專利名稱：使骨髓間充質(zhì)干細胞靶向于心肌梗死灶的試劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種使骨髓間充質(zhì)干細胞靶向于心肌梗死灶的試劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
雖然各種治療方法不斷在進步，心血管疾病仍然是導(dǎo)致死亡的一個主要原因。在發(fā)達國家，缺血性心臟病導(dǎo)致的死亡占由心血管疾病引起的死亡的50%以上。據(jù)美國國家健康和營養(yǎng)調(diào)查2005-2006年的數(shù)據(jù)，1/3或近80，000, 000的美國成年人患有一種或多種心血管疾病，其中大約有38，100，000人年齡在60或60歲以上。死亡資料顯示2005年美國以心血管疾病(包括先天性心血管缺陷)為潛在原因引起的死亡人數(shù)為864，480，占總死亡人數(shù)2，448，017的35. 3%，或者說每2. 8個死亡人數(shù)中有一個是以心血管疾病為潛在原因而死的。2005年心血管疾病的總死亡人數(shù)(1，372，000)大約占了所有死亡人數(shù)的56%。 大約每天有2，400美國人死于心血管疾病，即每30秒就有一個人死于心血管疾病。每年死于心血管疾病的人幾乎與死于癌癥、慢性下呼吸道疾病、意外和糖尿病的人一樣多(NCHS)。干細胞移植有可能修復(fù)和改善心臟狀況，從而極大地幫助降低疾病的發(fā)生率和死亡率。Dib等人證實了自體成肌細胞移植的可行性、安全性和患者的成功生存，并指出干細胞移植可能是治療末期心臟病的一個潛在的治療方法。同種異體骨髓間充質(zhì)細胞可以從骨髓中分離出來。它們可以通過培養(yǎng)大量增殖同時保持其多種潛能特性。它們是組織工程使用的初級細胞，可以表達多種細胞類型，組織工程是一個非常有前途有希望的領(lǐng)域，它讓我們可以重建器官，修復(fù)病變和受損的組織。同種異體骨髓間充質(zhì)細胞主要有兩種造血骨髓干細胞(單核)和骨髓間充質(zhì)干細胞。人們用后肢缺血再灌注模型進行研究，對這兩種干細胞進行了深刻的對比。間充質(zhì)干細胞有更強的修復(fù)作用，因為它們分泌更多與血管生成有關(guān)的細胞因子。間充質(zhì)干細胞有多向分化潛能，能逃過受體免疫系統(tǒng)的檢查，甚至能降低T細胞的反應(yīng)，這使我們可以使用多種異體干細胞進行治療。目前所記載的研究大部分都將干細胞注射到冠狀動脈內(nèi)和肌肉內(nèi)。一個有698位病人的研究分析顯示使用冠狀動脈內(nèi)注射干細胞治療急性心肌梗塞對于恢復(fù)心臟功能和心臟變形能達到相關(guān)的臨床效果。使用細胞治療的病人其目標(biāo)血管重建的需求并沒有增加，研究發(fā)現(xiàn)治療是安全的。雖然乍一看，冠狀動脈內(nèi)注射是細胞應(yīng)用的一種方式，但放射標(biāo)記骨髓細胞顯示與肌肉內(nèi)注射相比，冠狀動脈內(nèi)注射所留下的細胞量較少。但肌肉內(nèi)注射只能對局部區(qū)域起作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種使骨髓間充質(zhì)干細胞靶向于心肌梗死灶的試劑。本發(fā)明所提供的使骨髓間充質(zhì)干細胞靶向于心肌梗死灶的試劑，由使骨髓間充質(zhì)干細胞靶向于心肌梗死灶的培養(yǎng)基和離體的骨髓間充質(zhì)干細胞組成；所述使骨髓間充質(zhì)干細胞靶向于心肌梗死灶的培養(yǎng)基，由溶質(zhì)和溶劑組成，所述溶質(zhì)由如下終濃度的七種物質(zhì)組成葡萄糖 4. Og/L-5. Og/L，碳酸鈉 0. llg/L-0. 19g/L，L-谷氨酰胺 0. 584g/L_0. 702g/L, 二甲基亞砜100ml/L-130ml/L，轉(zhuǎn)鐵蛋白50g/L_67g/L，胰島素5g/L_6. 6g/L，堿性成纖維細胞生長因子0. 01g/L-0. 05g/L，所述溶劑為注射用水。所述溶質(zhì)具體可由如下終濃度的七種物質(zhì)組成葡萄糖4. 5g/L，碳酸鈉0. llg/L，L-谷氨酰胺0. 584g/L，二甲基亞砜100ml/L，轉(zhuǎn)鐵蛋白50g/L，胰島素5g/L，堿性成纖維細胞生長因子0. 01g/L。其中，所述轉(zhuǎn)鐵蛋白可為人轉(zhuǎn)鐵蛋白，所述胰島素可為人胰島素，所述堿性成纖維細胞生長因子可為人堿性成纖維細胞生長因子，所述骨髓間充質(zhì)干細胞可為人骨髓間充質(zhì)干細胞。所述培養(yǎng)基和所述離體的骨髓間充質(zhì)干細胞的配比可為每毫升培養(yǎng)基IO6-IO8個所述骨髓間充質(zhì)干細胞，具體可為每毫升培養(yǎng)基IO7個所述離體的骨髓間充質(zhì)干細胞，如每毫升培養(yǎng)基(1. OX IO7-L 5 X IO7)個所述離體的骨髓間充質(zhì)干細胞。所述離體的人骨髓間充質(zhì)干細胞具體可為離體的人同種異體骨髓間充質(zhì)干細胞。所述使骨髓間充質(zhì)干細胞靶向于心肌梗死灶的試劑，可按照包括如下步驟的方法制備將所述離體的骨髓間充質(zhì)干細胞和所述使骨髓間充質(zhì)干細胞靶向于心肌梗死灶的培養(yǎng)基混合，得到所述的試劑。其中，所述骨髓間充質(zhì)干細胞和所述使骨髓間充質(zhì)干細胞靶向于心肌梗死灶的培養(yǎng)基可按照每毫升培養(yǎng)基IO6-IO8個所述離體的骨髓間充質(zhì)干細胞靶的比例混合。本發(fā)明另一個目的是提供一種使骨髓間充質(zhì)干細胞靶向于心肌梗死灶的成套試劑。該成套試劑是單劑量靜脈注射劑，可直接用于治療缺血性心肌病。該成套試劑包括上述使骨髓間充質(zhì)干細胞靶向于心肌梗死灶的試劑、細胞稀釋液和細胞染液；所述細胞染液能區(qū)分活細胞和死細胞；所述細胞稀釋液為注射用生理鹽水。本發(fā)明的另一個目的是提供一種使骨髓間充質(zhì)干細胞靶向于心肌梗死灶的成套試齊U盒。該成套試劑盒包括所述的成套試劑、細胞計數(shù)板、用于存放所述使骨髓間充質(zhì)干細胞靶向于心肌梗死灶的試劑的瓶A、用于存放所述細胞染液的瓶B和用于存放所述細胞稀釋液的瓶C。所述成套試劑盒還可包括用于吸取細胞懸液的吸管和用于將所述細胞懸液放入所述細胞計數(shù)板的虹吸管。所述成套試劑盒可按照包括如下步驟的方法制備將所述使骨髓間充質(zhì)干細胞靶向于心肌梗死灶的試劑單獨包裝于一個試劑盒；將所述細胞染液和所述細胞稀釋液分別獨立包裝后，與所述吸管和虹吸管共同包裝于另一個試劑盒內(nèi)，得到由兩個試劑盒組成的所述成套試劑盒。上述同種異體骨髓間充質(zhì)干細胞可從商業(yè)途徑獲得，也可從同種異體的離體組織中分離得到。在實際應(yīng)用中，每位患者，以骨髓間充質(zhì)干細胞計，可一次性靜脈注射1億個上述骨髓間充質(zhì)干細胞。本發(fā)明的使骨髓間充質(zhì)干細胞靶向于心肌梗死灶的試劑，可使通過靜脈注射的骨髓間充質(zhì)干細胞靶向于心肌梗死灶，解決了目前通過冠狀動脈內(nèi)注射所留下的細胞量較少的問題。動物實驗證明，本發(fā)明的使骨髓間充質(zhì)干細胞靶向于心肌梗死灶的試劑可使心肌梗死的部位獲得足夠的干細胞進而分化成新生的心肌細胞。本發(fā)明的使骨髓間充質(zhì)干細胞靶向于心肌梗死灶的試劑，臨床使用操作非常方便且精確。為了進一步提高上述靜脈注射劑的使用便捷度，方便儲存和運輸，供用戶隨時隨地使用，本發(fā)明還提供了試劑盒。


圖1為左心室掃描圖(上面標(biāo)注的是>=15. OmV ；下面的是<=5. OmV)A為注射本發(fā)明的使骨髓間充質(zhì)干細胞靶向于心肌梗死灶的試劑前B為注射本發(fā)明的使骨髓間充質(zhì)干細胞靶向于心肌梗死灶的試劑后圖2為心肌梗死動物模型心臟冠狀切片TTC染色白色區(qū)域為心肌壞死區(qū)，粉紅色區(qū)域為正常心肌。a、治療組動物注射本發(fā)明的使骨髓間充質(zhì)干細胞靶向于心肌梗死灶的試劑7天后的心肌切片b、對照組動物注射細胞稀釋液后7天后的心肌切片圖3為兩組動物的心肌缺血面積比較圖4為治療組的免疫組織化學(xué)熒光染色結(jié)果
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實施例中的人同種異體骨髓間充質(zhì)干細胞(Human Mesenchymal Stem Cells，來自美國 Stemedica Cell Technologies, Inc. , MM0013. Ol0 人胰島素來自 Sigma， 10908 ；人轉(zhuǎn)鐵蛋白來自Sigma，T3309 ；人堿性成纖維細胞生長因子來自P印rotech， 100-18B。實施例1、使骨髓間充質(zhì)干細胞靶向于心肌梗死灶的成套試劑盒的制備本實施例提供的使骨髓間充質(zhì)干細胞靶向于心肌梗死灶的成套試劑盒的組成如下用于存放使骨髓間充質(zhì)干細胞靶向于心肌梗死灶的試劑的瓶A、用于存放細胞染液的瓶B，用于存放所述細胞稀釋液的瓶C、細胞計數(shù)板、用于吸取細胞懸液的吸管和用于吸取細胞懸液放入所述細胞計數(shù)板的虹吸管。1)瓶A內(nèi)盛放的物質(zhì)是使骨髓間充質(zhì)干細胞靶向于心肌梗死灶的培養(yǎng)基Ml和人同種異體骨髓間充質(zhì)干細胞。每瓶20ml，-80°C保存。其中，培養(yǎng)基Ml和人同種異體骨髓間充質(zhì)干細胞的配比為每毫升培養(yǎng)基1.5X IO7個人同種異體骨髓間充質(zhì)干細胞。培養(yǎng)基 Ml,由溶質(zhì)和溶劑組成，溶質(zhì)由如下終濃度的七種物質(zhì)組成葡萄糖4. 5g/L，碳酸鈉0. Ilg/ L, L-谷氨酰胺0. 584g/L，二甲基亞砜100ml/L，人轉(zhuǎn)鐵蛋白50g/L，人胰島素5g/L，人堿性成纖維細胞生長因子0.01g/L。溶劑為注射用水。2)瓶B內(nèi)盛放的物質(zhì)是能區(qū)分活細胞和死細胞的細胞染液。該細胞染液是0. 4% 的臺盼蘭溶液。每瓶0.5mL，室溫保存?；闷緾內(nèi)盛放的物質(zhì)是細胞稀釋液。該細胞稀釋液是注射用生理鹽水，即0. 9% NaCl水溶液。每瓶IOOmL,室溫保存。
4)細胞計數(shù)板(滬食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2006第M10370號)計數(shù)板的計數(shù)區(qū)經(jīng)特殊的鍍膜工藝處理，在顯微鏡下的網(wǎng)格非常清晰，大大減輕視疲勞。5)吸管1個(ModelSl，上海醫(yī)療用品公司)6)虹吸管1個(Model U2，上海醫(yī)療用品公司)瓶A的包裝盒鋼精鋁質(zhì)圓筒，直徑6cm，高10cm，泡沫塑料內(nèi)架設(shè)置凹槽(直徑 2. 5cm，高8cm)安放瓶A并將瓶A完全包埋在內(nèi)架中央。此包裝盒適于_80°C保存及干冰冷凍運輸。瓶B、瓶C、細胞計數(shù)板、吸管和虹吸管均包裝在另一個盒內(nèi)，室溫保存。實施例2、用實施例1的試劑盒治療心肌梗死—、細胞復(fù)蘇及細胞計數(shù)在實際操作中，凍存的干細胞要進行復(fù)蘇活化的原則為快速解凍，使之迅速通過細胞最易受損的-5 0°C，以避免冰晶重新結(jié)晶而對干細胞造成傷害導(dǎo)致干細胞的死亡。干細胞復(fù)蘇的主要操作過程如下1.從-80°C冰箱中取出瓶A包裝，將瓶A和周圍包裹的保溫泡沫塑料一同從包裝桶中取出；操作人員應(yīng)帶有防護眼睛和手套。2.將瓶A和周圍包裹的保溫泡沫塑料迅速放入盛有36°C 37°C水的搪瓷罐中，扣上蓋并不時搖動，盡快解凍。3.去除保溫泡沫塑料，取出瓶A，輕輕反復(fù)搖勻。用70%酒精擦拭消毒后，凈化臺上打開蓋，用吸管吸出0. 5mL干細胞母液，注入瓶B的臺盼蘭溶液中，適當(dāng)吹打使干細胞和染液充分懸浮。4.在細胞計數(shù)板中央放置計數(shù)專用的蓋玻片。用玻璃虹吸管吸取干細胞懸液，讓虹吸管在蓋玻片上或下側(cè)的計數(shù)板凹槽處流出懸液，至蓋玻片被液體充滿為止。5.置顯微鏡下計數(shù)四角大方格內(nèi)的細胞總數(shù)。對于壓線的細胞只計數(shù)在上線和左線者，對于細胞團按單個細胞計數(shù)。6活細胞不染色，而死細胞被染成藍色。只計活細胞數(shù)，按下式確定復(fù)蘇后干細胞母液的濃度母液干細胞濃度=(4個大格細胞總數(shù)/4) X IO4個/ml7.注意事項(1)務(wù)必使分散成單個細胞，取樣計數(shù)前，充分混勻細胞懸液。(2)顯微鏡下計數(shù)時，遇到2個以上細胞組成的細胞團，應(yīng)按單個細胞計算。如果細胞團> 10%，說明細胞分散不充分；或細胞數(shù)< 200個/IOmm2或> 500個/IOmm2時，說明稀釋不當(dāng)，需重新制備細胞懸液。二、治療劑量及細胞靜脈注射液制備(1)成人同種異體骨髓間充質(zhì)細胞單劑量靜脈注射劑治療缺血性心臟病的劑量是根據(jù)患者的體重來計算的。根據(jù)臨床試驗的結(jié)果，治療缺血性心臟疾病的劑量范圍是 500, 000/kg 1，500，000/kg體重，最佳劑量是每公斤體重100萬個干細胞。但一次靜脈輸入的干細胞數(shù)量最多不能超過1億個。(2)根據(jù)成活細胞計數(shù)的結(jié)果，以下列公式確定從A瓶中的取出的干細胞母液量干細胞母液量=計劃靜脈輸入干細胞數(shù)+母液干細胞濃度實施例1的試劑盒的活細胞計數(shù)的結(jié)果得出母液干細胞濃度是1. OX IO7個/mL，注射1億(108)個干細胞就從A瓶中吸取IOmL干細胞母液。(3)將IOmL干細胞母液注入C瓶，搖勻，就制成了 IlOmL含有1億個人同種異體骨髓間充質(zhì)細胞的靜脈注射液。三、干細胞靜脈注射用實施例1的試劑盒治療表1中的患者，具體方法如下在第一天時，將在上肢靜脈插入靜脈點滴針頭，注射生理鹽水保證靜脈通暢。在一小時內(nèi)，把含有1億個的成人同種異體骨髓間充質(zhì)細胞的IlOml生理鹽水在50分鐘之內(nèi)完成靜脈輸入。具體的療效如表1 所示，心功能在輸入干細胞3個月之后晉升一級，接近正常(圖1)。生活質(zhì)量改善，6分鐘行走測試ECG呈現(xiàn)正常。表1、臨床實例
權(quán)利要求
1.使骨髓間充質(zhì)干細胞靶向于心肌梗死灶的試劑，由使骨髓間充質(zhì)干細胞靶向于心肌梗死灶的培養(yǎng)基和離體的骨髓間充質(zhì)干細胞組成；所述使骨髓間充質(zhì)干細胞靶向于心肌梗死灶的培養(yǎng)基，由溶質(zhì)和溶劑組成；所述溶質(zhì)由如下終濃度的七種物質(zhì)組成葡萄糖4. Og/L-5. Og/L，碳酸鈉0. Ilg/ L-0. 19g/L，L-谷氨酰胺 0. 584g/L-0. 702g/L，二甲基亞砜 100ml/L_130ml/L，轉(zhuǎn)鐵蛋白 50g/ L_67g/L，胰島素5g/L-6. 6g/L，堿性成纖維細胞生長因子0. 01g/L-0. 05g/L ；所述溶劑為注射用水。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑，其特征在于所述溶質(zhì)由如下終濃度的七種物質(zhì)組成 葡萄糖4. 5g/L，碳酸鈉0. llg/L，L-谷氨酰胺0. 584g/L，二甲基亞砜100ml/L，轉(zhuǎn)鐵蛋白 50g/L，胰島素5g/L，堿性成纖維細胞生長因子0. 01g/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑，其特征在于所述轉(zhuǎn)鐵蛋白為人轉(zhuǎn)鐵蛋白，所述胰島素為人胰島素，所述堿性成纖維細胞生長因子為人堿性成纖維細胞生長因子，所述離體的骨髓間充質(zhì)干細胞為離體的人骨髓間充質(zhì)干細胞；所述培養(yǎng)基和所述骨髓間充質(zhì)干細胞的配比為每升培養(yǎng)基IO6-IO8個所述骨髓間充質(zhì)干細胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的試劑，其特征在于所述離體的人骨髓間充質(zhì)干細胞為離體的人同種異體骨髓間充質(zhì)干細胞；所述培養(yǎng)基和所述離體的骨髓間充質(zhì)干細胞的配比為每升培養(yǎng)基(1. OX IO7-L 5X IO7)個所述離體的骨髓間充質(zhì)干細胞。
5.使骨髓間充質(zhì)干細胞靶向于心肌梗死灶的成套試劑，包括權(quán)利要求1-4中任一所述的試劑、細胞稀釋液和細胞染液；所述細胞染液能區(qū)分活細胞和死細胞；所述細胞稀釋液為注射用生理鹽水。
6.使骨髓間充質(zhì)干細胞靶向于心肌梗死灶的成套試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括權(quán)利要求5所述的成套試劑、細胞計數(shù)板、用于存放權(quán)利要求1-4中任一所述的試劑的瓶 A、用于存放所述細胞染液的瓶B和用于存放所述細胞稀釋液的瓶C。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的成套試劑盒，其特征在于所述成套試劑盒還包括用于吸取細胞懸液的吸管和用于將所述細胞懸液放入所述細胞計數(shù)板的虹吸管。
8.權(quán)利要求1-4中任一所述的試劑的制備方法，包括如下步驟將所述離體的骨髓間充質(zhì)干細胞和所述使骨髓間充質(zhì)干細胞靶向于心肌梗死灶的培養(yǎng)基混合，得到權(quán)利要求 1-4中任一所述的試劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述離體的骨髓間充質(zhì)干細胞和所述使骨髓間充質(zhì)干細胞靶向于心肌梗死灶的培養(yǎng)基按照IO6-IO8個所述離體的骨髓間充質(zhì)干細胞IL所述使骨髓間充質(zhì)干細胞靶向于心肌梗死灶的培養(yǎng)基的比例混合。
10.權(quán)利要求6-8中任一所述的成套試劑盒的制備方法，包括如下步驟將權(quán)利要求 1-4中任一所述的試劑單獨包裝于一個試劑盒；將權(quán)利要求5所述的細胞染液和權(quán)利要求5 所述的細胞稀釋液分別獨立包裝后，與權(quán)利要求7所述的吸管和虹吸管共同包裝于另一個試劑盒內(nèi)，得到由兩個試劑盒組成的所述成套試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明公開了使骨髓間充質(zhì)干細胞靶向于心肌梗死灶的試劑及其制備方法。該試劑，由使骨髓間充質(zhì)干細胞靶向于心肌梗死灶的培養(yǎng)基和骨髓間充質(zhì)干細胞組成；所述培養(yǎng)基，由溶質(zhì)和溶劑組成，所述溶質(zhì)由如下終濃度的七種物質(zhì)組成葡萄糖4.0g/L-5.0g/L，碳酸鈉0.11g/L-0.19g/L，L-谷氨酰胺0.584g/L-0.702g/L，二甲基亞砜100ml/L-130ml/L，轉(zhuǎn)鐵蛋白50g/L-67g/L，胰島素5g/L-6.6g/L，堿性成纖維細胞生長因子0.01g/L-0.05g/L；所述溶劑為注射用水。本發(fā)明的試劑，可使通過經(jīng)脈注射的骨髓間充質(zhì)干細胞靶向于心肌梗死灶，解決了目前通過冠狀動脈內(nèi)注射所留下的細胞量較少的問題。
文檔編號C12N5/0775GK102228472SQ20111015364
公開日2011年11月2日 申請日期2011年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月9日
發(fā)明者曹衛(wèi), 李戍, 焦守恕, 焦陽 申請人:無錫人寰生物醫(yī)藥科技有限公司