診斷的復(fù)合擴(kuò)增體系及檢測試劑盒，特別是涉及腫瘤細(xì)胞微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)的復(fù)合擴(kuò)增體系和檢測試劑盒，可以快速預(yù)測腫瘤的發(fā)生。
背景技術(shù)：
結(jié)直腸癌(Colorectal cancer，CRC)是一種發(fā)生于結(jié)腸或直腸部位的常見惡性腫瘤，近20多年來，世界上多數(shù)國家結(jié)直腸癌(主要是結(jié)腸癌)發(fā)病率呈上升趨勢。中國結(jié)直腸癌發(fā)病率上升趨勢也十分明顯。中國的發(fā)病年齡多在40-60歲，高峰在50歲左右，但 30歲以下的結(jié)直腸癌患者并不少見。本病在中國的一個重要特點(diǎn)是結(jié)直腸癌的中位發(fā)病年齡在中國比歐美提前約十年，且青年患者比歐美多見。因此對于這一疾病的早期診斷和用藥指導(dǎo)具有重要意義。近年來的大量研究表明，腫瘤發(fā)生與錯配修復(fù)系統(tǒng)密切相關(guān)，尤其是在結(jié)直腸癌、 胃癌、子宮內(nèi)膜癌等。由于錯配修復(fù)(mismatch r印air，MM)基因的突變及功能異常，使基因組的復(fù)制錯誤不能得以及時修復(fù)，復(fù)制錯誤頻率發(fā)生不斷積累，從而使細(xì)胞基因組DNA 序列發(fā)生改變，或造成某些抑癌基因失活或癌基因激活而導(dǎo)致細(xì)胞的異常轉(zhuǎn)化和惡性增生。檢測錯配修復(fù)系統(tǒng)成為診斷這類腫瘤的方法之一。之前臨床上用于結(jié)直腸癌錯配修復(fù)系統(tǒng)的檢測方法主要有以下2種1.錯配修復(fù)基因的突變檢測，主要檢測幾種與錯配修復(fù)高度相關(guān)的基因如 hMSH2、hMLHl、hMLH6、PMS2等，先提取DNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，此方法操作繁瑣(需檢測好幾種基因)，檢測周期長，且檢測費(fèi)用高。2.免疫組化(IHC)，由于MMR的改變，其蛋白產(chǎn)物會發(fā)生相應(yīng)改變，故可以使用免疫組化(IHC)的方法來檢測MMR蛋白產(chǎn)物，目前主要檢測hMSH2和hMLHl基因的蛋白產(chǎn)物。 這種方法容易忽略錯義突變和截斷突變；另外，由于在腫瘤組織中存在染色不均一的現(xiàn)象， 其靈敏性也受到一定的影響。以上兩種方法由于存在種種缺陷，沒有得到廣泛的應(yīng)用，需要一種新的易于操作、 成本低、準(zhǔn)確性高的方法。近年來發(fā)現(xiàn)，錯配修復(fù)(mismatch r印air，MM)基因的突變及功能異常，使基因組的復(fù)制錯誤不能得以及時修復(fù)，復(fù)制錯誤頻率發(fā)生不斷積累，往往會引起腫瘤發(fā)生，同時也會引起基因組微衛(wèi)星DNA序列發(fā)生改變。也就是說，錯配修復(fù)系統(tǒng)失靈導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的同時，也會在基因組的STR序列上造成影響，因此可以通過檢測STR序列來分析錯配修復(fù)系統(tǒng)的情況，進(jìn)而指示腫瘤的發(fā)生情況。微衛(wèi)星為廣泛分布于原核及有核細(xì)胞生物組的、由1-6個核苷酸組成的、具有高度多態(tài)性的簡單串聯(lián)重復(fù)序列。通常情況下，體細(xì)胞中小衛(wèi)星DNA基因的突變頻率為 5X 10_2，而微衛(wèi)星的DNA的突變頻率為10_5-10_7。因此，微衛(wèi)星DNA的穩(wěn)定性可作為衡量細(xì)胞基因組整體穩(wěn)定性的良好標(biāo)記，并廣泛用于腫瘤、高血壓病、糖尿病和精神分裂癥的全基因組掃描研究。近年來的大量研究表明錯配修復(fù)(mismatch repair, MMR)基因的突變及功能異常，使基因組的復(fù)制錯誤不能得以及時修復(fù)，復(fù)制錯誤頻率發(fā)生不斷積累，造成某些抑癌基因失活或癌基因激活而導(dǎo)致細(xì)胞的異常轉(zhuǎn)化和惡性增生。同時使細(xì)胞基因組微衛(wèi)星DNA序列發(fā)生改變，這就成為微衛(wèi)星不穩(wěn)定(Microsatallite Instability, MSI) 微衛(wèi)星不穩(wěn)定(Microsatallite Instability, MSI)表現(xiàn)于同一微衛(wèi)星位點(diǎn)在不同個體之間以及同一個體的正常組織與某些異常組織之間，微衛(wèi)星位點(diǎn)的重復(fù)單位的數(shù)目不同。MSI的產(chǎn)生原因可能是DNA復(fù)制過程中的“鏈滑”(strand slippage)現(xiàn)象。DNA復(fù)制過程中，當(dāng)復(fù)制復(fù)合物復(fù)制一個重復(fù)單位(repeat unit)后，子鏈與模板鏈分離，然后與下一個或下幾個重復(fù)單位重新結(jié)合，使一個或幾個重復(fù)單位形成”環(huán)凸”(looped out)區(qū)域。正常情況下該結(jié)構(gòu)可被錯配修復(fù)系統(tǒng)(mismatch repair system)所校正，但校正系統(tǒng)失常時，子鏈DNA如繼續(xù)延伸即可引起突變。這就引起微衛(wèi)星不穩(wěn)定，基因型發(fā)生變化。據(jù)文獻(xiàn)報道，大約15%的結(jié)直腸癌中存在MSI現(xiàn)象，其中3%與Lynch綜合癥(或 HNPCC)有關(guān)，而大約90%的HNPCC患者中存在MSI，其余12%為散發(fā)性，攜帶有MSI的結(jié)直腸癌表現(xiàn)出不同的特征，如好發(fā)于近段結(jié)腸、淋巴細(xì)胞侵入、低度分化、呈黏液細(xì)胞或印戒細(xì)胞狀。與無MSI的結(jié)直腸癌相比，攜帶有MSI的結(jié)直腸癌其預(yù)后較好，并且二者藥物反應(yīng)也不一樣。故此，MSI檢測對結(jié)直腸癌患者其意義重大。1997 年 12 月，美國國家腫瘤研究所(National Cancer Institute，NCI)舉辦了一個針對腫瘤的微衛(wèi)星不穩(wěn)定及復(fù)制錯誤表型檢測的國際專題會議，在這次會議中，制定了 MSI 檢測的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)(即 Bethesda Guidelines)。Bethesda Guidelines 確定了一個用來檢測MSI的參考Panel (即NCI Panel)，它包含2個單核苷酸重復(fù)的位點(diǎn)(BAT-25、 BAT-26)和3個2核苷酸重復(fù)的位點(diǎn)(D2S123、D5S346、D17S250)。應(yīng)用NCI Panel檢測腫瘤MSI狀態(tài)時，5個STR位點(diǎn)如果檢測出2個或2個以上的位點(diǎn)有MSI，則為MSI_H(高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定)，MSI-H腫瘤表現(xiàn)出特有的臨床及病理學(xué)表型，若只檢測出1個位點(diǎn)有MSI則為MSI-L (低度微衛(wèi)星不穩(wěn)定)，MSI-L與MSS (微衛(wèi)星穩(wěn)定)的區(qū)分只有在選用更多位點(diǎn)來進(jìn)行檢測時才能實(shí)現(xiàn)，不過MSI-L與MSS的腫瘤表型似乎一致。然而到2002年，NCI在第二次專題會議上，針對之前采納的NCI Panel來檢測MSI 問題出現(xiàn)了爭議，爭議的焦點(diǎn)在于由于NCI Panel使用了 3個2核苷酸重復(fù)的位點(diǎn)，導(dǎo)致應(yīng)用NCI Panel來評估腫瘤微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)時存在一定的局限性，其一，2核苷酸重復(fù)的位點(diǎn)在檢測存在錯配修復(fù)缺陷的腫瘤時表現(xiàn)出較低的特異性和靈敏度；其二，由于2核苷酸重復(fù)位點(diǎn)具有高多態(tài)性的特征，故檢測時必須用與腫瘤組織相匹配的正常組織來作比較才能得出結(jié)果，會議建議專用單核苷酸重復(fù)位點(diǎn)來檢測MSI以提高檢測的靈敏度。在2011年關(guān)于結(jié)直腸癌篩查的國際腫瘤綜合網(wǎng)(National Comprehensive Cancer Network, NCCN)指南中，MSI已被列入必要檢測項(xiàng)目(參見NCCN Guidelines Version 2. 201IUpdates Colorectal Cancer Screening)。查找高度靈敏性及特異性的用來檢測MSI的準(zhǔn)單態(tài)性位點(diǎn)是建立MSI檢測體系的必需工作，已成為近年來研究MSI檢測領(lǐng)域的熱點(diǎn)，但是這一工作并不輕松，到目前為止僅有!Iomega公司的一款產(chǎn)品能夠一次性檢測5個，開發(fā)更多位點(diǎn)和更好靈敏度的MSI檢測系統(tǒng)勢在必行。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述領(lǐng)域中的不足和需求，本發(fā)明提供一種腫瘤細(xì)胞微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)的擴(kuò)增體系和檢測試劑盒，在評估腫瘤MSI狀態(tài)時，其結(jié)果比5位點(diǎn)更為準(zhǔn)確，操作簡單、便于大規(guī)模推廣，這種方法隨著試劑盒開發(fā)成功可以批量生產(chǎn)，使用條件可以模式化，全部過程都有自動化設(shè)備，不再依賴于人的操作經(jīng)驗(yàn)，可以實(shí)現(xiàn)自動化，所需時間短，整個檢測時間需要6小時左右。腫瘤細(xì)胞微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)的擴(kuò)增體系，所述擴(kuò)增體系中同時擴(kuò)增準(zhǔn)單態(tài)性單核苷酸重復(fù)位點(diǎn) NR-21、NR-22、NR-24、NR-27、BAT-25、BAT-26、M0N0-27 和 CAT-25。所述擴(kuò)增體系中還包括性別位點(diǎn)AMEL。所述擴(kuò)增體系中的被擴(kuò)增位點(diǎn)，分別由三種不同顏色的熒光素標(biāo)記，三組組合分別為第一組 NR-21、NR-22、BAT-26 ；第二組NR_27、BAT-25、CAT-25 ；第三組AMEL、NR_24、 M0N0-27。所述三組中可以分別標(biāo)記為FAM或熒光素、HEX或JOE，TMR或VIC。所述NR-21、NR-22、BAT-26 組為 FAM 或熒光素，所述 NR-27、BAT-25、CAT-25 組為 HEX 或 JOE ；所述 AMEL, NR-24、M0N0-27 組為 TMR 或 VIC。所述位點(diǎn)由一對引物擴(kuò)增，其中一個引物的5’末端帶有熒光標(biāo)記。所述引物分別為NR-21 引物引物 1 :GAGTCGCTGGCACAGTTCTA，引物 2 CTGGTCACTCGCGTTTACAA ；NR-22 引物引物 1 :GGATAATCGAGGCTTGTCAAG，引物 2 GCCCAAGACAAAACTTCCAG ；NR-M 引物引物 1 GTGTCTTGCTGAATTTTACCTCCTGAC，引物 2 :ATTGTGCCATTGCATTCCAA ；NR-27 引物引物 1 :AACCATGCTTGCAAACCACT，引物 2 CGATAATACTAGCAATGACC ；BAT-25 引物引物 1 CTCGCCTCCAAGAATGTAAGT，引物 2 TCTGCATTTTAACTATGGCTC ；BAT-26 引物引物 1 :CTGCGGTAATCAAGTTTTTAG，引物 2 :AACCATTCAACATTTTTAACCC ；M0N0-27 引物引物 1 GAAATGGTGGGAACCCAG，引物 2 GGTGGATCAAATTTCACTTGG ；
CAT-25 引物引物 1 :TTCAACCTAGAAACCTTTATCCC，引物 2 :AGCTTGCAGTGAGCTGAGATCG ；AMEL 引物引物 1 CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAG，
引物 2 ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGCTG。一種試劑盒，包括一擴(kuò)增體系，其特征在于包括NR-21、NR-22、NR-24、NR-27、 BAT-25、BAT-26、M0N0-27、CAT-25的上述8對引物的混合物。所述引物的混合物中還包括性別位點(diǎn)AMEL的引物。所述擴(kuò)增體系的總體積為10μ 1，其中緩沖液1μ 1， ΝΤΡΟ.δμ 1,引物混合物 2.0μ l，Taq酶0. 1 μ 1，去離子水5. 4 μ 1，加入模板量為1μ 1。所述引物混合物中的引物濃度分別為4μΜ的NR-21、10yM的NR_22、5yM的 NR-24、8 μ M 的 NR-27、7 μ M 的 BAT-25,5 μ M 的 BAT-26,4 μ M 的 Μ0Ν0_27、3 μ M 的 CAT-25 和 3μ M 的 AMEL0所述擴(kuò)增體系的擴(kuò)增條件為94°C變性，5-10min ；59_62°C退火，30_60s ；70-72°C 延伸，30-60s ；60°C最后延伸，30-60min。我們經(jīng)過數(shù)年的不斷努力，目前已篩選出一些可以用來檢測MSI的準(zhǔn)單態(tài)性位點(diǎn)，如 NR-21、NR-22、NR-24、NR-27、BAT-25、BAT-26、SEC63、CAT25 等。本發(fā)明選取其中 8 個具有高度靈敏性及特異性的準(zhǔn)單態(tài)性單核苷酸重復(fù)位點(diǎn)(NR-21、NR-22、NR-24、NR-27、 BAT-25,BAT-26,M0N0-27,CAT-25)對MSI進(jìn)行檢測。同時，我們加入1個性別位點(diǎn)(AMEL)， 建立9個位點(diǎn)的多重復(fù)合擴(kuò)增體系。選擇AMEL位點(diǎn)是為了防止操作者在實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)混淆樣本的可能。本發(fā)明的整個方法過程1、引物組合的設(shè)計首先，我們選擇的具有高度靈敏性及特異性的準(zhǔn)單態(tài)性位點(diǎn)，選擇的位點(diǎn)包括 NR-21、NR-22、NR-24、NR-27、BAT-25、BAT-26、M0N0-27、CAT-25，以及性別位點(diǎn) AMEL，根據(jù)候選的位點(diǎn)所在基因的GeneBank序列號從NCBI核酸數(shù)據(jù)庫下載基因序列，各位點(diǎn)所在基因的部分序列見序列表。用于擴(kuò)增NR-21的引物對是由位于序列1中45 123位18 25個連續(xù)堿基構(gòu)成的引物，和與序列1中143 180位的互補(bǔ)序列的18 25個連續(xù)堿基構(gòu)成的引物的組
口 O用于擴(kuò)增NR-22的引物對是由位于序列2中100 180位18 25個連續(xù)堿基構(gòu)成的引物，和與序列2中230 300位的互補(bǔ)序列的18 25個連續(xù)堿基構(gòu)成的引物的組
Π O用于擴(kuò)增NR-M的引物對是由位于序列3中33 120位18 25個連續(xù)堿基再加上一尾巴序列構(gòu)成的引物，和與序列3中147 207位的互補(bǔ)序列的18 25個連續(xù)堿基構(gòu)成的引物的組合。用于擴(kuò)增NR-27位點(diǎn)的引物對是由位于序列4中56 118位18 25個連續(xù)堿基構(gòu)成的引物，和與序列4中127 197位的互補(bǔ)序列的18 25個連續(xù)堿基構(gòu)成的引物的組合。用于擴(kuò)增BAT-25的引物對是由位于序列5中39 153位18 25個連續(xù)堿基構(gòu)成的引物，和與序列5中199 260位的互補(bǔ)序列的18 25個連續(xù)堿基構(gòu)成的引物的組合。用于擴(kuò)增BAT-洲的引物對是由位于序列6中61 180位18 25個連續(xù)堿基構(gòu)成的引物，和與序列6中2 285位的互補(bǔ)序列的18 25個連續(xù)堿基構(gòu)成的引物的組合。用于擴(kuò)增Μ0Ν0-27的引物對是由位于序列7中64 150位18 25個連續(xù)堿基構(gòu)成的引物，和與序列7中204 290位的互補(bǔ)序列的18 25個連續(xù)堿基構(gòu)成的引物的組合。用于擴(kuò)增CAT-25的引物對是由位于序列8中120 180位18 25個連續(xù)堿基構(gòu)成的引物，和與序列8中240 300位的互補(bǔ)序列的18 25個連續(xù)堿基構(gòu)成的引物的組合。用于擴(kuò)增AMEL的引物對是由位于序列9中200-260位18 25個連續(xù)堿基構(gòu)成的引物，和與序列9中270-340位的互補(bǔ)序列的18 25個連續(xù)堿基構(gòu)成的引物的組合。以上引物由Primer3、Primer Premier 5和NCBIBlast等軟件設(shè)計而成。設(shè)計引物時應(yīng)盡量確保各引物的Tm值在(60+2) °C的范圍內(nèi)，擴(kuò)增效率類似并確保各對引物的擴(kuò)增產(chǎn)物大小相差15bp以上。設(shè)計完成后，用AutoDimer等軟件分析引物二聚體和不同引物之間的相互作用，如果有相互作用可產(chǎn)生非特異產(chǎn)物或者二聚體的需要重新設(shè)計，直至得到符合要求的引物序列。選用任一人源DNA模板，分別用9對引物進(jìn)行單重擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物置于1. 5 2. 0 %的瓊脂糖凝膠上電泳，根據(jù)電泳結(jié)果來調(diào)整PCR體系及擴(kuò)增條件以得到9對引物共同的擴(kuò)增條件。最終要達(dá)成的效果是在相同體系及擴(kuò)增條件下，所有的引物對均能出現(xiàn)明亮且較單一的目的條帶。如果有引物滿足不了上述條件，則重新設(shè)計引物。然后，將滿足要求的9對引物，分為三組進(jìn)行熒光標(biāo)記。每組采用一種熒光素，分別可以是FAM或熒光素、HEX或JOE，TMR或VIC。獲得熒光標(biāo)記引物后，用與之相配對的非熒光引物組合后分別進(jìn)行單重擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物置于3730x1遺傳分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳，根據(jù)毛細(xì)管電泳檢測的結(jié)果來評估每對引物的擴(kuò)增效率。其后，將同一熒光素標(biāo)記的3對引物混合置于同一管中擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物置于 3730x1遺傳分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳，根據(jù)毛細(xì)管電泳檢測的結(jié)果來確定每對引物的擴(kuò)增效率以及此3對引物的混合擴(kuò)增是否引起非特異擴(kuò)增。最后，根據(jù)單重擴(kuò)增及組合擴(kuò)增的毛細(xì)管電泳結(jié)果來初步確定各引物對的加入量，將9對引物混合置于同一管中擴(kuò)增，再根據(jù)復(fù)合擴(kuò)增的電泳結(jié)果來調(diào)整各自的濃度，使各引物對的擴(kuò)增效率(反應(yīng)在電泳結(jié)果的峰高上)基本一致為準(zhǔn)。最終確定的9對引物序列分別見序列表。2.擴(kuò)增體系及條件的建立2. ITaq酶的選擇Taq酶是擴(kuò)增體系的重要組分，多種Taq酶都滿足本發(fā)明的需要，如Takara公司的 rTaq和HS Taq、KAPA公司的HiFi Taq、Roche公司的AmpliTaq Gold酶等均能得到較好的擴(kuò)增效率和特異性，采用熱啟動Taq酶比非熱啟動的酶其擴(kuò)增效率和特異性均要好。2. 2Mg2+濃度的選擇我們摸索了在不同Mg2+濃度梯度下復(fù)合擴(kuò)增，其中在1. 0-2. OmM的濃度范圍內(nèi)均能得到較好的擴(kuò)增。2. 3反應(yīng)體積的選擇我們分別采用了 20ul和IOul體系進(jìn)行了復(fù)合擴(kuò)增，結(jié)果顯示10ul的體系與 20ul的體系效果基本相當(dāng)。2. 4反應(yīng)程序的優(yōu)化退火及延伸溫度我們摸索了退火溫度從55°C到6rC之間各溫度下的擴(kuò)增情況， 結(jié)果顯示在59-61°C范圍內(nèi)均能得到較好結(jié)果。我們摸索了在以下變性、退火及延伸溫度下各時間范圍內(nèi)(見表1)的擴(kuò)增可以得到較好的結(jié)果表1溫度與時間
權(quán)利要求
1.腫瘤細(xì)胞微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)的擴(kuò)增體系，所述擴(kuò)增體系中同時擴(kuò)增準(zhǔn)單態(tài)性單核苷酸重復(fù)位點(diǎn) NR-21、NR-22、NR-24、NR-27、BAT-25、BAT-26、M0N0-27 和 CAT-25。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的擴(kuò)增體系，所述擴(kuò)增體系中還包括性別位點(diǎn)AMEL。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的擴(kuò)增體系，所述擴(kuò)增體系中的被擴(kuò)增位點(diǎn)，分別由三種不同顏色的熒光素標(biāo)記，三組組合分別為第一組NR-21、NR-22、BAT-26 ；第二組NR_27、 BAT-25、CAT-25 ；第三組AMEL、NR-24、M0N0-27。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的擴(kuò)增體系，所述三組中可以分別標(biāo)記為FAM或熒光素、HEX或 JOE, TMR 或 VIC。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的擴(kuò)增體系，所述NR-21、NR-22、BAT46組為FAM或熒光素，所述 NR-27、BAT-25、CAT-25 組為 HEX 或 JOE ；所述 AMEL, NR-24、M0N0-27 組為 TMR 或 VIC。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的擴(kuò)增體系，所述位點(diǎn)由一對引物擴(kuò)增，其中一個引物的5’末端帶有熒光素標(biāo)記。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的擴(kuò)增體系，所述引物分別為 NR-21引物引物 1 :GAGTCGCTGGCACAGTTCTA， 引物 2 CTGGTCACTCGCGTTTACAA ； NR-22引物引物 1 :GGATAATCGAGGCTTGTCAAG， 引物 2 GCCCAAGACAAAACTTCCAG ； NR-24引物引物 1 GTGTCTTGCTGAATTTTACCTCCTGAC, 引物 2 :ATTGTGCCATTGCATTCCAA ； NR-27引物引物 1 :AACCATGCTTGCAAACCACT， 引物 2 CGATAATACTAGCAATGACC ； BAT-25 引物引物 1 :CTCGCCTCCAAGAATGTAAGT， 引物 2 TCTGCATTTTAACTATGGCTC ； BAT-26 引物引物 1 :CTGCGGTAATCAAGTTTTTAG， 引物 2 :AACCATTCAACATTTTTAACCC ； M0N0-27 引物引物 1 :GAAATGGTGGGAACCCAG， 引物 2 GGTGGATCAAATTTCACTTGG ； CAT-25 引物引物 1 :TTCAACCTAGAAACCTTTATCCC， 引物 2 :AGCTTGCAGTGAGCTGAGATCG ； AMEL引物引物 1 :CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAG，引物 2 :ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGCTG。
8.一種試劑盒，包括一擴(kuò)增體系，其特征在于所述擴(kuò)增體系中包括NR-21、NR-22、 NR-24、NR-27、BAT-25、BAT-26、M0N0-27、CAT-25 的引物的混合物，其引物分別為NR-21引物引物 1 :GAGTCGCTGGCACAGTTCTA， 引物 2 CTGGTCACTCGCGTTTACAA ； NR-22引物引物 1 :GGATAATCGAGGCTTGTCAAG， 引物 2 GCCCAAGACAAAACTTCCAG ； NR-24引物引物 1 GTGTCTTGCTGAATTTTACCTCCTGAC, 引物 2 :ATTGTGCCATTGCATTCCAA ； NR-27引物引物 1 :AACCATGCTTGCAAACCACT， 引物 2 CGATAATACTAGCAATGACC ； BAT-25 引物引物 1 :CTCGCCTCCAAGAATGTAAGT， 引物 2 TCTGCATTTTAACTATGGCTC ； BAT-26 引物引物 1 :CTGCGGTAATCAAGTTTTTAG， 引物 2 :AACCATTCAACATTTTTAACCC ； M0N0-27 引物引物 1 :GAAATGGTGGGAACCCAG， 引物 2 GGTGGATCAAATTTCACTTGG ； CAT-25 引物引物 1 :TTCAACCTAGAAACCTTTATCCC， 引物 2 AGCTTGCAGTGAGCTGAGATCG
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，所述引物的混合物中還包括性別位點(diǎn)AMEL的引物， AMEL引物為引物 1 :CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAG， 引物 2 :ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGCTG。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，所述擴(kuò)增體系的總體積為10μ 1，其中緩沖液1 μ 1， dNTPO. 5μ 1，引物混合物2.0μ 1，Taq酶0. μ 1，去離子水5. 4 μ 1，加入模板量為1μ 1，所述引物混合物中的引物濃度分別為4μ M的NR-21、10yM的NR_22、5yM的NRUyM的 NR-27、7 μ M 的 BAT-25、5 μ M 的 BAT-26,4 μ M 的 Μ0Ν0_27、3 μ M 的 CAT-25 禾口 3 μ M 的 AMEL0
全文摘要
本發(fā)明涉及腫瘤細(xì)胞微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)的復(fù)合擴(kuò)增體系及檢測試劑盒，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明選取8個具有高度靈敏性及特異性的準(zhǔn)單態(tài)性單核苷酸重復(fù)位點(diǎn)(NR-21、NR-22、NR-24、NR-27、BAT-25、BAT-26、MONO-27、CAT-25)對MSI進(jìn)行檢測。同時，我們加入1個性別位點(diǎn)(AMEL)，建立9個位點(diǎn)的多重復(fù)合擴(kuò)增體系，結(jié)果更為準(zhǔn)確。增加了性別決定位點(diǎn)AMEL，一定程度上可防止實(shí)驗(yàn)操作員混淆樣本而得出錯誤結(jié)果。本發(fā)明操作簡單、便于大規(guī)模推廣，這種方法隨著試劑盒開發(fā)成功可以批量生產(chǎn)，使用條件可以模式化，全部過程都有自動化設(shè)備，不再依賴于人的操作經(jīng)驗(yàn)，整個檢測時間需要6小時左右。
文檔編號C12Q1/68GK102230004SQ20111015222
公開日2011年11月2日 申請日期2011年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月8日
發(fā)明者周仲春, 覃健, 陳初光 申請人:北京閱微基因技術(shù)有限公司