專利名稱：一種用于乙型肝炎病毒基因耐藥突變檢測的試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學檢驗領域，涉及乙型肝炎病毒基因的突變耐藥檢測，特別涉及一種用于乙型肝炎病毒基因耐藥突變檢測試劑盒及檢測方法。
背景技術：
全世界約有三分之一的人口感染過乙肝病毒(HBV)。近些年，隨著乙型肝炎疫苗計劃的實施，世界范圍內的乙肝表面抗原這一血清學慢性感染標志物檢出率已經明顯降低。 但是，目前仍約有3. 5億人為慢性HBV感染者，這些患者有患慢性肝病、肝硬化和肝癌的風險?？共《局委熓强刂坪皖A防慢性乙肝病毒感染進展的唯一選擇。目前，我國有多種藥物獲批用于治療慢性乙型肝炎。從廣義上講，這些藥物可分為兩類細胞因子和核苷酸類似物。干擾素是一種自然發(fā)生的細胞因子，具有抗病毒和免疫調節(jié)的作用，也是第一種批準用于治療慢性乙型肝炎的藥物。干擾素對大約三分之一的患者有效，且需通過皮下注射進行，由于有很多的不良反應，需在治療期間進行觀察。核苷類似物針對乙肝病毒逆轉錄酶和乙肝病毒復制，是有效的抑制劑。他們的優(yōu)勢在于口服藥和相對較少的不良反應。然而，他們必須長期服用才具療效，耐藥性的發(fā)生是限制其長期應用的一個主要方面。關于耐藥性產生的機制和及時有效診斷的研究，對于合理的藥物設計和耐藥病人的管理顯得尤為重要。譬如，拉米夫定作為治療乙肝的一線藥物，具有非常好的抗病毒治療效果。但隨著治療時間的延長，在抗病毒治療藥物的選擇性壓力下，對藥物敏感的野生株被抑制，而耐藥株因對藥物不敏感而成為優(yōu)勢病毒株。例如服用拉米夫定治療期間，在選擇性壓力下出現(xiàn)DNA聚合酶的酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸(YMDD)基因序列變異，使其編碼的 204位蛋氨酸(M)突變?yōu)槔i氨酸(V)或異亮氨酸(I)，即常說的YVDD和YIDD變異。這兩種變異均導致拉米夫定與HBV DNA聚合酶的親合力下降或消失，HBV對其敏感性降低上千倍。 若不及時診斷并進行合理治療，將導致治療的失敗。然而目前只有YMDD耐藥突變的實時熒光定量PCR檢測技術應用于臨床進行定性檢測，此方法對耐藥檢測由于設計復雜且通量較小，并且依賴昂貴的一起，目前只能在良好的實驗室條件下完成，沒有快速、準確、大通量的對乙型肝炎病毒基因突變耐藥檢測的合適方法，對乙型肝炎的早期治療造成了一定程度上的延誤。

發(fā)明內容
本發(fā)明解決的問題在于提供一種用于乙型肝炎病毒基因耐藥突變檢測試劑盒及檢測方法，以基因芯片為基礎進行通量檢測，實現(xiàn)了高特異性且快速的對乙型肝炎病毒的突變檢測。本發(fā)明是通過以下技術方案來實現(xiàn)一種用于乙型肝炎病毒基因耐藥突變檢測的試劑盒，包括用于PCR擴增乙型肝炎病毒基因耐藥突變檢測的P區(qū)引物對、表面固定有耐藥檢測探針和對照探針的固相檢測陣列、包含DNA聚合酶和反應底物的固相載體上核酸擴增反應體系和顯色試劑；所述的P區(qū)引物對的5、端增加生物素標記；所述的耐藥檢測探針包括針對一個或多個乙型肝炎病毒耐藥突變的耐藥檢測探針，其長度為15 25nt，其中針對檢測突變位點設置在耐藥檢測探針5、端5nt之后，并在耐藥檢測探針5、端進行減少空間位阻的序列延長修飾和/或輔助固定修飾；所述的顯色試劑包括含親和素-堿性磷酸酶的親和反應液和含NBT/BCIP的顯色反應液。所述的P區(qū)引物對所擴增的片段長度不超過IOOObp ；在檢測探針上還加入PNA、 LNA或硫基提高檢測特異性的修飾。所述的耐藥檢測探針包括以下一種或幾種檢測探針針對拉米夫定耐藥突變檢測位點rtL180M的乙型肝炎病毒的耐藥檢測探針的序列如SEQ ID NO 1所示；針對拉米夫定耐藥突變檢測位點rtM204V/I的乙型肝炎病毒的耐藥檢測探針的序列如SEQ ID NO 2所示；針對阿德福韋酯耐藥突變檢測位點rtA181V/T的乙型肝炎病毒的耐藥檢測探針的序列如SEQ ID NO 3所示；針對阿德福韋酯耐藥突變檢測位點rtN236T的乙型肝炎病毒的耐藥檢測探針的序列如SEQ ID NO 4所示；針對恩替卡韋耐藥突變檢測位點rtI169T的乙型肝炎病毒的耐藥檢測探針序列如 SEQ ID NO 5 所示；針對恩替卡韋耐藥突變檢測位點rtS202I的乙型肝炎病毒的耐藥檢測探針序列如 SEQ ID NO 6 所示；針對恩替卡韋耐藥突變檢測位點rtM250V/I的乙型肝炎病毒的耐藥檢測探針序列如SEQ ID NO 7所示。所述的對照探針包括陰性對照探針和陽性對照探針，其所設計的序列均與待檢測的序列無互補性，陽性對照探針的5、端還被生物素標記。所述的進行減少空間位阻的序列延長修飾是在耐藥檢測探針5、端進行polyT、 polyC、polyT+polyC 或 spacer 6 15C 序列的延長修飾；所述的固相檢測陣列的載體為硝酸纖維素膜、尼龍膜或載玻片，耐藥檢測探針5、 端的輔助固定修飾為在耐藥檢測探針5、最末端添加氨基、巰基、羥基或醛基。所述的親和反應液組成為ImL ddH20和2 μ 1親和素-堿性磷酸酶液；顯色反應液組成為ImL顯色緩沖液、6. 5 μ INBT和3. 5 μ 1 BCIP0一種基于上述試劑盒的乙型肝炎病毒耐藥突變檢測方法，包括以下步驟1)以包含待測乙型肝炎病毒基因組的DNA為模板，以引物對為擴增引物，進行多個循環(huán)的PCR擴增，得到PCR擴增產物；2)將PCR擴增產物進行變性處理后，置于固相載體上核酸擴增反應體系中，然后再加入固相檢測陣列，進行固相核酸擴增反應；其反應程序為A 在不低于探針Tm值5°C 的溫度下退火至少IOs ；B :72°C延伸至少IOs ；A-B循環(huán)數至少大于1 ；最后72°C延伸至少3min ；3)固相核酸擴增完成后，取出固相檢測陣列放入洗脫液中離心洗脫，去除非特異核酸的結合，用親和反應液覆蓋固相檢測陣列并進行孵育，再次洗脫后用ddH20沖洗，最后覆蓋包含NBT和BCIP的顯色反應液進行顯色，直至看到顯色斑點后用ddH20終止反應；6)顯色斑點所對應的檢測結果即為所檢測的乙型肝炎病毒基因野生型檢測位點并未發(fā)生突變，根據顯色斑點與突變檢測探針所針對的基因突變位點，判定乙型肝炎病毒突變情況。所述的固相檢測陣列在使用前還在體積濃度為2% 5%的BSA中37°C封閉至少 15min。所述的變性處理為熱變性處理95°C以上至少放置5min，再在0°C至少放置 3min ；或者，所述的變性處理為堿變性處理將質量濃度10%的NaOH溶液與PCR擴增產物按照1 10 20的體積比混合，放置至少;3min。所述的固相核酸擴增反應完成后，取出固相檢測陣列首先放入洗脫液A中，轉速至少30rpm離心洗脫至少Imin ；然后將固相檢測陣列覆蓋親和反應液后37°C孵育至少 IOmin后，再依次放入洗脫液A、洗脫液B中，轉速至少30rpm離心洗脫至少Imin ；取出固相檢測陣列用ddH20沖洗，最后覆蓋顯色反應液進行顯色，至看到顯色斑點后終止反應；所述的洗脫液A 的組成為 100mmol/L pH = 7. 5 的 Tris-Cl、300mmol/L NaCl 和 4mmol/L Mg2Cl ；洗脫液 B 的組成為 100mmol/L pH = 9. 5 的 Tris-Cl、300mmol/L NaCl 和 4mmol/L Mg2Cl0與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益的技術效果1、本發(fā)明提供的用于乙型肝炎病毒耐藥突變檢測，是基于固相載體上核酸擴增的基因突變檢測，將檢測探針固定在固相檢測陣列上，與PCR擴增的待測基因片段進行雜交， 當擴增的片段被檢測探針識別后，能夠進行序列的延長(固相核酸擴增)，使得被生物素標記的擴增片段固定在膜陣列上而不被洗脫，而不能被探針識別的序列，就不能進行序列的延長，不能通過檢測探針被固定，進而被洗脫掉；這樣通過設計多個檢測探針呈矩陣式的分布，通過一次就可以檢測出待檢測基因位點的突變性質。本發(fā)明通過以基因芯片為基礎、PCR反應技術為原理的高通量、高特異性、快速、并且易于推廣的檢測方法，通過在以硝酸纖維素膜為代表的固相介質上進行特異性探針引發(fā)的核酸擴增反應，結合反向斑點雜交技術，將攜帶生物素標記的靶序列與膜陣列上探針結合后，通過生物素-親和素-堿性磷酸酶-BCIP/NBT反應，可以觀察到明顯藍紫色斑點，從而進行肉眼判讀。由于乙肝病毒的耐藥突變種類較多，將其一一將對應的突變結合探針設計并進行染色判定比較困難，而且操作繁瑣，很容易出錯；因此，以野生型作為顯色對照，如果待測樣本在所檢測的位點未發(fā)生突變，則相應的進行顯色；那么，對其以多個野生型作為顯色對照進行檢測，就可以檢測到其是否發(fā)生了耐藥突變。本發(fā)明提供了 7種耐藥檢測探針，在進行檢測時，陣列當中只有一種探針針顯色， 進行結果指示，膜陣列中其他探針并無顯色；這表明這幾種耐藥突變檢測探針能夠特異性的識別出待測乙肝基因組的突變類型，而且其結果準確可靠，彼此之間無雜交染色。
2、本發(fā)明提供的乙型肝炎病毒耐藥突變的檢測，檢測準確性高包括通過特異性的探針設計、利用已經成熟PCR技術的退火溫度以阻止非特異的結合、以及利用Taq酶
外切酶活性阻止錯配之后的延伸，完全可以達到對核酸序列單堿基差異的良好分辨力，保障了檢測的準確性；并且對實驗室及儀器設備的要求不高在普通實驗室PCR儀上即可完成整體實驗，無需特殊和昂貴設備；操作簡單；主要操作以PCR技術為核心，常規(guī)操作，成本低廉，易于推廣。3、本發(fā)明提供的乙型肝炎病毒耐藥突變的檢測，針對乙型肝炎病毒基因P區(qū)進行，因為根據以往報道，該區(qū)的突變主要引起乙型肝炎病毒耐藥性的產生。該方法檢測結果可靠、精確；而且解決了現(xiàn)有方法的檢測速度慢、分辨率不高、配套儀器昂貴、檢測過程復雜等技術問題，可以顯著的改善現(xiàn)有很少考慮乙型肝炎患者治療前對耐藥基因的檢測，進而忽略了基因耐藥而導致延誤治療的現(xiàn)況。4、本發(fā)明提供的乙型肝炎病毒耐藥突變的檢測，所提供的耐藥突變檢測探針能夠靈活組合，以適應不同的檢測人群和檢測目的，有利于臨床檢驗的靈活應用。


圖1為擴增片段與固定在固相載體上的耐藥檢測探針結合、延伸、顯色的程序示意圖；其中①為硝酸纖維素膜，②為5、端延長修飾的ClO鏈，③為耐藥檢測探針，④為擴增片段靶序列互補區(qū)，⑤為Taq酶，⑥為生物素標記，⑦為親和素-堿性磷酸酶，⑧為BCIP/NBT 顯色；圖2為乙型肝炎病毒耐藥突變的檢測特異性鑒定芯片陣列分布示意圖；圖3為乙型肝炎病毒耐藥突變探針的特異性鑒定顯色結果圖；圖3a 圖3g分別為檢出的 rtL180M，rtM204V/I，rtA181V/T，rtN236T、rtI169、rtS202I、rtM250V/I 的顯色結^ ο
具體實施例方式下面結合具體的乙型肝炎病毒耐藥突變的檢測中檢測片段的擴增和檢測探針的設計，檢測探針與固相載體的固定，檢測探針與擴增片段在固相載體上雜交、擴增，對本發(fā)明做進一步的詳細說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。參見圖1，基于固相載體上核酸擴增的基因突變檢測方法，所提供的一種用于乙型肝炎病毒耐藥突變的檢測試劑盒，包括用于PCR擴增乙型肝炎病毒基因P區(qū)的引物對、表面固定有耐藥檢測探針和對照探針的固相檢測陣列、包含DNA聚合酶和反應底物的固相載體上核酸擴增反應體系和顯色試劑。根據文獻報道的乙型肝炎耐藥突變序列將P區(qū)基因區(qū)作為檢測耐藥突變區(qū)段，其擴增采用通常的PCR體外擴增，要求循環(huán)數25 40，擴增片段的長度建議不超過lOOObp， 而擴增引物對上親和素的標記既可以在正向引物也可以在反向引物上，具體由待測的突變位點在擴增片段的位置關系來決定；檢測探針的長度設計為15 25nt，檢測探針上針對檢測突變多態(tài)性的位點設置在5、端5nt之后。所述的耐藥突變檢測探針包括針對一個或多個乙型肝炎病毒耐藥突變檢測探針，其長度為15 25nt，在以下序列當中有下劃線標注的位點為檢測的野生型的特異性序列位點；針對拉米夫定耐藥突變檢測位點rtL180M的乙型肝炎病毒的耐藥檢測探針的序列如SEQ ID NO 1所示；針對拉米夫定耐藥突變檢測位點rtM204V/I的乙型肝炎病毒的耐藥檢測探針的序列如SEQ ID NO 2所示；針對阿德福韋酯耐藥突變檢測位點rtA181V/T的乙型肝炎病毒的耐藥檢測探針的序列如SEQ ID NO 3所示；針對阿德福韋酯耐藥突變檢測位點rtN236T的乙型肝炎病毒的耐藥檢測探針的序列如SEQ ID NO 4所示；針對恩替卡韋耐藥突變檢測位點rtI169T的乙型肝炎病毒的耐藥檢測探針序列如 SEQ ID NO 5 所示；針對恩替卡韋耐藥突變檢測位點rtS202I的乙型肝炎病毒的耐藥檢測探針序列如 SEQ ID NO 6 所示；針對恩替卡韋耐藥突變檢測位點rtM250V/I的乙型肝炎病毒的耐藥檢測探針序列如SEQ ID NO 7所示。并且在其5、端添加pOlyT(10)+pOlyC(10)的修飾。在所提供的耐藥突變檢測探針中，每個突變點檢測探針可以單獨使用，也可以將幾種探針混合后固定在同一個分布位點上。對照探針包括陰性對照探針和陽性對照探針，陰性對照探針和陽性對照探針的序列設計可以相同或不相同，原則是其序列不能與擴增片段有交叉互補性。陽性對照探針的
端被生物素標記，能夠被顯色，用以監(jiān)測顯色系統(tǒng)是否正常；陰性對照探針用以監(jiān)測雜交和固相核酸擴增的特異性。具體的對照探針的序列可以設計為P曰t生胃,吧·歹[J Biotin-acagcactaa ggcaagctat tctg ；陰性對照序列 acagcactaa ggcaagctat tctg。耐藥檢測探針5、端的修飾包括減少空間位阻的序列延長修飾和/或輔助固定修飾；其中減少空間位阻的序列延長修飾是出于減少核酸擴增錯配和擴增后的序列與固相載體的附著、顯色的考慮，包括polyT、polyC、polyT+polyC或spacer 6 15C等多種序列的延長修飾。端的輔助固定修飾一般與固相載體結合考慮，固相載體可以為硝酸纖維素膜、 尼龍膜或者載玻片，通過在檢測探針的5、端添加氨基、巰基、羥基或醛基的輔助固定修飾與其固定，為了檢測探針更好的固定和將來的顯色效果，固相載體可以進行多種表面修飾。比如，以硝酸纖維素膜為固相載體，通過在SSC溶液中浸泡再烘干之后，可以使得顯色斑點不擴散；通過檢測探針5、端的羥基，經紫外光照后與硝酸纖維素膜固定。固相核酸擴增即檢測探針與目的基因片段在固相載體上雜交、擴增，是探針特異性識別的核心，其中，擴增體系采用常規(guī)的PCR反應液，其獨特之處就在于以包含檢測位點的耐藥檢測探針作為引物，能夠與目的基因互補雜交并進行核酸擴增，且通過檢測探針被固定在固相載體上不被洗脫；同時，為了保證雜交的特異性，退火溫度一般設置在不低于探針Tm值的5°C范圍內。洗脫過程是為了將未與固相載體結合的擴增片段洗脫掉，洗脫液可以為一般常用的緩沖液，結合離心洗脫效果比較好。顯色通過親和素-堿性磷酸酶液+NBT/BCIP的顯示方式，其優(yōu)勢在于底色不明顯， 反應精確，結果容易判定，效果比較好；而且實現(xiàn)方便，親和素-堿性磷酸酶液和NBT/BCIP 顯色液均可采用現(xiàn)有的試劑盒。下面結合乙肝病毒的基因耐藥檢測過程，對試劑盒及其檢測方法進行具體的說明1)檢測用擴增產物的制備設計擴增引物對，并對反向擴增引物的5、端增加生物素(Biotin)標記，所設計的引物對P具體為正向弓丨物tgttcctgcg gtaaagta18;反向弓丨物:Biotin-tgtattccca tcccatca 18 ；人工合成7個檢測位點的野生型序列用于耐藥檢測的靶序列，全長332bp，以這7 種野生型序列的DNA為模板，以引物對P為引物進行30個循環(huán)的PCR擴增，能夠獲得7種檢測位點分別突變的長度為332bp的擴增片段。2)檢測探針的設計與合成設計并人工合成了乙肝病毒HBV的7個耐藥檢測位點的檢測探針，探針Tm值設計為45士 1°C，探針長度為13 15nt,同時在探針序列5、端進行加上polyT (Tltl) ,polyC (C10) 的序列延長修飾，進行減少空間位阻的延長修飾是為了利于靶序列與固定在基膜上的探針進行結合，具體的檢測探針序列為SEQ ID NO 1 SEQ ID NO 7所示；探針上檢測多態(tài)性的位點設置均在探針5、端5nt之后。3)檢測探針在檢測陣列上的固定將硝酸纖維素膜在2 X SSC溶液(檸檬酸三鈉15mM，氯化鈉150mM，pH7. 0)中浸泡 30min后取出，在37°C孵箱內烘干2小時，再將耐藥檢測探針和對照探針用點膜儀噴涂至膜上(1滴500nl，間隔1mm，呈矩陣分布)，裁減至4mmX 6mm大小，將點完探針的硝酸纖維素膜放入80°C烘箱烘干30分鐘，2Mnm波長紫外光照6分鐘，通過紫外光照將探針與硝酸纖維素膜固定連接，得到固定有檢測探針和對照探針的固相檢測陣列。在干燥條件下，固相檢測陣列可長期儲備待用，使用前將該膜浸入2% BSA液37°C封閉15min。 檢測陣列設計如圖2分布圖加其中①為陽性對照探針②為陰性對照探針，③ ⑥為rtL180M，rtM204V/I, rtA181V/T, rtN236T0圖2b其中①為陽性對照探針②為陰性對照探針，③ ⑤為rt1169、rtS2021、 rtM250V/L·4)固相核酸擴增反應首先對第一步獲得的基因擴增產物進行序號標記，然后對擴增產物進行熱變性處理95°C水浴5min，然后冰上放置^iin ；再將變性后的擴增產物10 μ 1、PCR反應液(欣百諾公司，TagMixMaster) 20 μ UddH2O 10 μ 1放入干凈的PCR反應管中混勻，將制備好的檢測陣列放入，固相檢測陣列的膜背面靠管壁，進行固相核酸擴增反應；設計反應程序:A :45°C退火30s ；B :72°C延伸30s ；A-B循環(huán)數為10 ；最后72°C延伸3min。其中檢測對象是擴增的7種位點未突變的P區(qū)基因序列。5)洗脫與顯色固相PCR反應完成后，取出檢測陣列進行洗脫，將未與檢測陣列固定的片段洗脫掉，全部洗脫過程均在37°C條件下完成，具體為將檢測陣列取出，放入洗脫液A(100mmol/LpH = 7. 5 的 Tris-Cl、300mmol/L NaCl 和4mmol/L Mg2Cl)中離心洗脫(轉速為30rpm，洗脫lmin)，取出檢測陣列后，用堿性磷酸酯酶標記的親和反應液(ImL ddH20和2 μ 1親和素-堿性磷酸酶液，購自碧云天公司，堿性磷酸酯酶標記為Sti^ptavidin)覆蓋后，37°C條件下孵育IOmin ；孵育完成后將檢測陣列放入干凈的洗脫液A進行洗脫(轉速30rpm，洗脫lmin)，取出后再放入洗脫液B(100mmOl/L pH =9. 5 的 Tris-Cl、300mmol/L NaCl 禾口 4mmol/L Mg2Cl)中，再離心洗脫(轉速 30rpm，洗脫 lmin)；取出檢測陣列，用清水對膜塊表面沖洗，并利用吸水紙去除膜塊上的液體，將膜塊覆蓋顯色反應液(ImL顯色緩沖液、6. 5μ INBT和3. 5μ 1 BCIP，購自碧云天公司，BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒)，30秒后肉眼可看到斑點后，即用清水中止反應。6)突變檢測分析乙型肝炎病毒耐藥突變檢測顯色結果圖如圖3所示，其中①為陽性對照，②為陰性對照，可以看到被生物素標記的陽性對照均正常顯色，說明顯色系統(tǒng)工作正常；陰性對照不顯色，說明固相擴增的特異性好，沒有非特異性雜交和核酸擴增。圖3a 圖3d中均只有 ③、④、⑤、⑥當中的一個位點、圖!Be 圖3g中均只有③、④、⑤當中的一個位點，所固定的檢測探針中分別與相應的HBV基因未突變靶序列特異結合并顯色，陣列當中只有一種探針針對待測的某種未發(fā)生耐藥突變乙肝病毒顯色，進行結果指示，膜陣列中其他探針并無顯色；這表明這七種耐藥突變檢測探針能夠特異性的識別出待測乙肝基因組的未突變類型， 相應的一旦突變即不產生斑點，而且其結果準確可靠，彼此之間無雜交染色。結合以上陣列的檢測結果，本發(fā)明所提供的HBV耐藥突變檢測探針被固定形成陣列分布的檢測陣列后，每種檢測探針均能針對待測的某種耐藥突變乙肝病毒顯色，進行結果指示，其顯色明顯、結果準確可靠。準確性和重復性考證對四種HBV 耐藥突變類型 rtL180M，rtM204V/I, rtA181V/T, rtN236T 各 25 例中國乙型肝炎病毒耐藥患者的血清中HBV擴增產物進行測序，再同上述方法檢測結果進行比對，該方法檢測準確率為99%。其中2例誤檢因在設計探針的位點旁邊堿基產生突變引起。
權利要求
1.一種用于乙型肝炎病毒耐藥突變檢測試劑盒，其特征在于，包括用于PCR擴增乙型肝炎病毒基因耐藥突變檢測的P區(qū)引物對、表面固定有耐藥檢測探針和對照探針的固相檢測陣列、包含DNA聚合酶和反應底物的固相載體上核酸擴增反應體系和顯色試劑；所述的P區(qū)引物對的5、端增加生物素標記；所述的耐藥檢測探針包括針對一個或多個乙型肝炎病毒耐藥突變的耐藥檢測探針，其長度為15 25nt，其中針對檢測突變位點設置在耐藥檢測探針5、端5nt之后，并在耐藥檢測探針5、端進行減少空間位阻的序列延長修飾和/或輔助固定修飾；所述的顯色試劑包括含親和素-堿性磷酸酶的親和反應液和含NBT/BCIP的顯色反應液。
2.如權利要求1所述的用于乙型肝炎病毒耐藥突變檢測試劑盒，其特征在于，所述的P 區(qū)引物對所擴增的片段長度不超過IOOObp ；在檢測探針上還加入PNA、LNA或硫基提高檢測特異性的修飾。
3.如權利要求1所述的用于乙型肝炎病毒耐藥突變檢測試劑盒，其特征在于，所述的耐藥檢測探針包括以下一種或幾種檢測探針針對拉米夫定耐藥突變檢測位點rtL180M的乙型肝炎病毒的耐藥檢測探針的序列如 SEQ ID NO 1 所示；針對拉米夫定耐藥突變檢測位點rtM204V/I的乙型肝炎病毒的耐藥檢測探針的序列如 SEQ ID NO 2 所示；針對阿德福韋酯耐藥突變檢測位點rtA181V/T的乙型肝炎病毒的耐藥檢測探針的序列如SEQ ID NO 3所示；針對阿德福韋酯耐藥突變檢測位點rtN236T的乙型肝炎病毒的耐藥檢測探針的序列如 SEQ ID NO 4 所示；針對恩替卡韋耐藥突變檢測位點rtI169T的乙型肝炎病毒的耐藥檢測探針序列如SEQ ID NO 5 所示；針對恩替卡韋耐藥突變檢測位點rtS202I的乙型肝炎病毒的耐藥檢測探針序列如SEQ ID NO 6 所示；針對恩替卡韋耐藥突變檢測位點rtM250V/I的乙型肝炎病毒的耐藥檢測探針序列如 SEQ ID NO 7 所示。
4.如權利要求1所述的用于乙型肝炎病毒耐藥突變檢測試劑盒，其特征在于，所述的對照探針包括陰性對照探針和陽性對照探針，其所設計的序列均與待檢測的序列無互補性，陽性對照探針的5、端還被生物素標記。
5.如權利要求1所述的用于乙型肝炎病毒耐藥突變檢測試劑盒，其特征在于，所述的進行減少空間位阻的序列延長修飾是在耐藥檢測探針5、端進行p0lyT、p0lyC、 polyT+polyC或spacer 6 15C序列的延長修飾；所述的固相檢測陣列的載體為硝酸纖維素膜、尼龍膜或載玻片，耐藥檢測探針5、端的輔助固定修飾為在耐藥檢測探針5、最末端添加氨基、巰基、羥基或醛基。
6.如權利要求1所述的用于乙型肝炎病毒耐藥突變檢測試劑盒，其特征在于，所述的親和反應液組成為ImL ddH20和2 μ 1親和素-堿性磷酸酶液；顯色反應液組成為ImL顯色緩沖液、6. 5 μ INBT 禾口 3. 5 μ 1 BCIP0
7.一種基于權利要求1所述的檢測試劑盒的乙型肝炎病毒耐藥突變檢測方法，其特征在于，包括以下步驟1)以包含待測乙型肝炎病毒基因組的DNA為模板，以引物對為擴增引物，進行多個循環(huán)的PCR擴增，得到PCR擴增產物；2)將PCR擴增產物進行變性處理后，置于固相載體上核酸擴增反應體系中，然后再加入固相檢測陣列，進行固相核酸擴增反應；其反應程序為A:在不低于探針Tm值5°C的溫度下退火至少IOs ；B :72°C延伸至少IOs ；A-B循環(huán)數至少大于1 ；最后72°C延伸至少^iin ；3)固相核酸擴增完成后，取出固相檢測陣列放入洗脫液中離心洗脫，去除非特異核酸的結合，用親和反應液覆蓋固相檢測陣列并進行孵育，再次洗脫后用ddH20沖洗，最后覆蓋包含NBT和BCIP的顯色反應液進行顯色，直至看到顯色斑點后用ddH20終止反應；4)顯色斑點所對應的檢測結果即為所檢測的乙型肝炎病毒基因野生型檢測位點并未發(fā)生突變，根據顯色斑點與突變檢測探針所針對的基因突變位點，判定乙型肝炎病毒突變情況。
8.如權利要求7所述的乙型肝炎病毒耐藥突變檢測方法，其特征在于，所述的固相檢測陣列在使用前還在體積濃度為20Z0 5%的BSA中37°C封閉至少15min。
9.如權利要求7所述的乙型肝炎病毒耐藥突變檢測方法，其特征在于，所述的變性處理為熱變性處理95°C以上至少放置5min，再在0°C至少放置^iin ；或者，所述的變性處理為堿變性處理將質量濃度10%的NaOH溶液與PCR擴增產物按照1 10 20的體積比混合，放置至少;3min。
10.如權利要求7所述的乙型肝炎病毒耐藥突變檢測方法，其特征在于，所述的固相核酸擴增反應完成后，取出固相檢測陣列首先放入洗脫液A中，轉速至少30rpm離心洗脫至少 Imin ；然后將固相檢測陣列覆蓋親和反應液后37°C孵育至少IOmin后，再依次放入洗脫液 A、洗脫液B中，轉速至少30rpm離心洗脫至少Imin ；取出固相檢測陣列用ddH20沖洗，最后覆蓋顯色反應液進行顯色，至看到顯色斑點后終止反應；所述的洗脫液 A 的組成為 100mmol/L pH = 7. 5 的 Tris-Cl、300mmol/L NaCl 和 4mmol/ L Mg2Cl ；洗脫液 B 的組成為 100mmol/L pH = 9. 5 的 Tris-Cl、300mmol/L NaCl 和 4mmol/L Mg2Cl。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于乙型肝炎病毒基因耐藥突變檢測試劑盒及檢測方法，試劑盒包括用于PCR擴增乙型肝炎病毒基因P區(qū)的引物對、表面固定有耐藥檢測探針和對照探針的固相檢測陣列、包含DNA聚合酶和反應底物的固相載體上核酸擴增反應體系和顯色試劑。本發(fā)明通過以基因芯片為基礎，PCR反應技術為原理的高通量、高特異性、快速、且易于推廣的檢測方法，將檢測探針固定在檢測陣列上，與PCR擴增的待測基因片段進行雜交，當目的片段被固相載體上的探針識別后，能夠進行核酸序列的合成延長，使得被生物素標記的擴增片段固定在檢測陣列上而不被洗脫，進而顯色顯示，就可以檢測出待檢測乙肝病毒的耐藥突變產生情況。
文檔編號C12Q1/68GK102230025SQ20111015283
公開日2011年11月2日 申請日期2011年6月8日 優(yōu)先權日2011年6月8日
發(fā)明者劉永蘭, 包晗, 梁平, 汪欽, 王偉, 王偉華, 郭晏海, 顏真 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學