專利名稱：一種新的檢測(cè)稗草對(duì)二氯喹啉酸抗藥性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于利用基因片段或序列進(jìn)行雜草抗藥性檢測(cè)領(lǐng)域，特別地，屬于利用稗草對(duì)二氯喹啉酸抗藥性的基因片段以及引物來(lái)檢測(cè)稗草對(duì)二氯喹啉酸抗藥性以及利用這些基因檢測(cè)抗藥性的方法。
背景技術(shù)：
截止2011年5月全球已有197種雜草(115種雙子葉，82種單子葉)的358個(gè)生物型對(duì)19類化學(xué)除草劑產(chǎn)生了抗藥性，幾乎涵蓋各類重要的除草劑。抗藥性雜草已成為雜草治理和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的嚴(yán)重威脅，由其引發(fā)的嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)和安全問(wèn)題倍受全球關(guān)注。稗草(Echinochloa crusgalli)是世界性的稻田惡性雜草，是我國(guó)農(nóng)田15種嚴(yán)重危害雜草之首。而1988年德國(guó)巴斯夫公司開發(fā)的二氯喹啉酸(Quincloric)是防除稗草等禾草的特效藥，自1990在我國(guó)推廣使用以來(lái)，防效顯著，但是，由于十多年連續(xù)使用，在我國(guó)南北稻區(qū)逐漸出現(xiàn)抗藥性稗草，而且日趨嚴(yán)重?？顾幮园薏莸穆雍筒睅?lái)了許多負(fù)面效應(yīng)，如降低生物多樣性、增加農(nóng)藥的投入，污染作物的產(chǎn)地環(huán)境，降低水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)等。GH3 (Gretchen Hagen 3)基因最早是從大豆中克隆出的植物生長(zhǎng)素早期響應(yīng)基因 (Primary-response genes)，后來(lái)在擬南芥(有19個(gè)GH3家族成員)、水稻(有13個(gè)GH3 的類似基因)，煙草(至少1個(gè)GH3基因)，辣椒(1個(gè)GH3基因))，印度芥菜(有2個(gè)GH3 的類似基因)及苔蘚植物P. patens (有3個(gè)GH3家族成員)中發(fā)現(xiàn)許多GH3基因或其類似基因，有的GH3以基因家族的形式存在，例如在擬南芥基因組中，在第5條染色體上有5個(gè) GH3基因，而且這些基因方向一致地串聯(lián)排列在一起。生長(zhǎng)素能夠誘導(dǎo)GH3基因家族中的大部分基因快速、瞬時(shí)地表達(dá)。這種快速應(yīng)答是調(diào)節(jié)植物體內(nèi)生長(zhǎng)素動(dòng)態(tài)平衡的機(jī)制之一。 植物GH3蛋白具有IAA等植物生長(zhǎng)素氨基酸化合成酶和腺苷化合成酶活性?？焖?、準(zhǔn)確、高通量的雜草抗藥性檢測(cè)方法，是抗藥性雜草防治的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。 目前雜草抗藥性檢測(cè)方法主要有(1)、溫室整株植物鑒定法。它是國(guó)際雜草抗藥性管理組織推薦的一種主要技術(shù)，優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便易行，重復(fù)性好。缺點(diǎn)是溫室空間大，試驗(yàn)周期長(zhǎng)、不能對(duì)當(dāng)季雜草作鑒定。( 、組織或器官的形態(tài)結(jié)構(gòu)比較鑒定法，包括種子或幼苗檢測(cè)法、分蘗檢測(cè)法、花粉粒萌發(fā)法、葉圓片浸漬技術(shù)測(cè)定等，其優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便易行，缺點(diǎn)是不準(zhǔn)確。(3)、 細(xì)胞或細(xì)胞器水平測(cè)定，包括葉片內(nèi)葉綠素?zé)晒鉁y(cè)定法、離體葉綠體測(cè)定技術(shù)、光合速率測(cè)定法，優(yōu)點(diǎn)是準(zhǔn)確，缺點(diǎn)是復(fù)雜、對(duì)技術(shù)和設(shè)備要求高。(4)、生理生化鑒定法，主要是酶活性測(cè)定法，缺點(diǎn)是只適合靶標(biāo)酶已知的雜草。(5)、DNA分析技術(shù)鑒定法，主要是靶標(biāo)基因序列的突變位點(diǎn)比較。缺點(diǎn)是，只適合靶基因突變的雜草。(6)、蛋白質(zhì)水平的鑒定法，主要是 ELISA法對(duì)抗性雜草的特異蛋白質(zhì)的檢測(cè)。缺點(diǎn)是，只適合已知特異蛋白質(zhì)的抗藥性雜草。標(biāo)志基因法檢測(cè)雜草抗藥性優(yōu)勢(shì)明顯，首先它可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模、高能通量的樣品量檢測(cè)，因而可迅速掌握大面積農(nóng)田的雜草抗藥性水平和范圍。其次對(duì)當(dāng)季稻田發(fā)生的雜草草實(shí)現(xiàn)檢測(cè)，掌握其抗藥性水平。第三是檢測(cè)周期短、出結(jié)果快，只需要幾天便可得結(jié)果。其缺點(diǎn)是對(duì)儀器要求較高，熒光定量PCR儀是較貴。

發(fā)明內(nèi)容
一個(gè)標(biāo)志基因只能檢測(cè)一種或一類農(nóng)藥的雜草抗藥性。所以挖掘農(nóng)藥的標(biāo)志基因是發(fā)展和完善標(biāo)志基因法的必由之路。農(nóng)藥的標(biāo)志基因應(yīng)該具備在不同抗藥性水平的雜草植株中，標(biāo)志基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量存在差異，這種差異是區(qū)分雜草抗藥性的定量指標(biāo)，而且其表達(dá)量和抗藥性水平存在較好的線性關(guān)系。為了進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性。標(biāo)志基因還應(yīng)該有其它的特征，比如在對(duì)應(yīng)農(nóng)藥處理雜草后，在不同抗藥性水平的雜草植株中， 標(biāo)志基因有不同的表達(dá)特征。本發(fā)明小組人員提出了通過(guò)檢測(cè)標(biāo)志基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量是一種新的雜草抗藥性檢測(cè)方法。GH3基因是植物生長(zhǎng)素儲(chǔ)存代謝基因，在維持細(xì)胞內(nèi)正常生長(zhǎng)素濃度方面起重要作用。本發(fā)明小組從抗二氯喹啉酸稗草克隆了 GH3基因的同源基因并命名為 ec-GH31。ecGH31基因名稱中，按國(guó)際命名習(xí)慣EC是稗草拉丁文Echinochloa crusgalli 的首字母縮寫。GH3是來(lái)自稗草的與GH3基因同源的基因，1指稗草的GH3基因家族中克隆的第一個(gè)基因。它在抗、感二氯喹啉酸稗草植株體內(nèi)的表達(dá)量明顯不同，用二氯喹啉酸處理防治適期的抗、感稗植株后，具有明顯不同的表達(dá)曲線。以上特征使GH3基因成為檢測(cè)稗草抗二氯喹啉酸水平的標(biāo)志基因，為建立一種雜草抗藥性檢測(cè)新方法提供了可能。采用RACE法，從來(lái)自浙江的抗二氯喹啉酸稗草中，克隆了生長(zhǎng)素IAA代謝相關(guān)基因并命名為ec-GH31。該基因閱讀框長(zhǎng)度為1839bp，編碼612個(gè)氨基酸。基于Real-time PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因在不同水平的抗二氯喹啉酸稗草中表達(dá)量存在明顯特征性差異， 故提出稗草對(duì)二氯喹啉酸抗藥性的檢測(cè)方法。一方面，本發(fā)明提供用于檢測(cè)稗草屬于對(duì)二氯喹啉酸抗性的基因序列。一種用來(lái)檢測(cè)稗草對(duì)二氯喹啉酸抗藥性的基因序列，其中該序列為SED IN N0:29。優(yōu)選的，所述的基因序列，其中，該基因序列包括依所述的續(xù)列設(shè)計(jì)的引物。優(yōu)選的，其中所述的引物序列為IN N0:31禾口 SED IN NO :32 ；或SED IN NO 33禾口 SED IN NO: 34。優(yōu)選的，所述的檢測(cè)為檢測(cè)該基因序列在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量。優(yōu)選的，其中檢測(cè)的方法為 Real-Time PCR 方法。優(yōu)選的，所述的檢測(cè)包括以下步驟在待檢測(cè)的稗草和對(duì)照稗草上取樣產(chǎn)生樣本； 在待檢測(cè)的稗草和對(duì)照稗草上用二氯喹啉酸處理后在不同時(shí)間取樣產(chǎn)生樣本；檢測(cè)稗草樣本的GH3基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量；把GH3基因的表達(dá)量與對(duì)照處理的GH3基因的表達(dá)量進(jìn)行比較；比較的結(jié)果來(lái)進(jìn)行待檢測(cè)的稗草對(duì)二氯喹啉酸的抗藥性評(píng)價(jià)。優(yōu)選的，檢測(cè)對(duì)照稗草所使用的引物為序列SED IN N0:33和SED IN NO :34。更優(yōu)選的，其中，檢測(cè)待檢測(cè)的稗草所使用的引物為序列SED IN NO :31和SED IN NO :32。另一方面，本發(fā)明提供一種檢測(cè)稗草對(duì)二氯喹啉酸抗藥性的方法，包括在待檢測(cè)的稗草和對(duì)照稗草上取樣產(chǎn)生樣本；在待檢測(cè)的稗草和對(duì)照稗草上用二氯喹啉酸處理后在不同時(shí)間取樣產(chǎn)生樣本；檢測(cè)稗草樣本的GH3基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量；把GH3基因的表達(dá)量與對(duì)照處理的GH3基因的表達(dá)量進(jìn)行比較；比較的結(jié)果來(lái)進(jìn)行待檢測(cè)的稗草對(duì)二氯喹啉酸的抗藥性評(píng)價(jià)。
優(yōu)選的，以稗草actin為對(duì)照，待檢測(cè)的稗草GH3基因在轉(zhuǎn)錄水平的相對(duì)表達(dá)量大于100的為抗二氯喹啉酸類型。更優(yōu)選的，其中，當(dāng)使用常規(guī)用量的二氯喹啉酸在用藥窗口期處理稗草后，在1小時(shí)內(nèi)待檢測(cè)的稗草體內(nèi)GH3的表達(dá)量升高幅度小于1. 5倍，在2小時(shí)至5天內(nèi)其體內(nèi)GH3的表達(dá)量升高幅度為0. 2 1倍；在第6天其體內(nèi)的GH3的表達(dá)量升高幅度為2 3倍的為抗二氯喹啉酸類型。優(yōu)選的，其中，以稗草actin為對(duì)照，待檢測(cè)的稗草GH3基因在轉(zhuǎn)錄水平的相對(duì)表達(dá)量小于50的為感二氯喹啉酸品種。優(yōu)選的，其中，使用常規(guī)用量的二氯喹啉酸在用藥窗口期處理稗草后，在1小時(shí)內(nèi)待檢測(cè)的稗草體內(nèi)GH3的表達(dá)量升高幅度大于4. 5倍，在2小時(shí)至3天內(nèi)其體內(nèi)GH3的表達(dá)量升高幅度為0. 3 1. 5倍；在第4和第6天其體內(nèi)GH3的表達(dá)量升高幅度在2 3倍，在第5天其體內(nèi)二氯喹啉酸的表達(dá)量升高幅度大于16倍的為感二氯喹啉酸類型。優(yōu)選的，其中，以稗草actin為對(duì)照，待檢測(cè)的稗草GH3基因在轉(zhuǎn)錄水平的相對(duì)表達(dá)量介于50 100為二氯喹啉酸敏感和抗性的中間類型。優(yōu)選的，其中，使用常規(guī)用量的二氯喹啉酸在用藥窗口期處理稗草后，在1小時(shí)內(nèi)待檢測(cè)的稗草體內(nèi)GH3的表達(dá)量升高幅度介于于1. 5 4. 5倍的為二氯喹啉酸敏感和抗性的中間類型。在以上所有的實(shí)施方式中，所述的稗草的GH3為SED IN NO :29，以及依此序列設(shè)計(jì)的引物。優(yōu)選的，其中，檢測(cè)所述待檢測(cè)稗草GH3基因表達(dá)的方法為Real-Time PCR，引物為序列SED IN N0:31和SED IN NO :32。更優(yōu)選的，其中，檢測(cè)所述對(duì)照稗草GH3基因表達(dá)的方法為Real-Time PCR，引物為序列SED IN NO 33和SED IN NO :34。另外，該方法還包括以下特征(一)、具有如下特征的稗草屬于對(duì)二氯喹啉酸有抗藥性的稗草(1)以稗草 actin (Ct)為內(nèi)參，稗草ecGH31基因在轉(zhuǎn)錄水平的相對(duì)表達(dá)量大于100。(2)使用常規(guī)用量的二氯喹啉酸在用藥窗口期處理稗草后，在1小時(shí)內(nèi)其體內(nèi)ecGH31的表達(dá)量升高幅度小于 1. 5倍，在2小時(shí)至5天內(nèi)其體內(nèi)ecGH31的表達(dá)量升高幅度為0. 2 1倍。在第6天其體內(nèi)的ecGH31的表達(dá)量升高幅度為2 3倍?；颍?二)、具有如下特征的稗草屬于對(duì)二氯喹啉酸敏感的稗草(a)以稗草 actin(Ct)為內(nèi)參，稗草ecGH31基因在轉(zhuǎn)錄水平的相對(duì)表達(dá)量小于50。(b)使用常規(guī)用量的二氯喹啉酸在用藥窗口期處理稗草后，在1小時(shí)內(nèi)其體內(nèi)ecGH31的表達(dá)量升高幅度大于 4. 5倍，在2小時(shí)至3天內(nèi)其體內(nèi)ecGH31的表達(dá)量升高幅度為0. 3 1. 5倍。在第4和第 6天其體內(nèi)ecGH31的表達(dá)量升高幅度在2 3倍，在第5天其體內(nèi)二氯喹啉酸的表達(dá)量升高幅度大于16倍?；?，(三)、具有如下特征的稗草屬于對(duì)二氯喹啉酸敏感和抗性的中間類型⑴以稗草actin (Ct)為內(nèi)參，稗草ecGH31基因在轉(zhuǎn)錄水平的相對(duì)表達(dá)量介于50 100。(2)使用常規(guī)用量的二氯喹啉酸在用藥窗口期處理稗草后，在1小時(shí)內(nèi)其體內(nèi)ecGH31的表達(dá)量升高幅度介于于1. 5 4. 5倍?；蛘?，以上三個(gè)方面的組合或同時(shí)滿足以上三個(gè)條件的檢測(cè)方法。


圖1為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中稗草總RNA電泳驗(yàn)證圖2為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中稗草中間片斷RT-PCR電泳驗(yàn)證圖；圖3為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中ecGH35RACE_PCR產(chǎn)物(約1800bp)電泳圖；圖4為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中ecGH35RACE菌落PCR電泳結(jié)果圖；圖5為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中ecGH313RACE_PCR產(chǎn)物(約IlOObp)電泳圖；圖6為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中ecGH313RACE菌落PCR電泳結(jié)果圖；圖7為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中三個(gè)片段位置關(guān)系及其引物位置示意；圖8為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中驗(yàn)證ecGH31全長(zhǎng)的三個(gè)內(nèi)nest PCR電泳結(jié)果圖；圖9為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中ecGH31與擬南芥的GH3家族成員的親緣關(guān)系圖；圖10為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中ec-GH3-R基因擴(kuò)增曲線分析圖；圖11為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中ec-GH3-R基因熔點(diǎn)曲線分析(Tm = 80. 5°C ) 圖；圖12為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中ec-GH3-S基因擴(kuò)增曲線分析圖；圖13為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中ec-GH3_S基因熔點(diǎn)曲線分析(Tm = 80. 5°C ) 圖；圖14為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中ec-GH3基因擴(kuò)增效率分析圖；圖15為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中ec-actin-R基因擴(kuò)增曲線分析圖；圖16為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中ec-actin-R基因熔點(diǎn)曲線分析(Tm = 84°C ) 圖；圖17為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中ec-actin-S基因擴(kuò)增曲線分析圖；圖18為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中ec-actin-S基因熔點(diǎn)曲線分析(Tm = 84°C ) 圖；圖19為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中ec-actin基因擴(kuò)增效率分析圖。 實(shí)施例為了進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明，現(xiàn)在以具體實(shí)施例子進(jìn)行說(shuō)明，這些說(shuō)明僅僅是本發(fā)明的具體方式的有限的列絕，并不對(duì)本發(fā)明做任何的限制。實(shí)施例1 :ecGH31基因的克隆材料準(zhǔn)備選取經(jīng)過(guò)溫室整株植物鑒定法(參見(jiàn)Moss，S. R. (1995) Techniques for determining herbicide resistance.Proceedings of the Brighton Crop Protection Conference-Weeds, 547-556.)鑒定的抗二氯喹啉酸稗草種子，25°C下置于濕潤(rùn)濾紙上催芽 3-5天，選取發(fā)芽整齊的稗草幼苗移栽于人工土壤中，培養(yǎng)至3-5葉期，備用。用50%殺稗王(江蘇新沂中凱農(nóng)用化工有限公司)配成0.5g/L濃度(有效成分)，均勻噴霧，0. 5小時(shí)摘取葉片迅速浸入液氮保存。實(shí)施例1. 1中間片斷的克隆簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)與合成在NCBI中找出擬南芥、水稻、玉米、煙草、葡萄的GH3的同源基因DNA序列，在DDBJ 網(wǎng)站在線比對(duì)，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物并合成(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成)簡(jiǎn)并引物序列為SED IN NO 1 和 SED IN NO :2。組織總RNA提取按TransZOL總RNA提取試劑盒說(shuō)明進(jìn)行(北京全式金生物技術(shù)有限公司)。用 DEPC處理水溶解RNA，并進(jìn)行濃度和純度的測(cè)定，用12g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。1.稗草總RNA的提取提取、純化的稗草葉片總RNA，用12g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。可看到^S rRNA和18S rRNA兩條帶，二者含量比值大約為2 1，說(shuō)明所提的RNA完整，無(wú)降解(圖1)。RNA的含量和純度可滿足下一步試驗(yàn)要求。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈按cDNA 第一條鏈合成試劑試劑盒(TransScript II First-Strand cDNA Synthesis SuperMix)(北京全式金生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品批號(hào)#D11030)說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA 第一條鏈，其中以 Anchored Olig(dT)2(1Primer (引物序列為SED IN NO :39) 為引物。PCR擴(kuò)增中間片斷以逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一條鏈作模板和設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物(SED IN NO :1和SED IN NO 2)進(jìn)行 RT-PCR(primerSTAR HS(premix)，Takara), PCR 條件為；35 個(gè)循環(huán)，條件為98°C，IOsec ；57°C,5sec ；72°C，48seC。結(jié)果進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒fesyPure Quick Gel Extraction Kit (北京全式金生物技術(shù)有限公司；產(chǎn)品批號(hào) #E20205)回收600bp大小片斷。連接與轉(zhuǎn)化與藍(lán)白斑篩選用含pEASY-Blunt Cloning Vector的試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司) 把目的片斷(經(jīng)過(guò)RT-PCR擴(kuò)增后的600bp大小)連接并轉(zhuǎn)化Trans-Tl (DH5 α )感受態(tài)細(xì)胞(北京全式金生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品批號(hào)#Ε200331)，通過(guò)藍(lán)白斑(藍(lán)白斑篩選的主要內(nèi)容是pEASY-Blunt Cloning Vector的試劑盒中的載體和Trans-Tl (DH5 α )感受態(tài)細(xì)胞) 篩選轉(zhuǎn)化子。測(cè)序通用引物M13F，M13R(SED IN NO 3 SED IN NO 4)進(jìn)行測(cè)序(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成)結(jié)果1(一)ecGHW基因的克隆2.稗草中間片斷的獲取。經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增獲得大小為600bp的目的片段(圖2)。3.稗草中間片斷DNA序列經(jīng)過(guò)藍(lán)白斑篩選和測(cè)序得到ecGH31基因的中間片段序歹Ij (SED IN NO 5)(I)RACE (Rapid Amplification ofcDNAEnds，快速擴(kuò)增 cDNA末端法)法5‘和 3' 片斷克隆5' RACE 和 3' RACE 模板采用 GeneRacer Kit (維特金(Invitrogen)，產(chǎn)品批號(hào) L1500-01)進(jìn)行合成。試劑盒所提供接頭引物引物序分別為5'維特金夕卜部弓I物(GeneRacer outer primer):SEDINNO:35
3'維特金外部引物(GeneRacer Outer Primer):SEDINNO:36
5'維特金內(nèi)部引物(GeneRacer Inner primer):SEDINNO:37
3'維特金內(nèi)部引物(GeneRacer Inner Primer) :SED IN NO :38根據(jù)中間片斷DNA(600bp)序列用ft~imer5軟件設(shè)計(jì)基因特異引物(SED IN NO 6，SED IN NO 7 ；SED IN NO :9，SED IN NO 10)5' RACE 引物為 SED IN NO :6，SED IN NO :7。5' RACE PCR 的條件第一輪94"C 2min5cycles :98°C IOsec 72°C Imin5cycles :98°C IOsec 70°C Imin25cycles :98°C IOsec 66°C 30sec 68°C Imin第二輪94°C 2min25cycles :98°C IOsec 66°C 30sec 68°C Imin電泳驗(yàn)證后，PCR產(chǎn)物經(jīng)加尾，連接pUCm-T載體(上海生物工程有限公司)，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞JM109 (上海生物工程有限公司)，采用M13F和M13R進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，選擇大小約ISOObp左右的菌落進(jìn)行測(cè)序(英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司)結(jié)果24. ecGH31 基因的 5' RACE 序列ecGH31基因5' RACE擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果表明，獲得一條1800bp的cDNA片段 (圖幻。PCR產(chǎn)物經(jīng)加polyA尾，連接pUCm-T載體，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞JM109 (上海生物工程有限公司)，采用M13F和M13R進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果如圖4。選擇大小約1800bp左右的菌落進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果見(jiàn)SED IN NO 8 3' RACE 引物SED IN NO :9，SED IN NO 103 ‘ RACE PCR 條件第一輪94"C 2min5cycles :98°C IOsec 72°C Imin5cycles :98°C IOsec 70°C Imin25cycles :98°C IOsec 66°C 30sec 68°C Imin第二輪94°C 2min25cycles :98°C IOsec 66°C 30sec 68°C IminPCR產(chǎn)物經(jīng)加尾，連接pUCm-T載體(上海生物工程有限公司)，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞JM109 (上海生物工程有限公司)，采用M13F和M13R進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，選擇大小約 IlOObp左右的菌落進(jìn)行測(cè)序(英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司)。結(jié)果3ecGH31 基因的 3' RACE 序列ecGH31基因3' RACE擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果表明，獲得一條大小約IlOObp的cDNA 片段(圖5)。
PCR產(chǎn)物經(jīng)加POlyA尾，連接pUCm-Τ載體，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞JM109，采用M13F 和M13R進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果如圖6。選擇大小約IlOObp左右的菌落進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果如下(SED IN NO 11)。6. ecGH31基因的全長(zhǎng)序列理論拼接后完整序列見(jiàn)(SED IN NO 24)序列全長(zhǎng)2574bp，編碼區(qū)668-2143 = 1475bp理論拼接的DNA序列所推導(dǎo)的氨基酸序列見(jiàn)(SED IN N0:2O，491aa。(2) ecGH31全長(zhǎng)片斷的驗(yàn)證(1)三段法驗(yàn)證全長(zhǎng)ecGH31基因策略，見(jiàn)圖7用DANMar軟件把5端RACE片斷、中間片斷和3端RACE片斷進(jìn)行拼接成全長(zhǎng)的理論片斷(SED IN NO 對(duì))，以此理論片斷為模板，分成三段，分別用I^rimer primer5軟件， 設(shè)計(jì)三對(duì)巢式(nest)引物，進(jìn)行PCR，把內(nèi)PCR產(chǎn)物連接到pUCm-T載體上(上海生物工程有限公司)，經(jīng)過(guò)藍(lán)白斑篩選，用M13F和M13R引物(SED IN NO 3 SED IN NO 4)進(jìn)行測(cè)序(上海生工)。驗(yàn)證所用的引物第一部分驗(yàn)證所用的引物SED IN NO :12(143-164)；SED IN NO :13(1034-1057)第一輪大小915bpSED IN NO 14' (166-189)SED IN NO :15(862-886)第二輪大小721bp第二部分驗(yàn)證所用的引物SED IN NO :16(665-689)SED IN NO :17(1410-1433)第一輪大小759bpSED IN NO :18(747-767)SED IN NO :19(1384-1409)第二輪大小663bp第三部分驗(yàn)證所用的引物SED IN NO :201317-1341)SED IN NO :21 (2209-2237)第一輪大小921bpSED IN NO :22(1381-1401)SED IN NO :23(2006-2031)第二輪大小651bpPCR反應(yīng)條件如下(兩輪PCR的反應(yīng)條件是一樣的。不同的是反應(yīng)物和產(chǎn)物，但是條件是一樣的。第一輪反應(yīng)結(jié)果是擴(kuò)增的三個(gè)較大的片斷，第二輪擴(kuò)增的是以第一輪產(chǎn)物為模板擴(kuò)增的較小片斷)第一輪PCR反應(yīng)
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)稗草對(duì)二氯喹啉酸抗藥性的方法，包括在待檢測(cè)的稗草和對(duì)照稗草上處理二氯喹啉酸；檢測(cè)稗草GH3基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量；把GH3基因的表達(dá)量與對(duì)照處理的GH3基因的表達(dá)量進(jìn)行比較；比較的結(jié)果來(lái)進(jìn)行待檢測(cè)的稗草對(duì)二氯喹啉酸的抗藥性評(píng)價(jià)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，以稗草actin為內(nèi)參對(duì)照，待檢測(cè)的稗草GH3基因在轉(zhuǎn)錄水平的相對(duì)表達(dá)量大于100的為抗二氯喹啉酸類型。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，當(dāng)使用常規(guī)用量的二氯喹啉酸在用藥窗口期處理稗草后，在1小時(shí)內(nèi)待檢測(cè)的稗草體內(nèi)GH3的表達(dá)量升高幅度小于1. 5倍，在2小時(shí)至5 天內(nèi)其體內(nèi)GH3的表達(dá)量升高幅度為0. 2 1倍；在第6天其體內(nèi)的GH3的表達(dá)量升高幅度為2 3倍的為抗二氯喹啉酸類型。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，以稗草actin為內(nèi)參對(duì)照，待檢測(cè)的稗草GH3基因在轉(zhuǎn)錄水平的相對(duì)表達(dá)量小于50的為感二氯喹啉酸品種。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，使用常規(guī)用量的二氯喹啉酸在用藥窗口期處理稗草后，在1小時(shí)內(nèi)待檢測(cè)的稗草體內(nèi)GH3的表達(dá)量升高幅度大于4. 5倍，在2小時(shí)至3天內(nèi)其體內(nèi)GH3的表達(dá)量升高幅度為0. 3 1. 5倍。；在第4和第6天其體內(nèi)GH3的表達(dá)量升高幅度在2 3倍，在第5天其體內(nèi)二氯喹啉酸的表達(dá)量升高幅度大于16倍的為感二氯喹啉酸類型。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，以稗草actin為內(nèi)參對(duì)照，待檢測(cè)的稗草GH3基因在轉(zhuǎn)錄水平的相對(duì)表達(dá)量介于50 100為二氯喹啉酸敏感和抗性的中間類型。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，使用常規(guī)用量的二氯喹啉酸在用藥窗口期處理稗草后，在1小時(shí)內(nèi)待檢測(cè)的稗草體內(nèi)GH3的表達(dá)量升高幅度介于于1. 5 4. 5倍的為二氯喹啉酸敏感和抗性的中間類型。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7之一所述的方法，其中，所述的稗草的GH3為SEDIN NO :29，以及依此序列設(shè)計(jì)的引物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，檢測(cè)所述待檢測(cè)稗草GH3基因表達(dá)的方法為 Real-Time PCR，引物為序列 SED IN NO 31 和 SED IN NO :32。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，檢測(cè)所述對(duì)照稗草GH3基因表達(dá)的方法為 Real-Time PCR，引物為序列 SED IN NO 33 和 SED IN NO :34。
全文摘要
本發(fā)明提供一種新的檢測(cè)稗草對(duì)二氯喹啉酸抗藥性的基因片段以及引物以及利用這些基因片段和引物進(jìn)行檢測(cè)的方法。利用這些方法能夠準(zhǔn)確檢測(cè)出稗草是否對(duì)二氯喹啉酸具有抗藥性。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102242201SQ201110154159
公開日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2011年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月9日
發(fā)明者任海英, 俞瑞鮮, 吳聲敢, 吳長(zhǎng)興, 李崗, 王強(qiáng), 蒼濤, 趙學(xué)平, 陳麗萍 申請(qǐng)人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院