專利名稱：用于檢測稗草對二氯喹啉酸抗藥性的基因片段以及引物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于利用基因片段或序列進行雜草抗藥性檢測領域，特別地，屬于利用稗草對二氯喹啉酸抗藥性的基因片段以及引物來檢測稗草對二氯喹啉酸抗藥性以及利用這些基因檢測抗藥性的方法。
背景技術：
截止2011年5月全球已有197種雜草(115種雙子葉，82種單子葉)的358個生物型對19類化學除草劑產生了抗藥性，幾乎涵蓋各類重要的除草劑?？顾幮噪s草已成為雜草治理和農業(yè)生產的嚴重威脅，由其引發(fā)的嚴重經濟和安全問題倍受全球關注。稗草(Echinochloa crusgalli)是世界性的稻田惡性雜草，是我國農田15種嚴重危害雜草之首。而1988年德國巴斯夫公司開發(fā)的二氯喹啉酸(Quincloric)是防除稗草等禾草的特效藥，自1990在我國推廣使用以來，防效顯著，但是，由于十多年連續(xù)使用，在我國南北稻區(qū)逐漸出現(xiàn)抗藥性稗草，而且日趨嚴重?？顾幮园薏莸穆雍筒睅砹嗽S多負面效應，如降低生物多樣性、增加農藥的投入，污染作物的產地環(huán)境，降低水稻的產量和品質等。GH3 (Gretchen Hagen 3)基因最早是從大豆中克隆出的植物生長素早期響應基因 (Primary-response genes)，后來在擬南芥(有19個GH3家族成員)、水稻(有13個GH3 的類似基因)，煙草(至少1個GH3基因)，辣椒(1個GH3基因))，印度芥菜(有2個GH3 的類似基因)及苔蘚植物P. patens (有3個GH3家族成員)中發(fā)現(xiàn)許多GH3基因或其類似基因，有的GH3以基因家族的形式存在，例如在擬南芥基因組中，在第5條染色體上有5個 GH3基因，而且這些基因方向一致地串聯(lián)排列在一起。生長素能夠誘導GH3基因家族中的大部分基因快速、瞬時地表達。這種快速應答是調節(jié)植物體內生長素動態(tài)平衡的機制之一。 植物GH3蛋白具有IAA等植物生長素氨基酸化合成酶和腺苷化合成酶活性?？焖?、準確、高通量的雜草抗藥性檢測方法，是抗藥性雜草防治的一個關鍵環(huán)節(jié)。 目前雜草抗藥性檢測方法主要有(1)、溫室整株植物鑒定法。它是國際雜草抗藥性管理組織推薦的一種主要技術，優(yōu)點是簡便易行，重復性好。缺點是溫室空間大，試驗周期長、不能對當季雜草作鑒定。( 、組織或器官的形態(tài)結構比較鑒定法，包括種子或幼苗檢測法、分蘗檢測法、花粉粒萌發(fā)法、葉圓片浸漬技術測定等，其優(yōu)點是簡便易行，缺點是不準確。(3)、 細胞或細胞器水平測定，包括葉片內葉綠素熒光測定法、離體葉綠體測定技術、光合速率測定法，優(yōu)點是準確，缺點是復雜、對技術和設備要求高。(4)、生理生化鑒定法，主要是酶活性測定法，缺點是只適合靶標酶已知的雜草。(5)、DNA分析技術鑒定法，主要是靶標基因序列的突變位點比較。缺點是，只適合靶基因突變的雜草。(6)、蛋白質水平的鑒定法，主要是 ELISA法對抗性雜草的特異蛋白質的檢測。缺點是，只適合已知特異蛋白質的抗藥性雜草。標志基因法檢測雜草抗藥性優(yōu)勢明顯，首先它可實現(xiàn)大規(guī)模、高能通量的樣品量檢測，因而可迅速掌握大面積農田的雜草抗藥性水平和范圍。其次對當季稻田發(fā)生的雜草草實現(xiàn)檢測，掌握其抗藥性水平。第三是檢測周期短、出結果快，只需要幾天便可得結果。其缺點是對儀器要求較高，熒光定量PCR儀是較貴。

發(fā)明內容
一個標志基因只能檢測一種或一類農藥的雜草抗藥性。所以挖掘農藥的標志基因是發(fā)展和完善標志基因法的必由之路。農藥的標志基因應該具備在不同抗藥性水平的雜草植株中，標志基因在轉錄水平的表達量存在差異，這種差異是區(qū)分雜草抗藥性的定量指標，而且其表達量和抗藥性水平存在較好的線性關系。為了進一步驗證結果的準確性。標志基因還應該有其它的特征，比如在對應農藥處理雜草后，在不同抗藥性水平的雜草植株中， 標志基因有不同的表達特征。本發(fā)明小組人員提出了通過檢測標志基因在轉錄水平的表達量是一種新的雜草抗藥性檢測方法。GH3基因是植物生長素儲存代謝基因，在維持細胞內正常生長素濃度方面起重要作用。本發(fā)明小組從抗二氯喹啉酸稗草克隆了 GH3基因的同源基因并命名為 ec-GH31。ecGH31基因名稱中，按國際命名習慣EC是稗草拉丁文Echinochloa crusgalli 的首字母縮寫。GH3是來自稗草的與GH3基因同源的基因，1指稗草的GH3基因家族中克隆的第一個基因。它在抗、感二氯喹啉酸稗草植株體內的表達量明顯不同，用二氯喹啉酸處理防治適期的抗、感稗植株后，具有明顯不同的表達曲線。以上特征使GH3基因成為檢測稗草抗二氯喹啉酸水平的標志基因，為建立一種雜草抗藥性檢測新方法提供了可能。采用RACE法，從來自浙江的抗二氯喹啉酸稗草中，克隆了生長素IAA代謝相關基因并命名為ec-GH31。該基因閱讀框長度為1839bp，編碼612個氨基酸?；赗eal-time PCR實驗結果發(fā)現(xiàn)，該基因在不同水平的抗二氯喹啉酸稗草中表達量存在明顯特征性差異， 故提出稗草對二氯喹啉酸抗藥性的檢測方法。一方面，本發(fā)明提供用于檢測稗草屬于對二氯喹啉酸抗性的基因序列。一種用來檢測稗草對二氯喹啉酸抗藥性的基因序列，其中該序列為SED IN N0:29。優(yōu)選的，所述的基因序列，其中，該基因序列包括依所述的續(xù)列設計的引物。優(yōu)選的，其中所述的引物序列為IN N0:31禾口 SED IN NO :32 ；或SED IN NO 33禾口 SED IN NO: 34。優(yōu)選的，所述的檢測為檢測該基因序列在轉錄水平的表達量。優(yōu)選的，其中檢測的方法為 Real-Time PCR 方法。優(yōu)選的，所述的檢測包括以下步驟在待檢測的稗草和對照稗草上取樣產生樣本； 在待檢測的稗草和對照稗草上用二氯喹啉酸處理后在不同時間取樣產生樣本；檢測稗草樣本的GH3基因在轉錄水平的表達量；把GH3基因的表達量與對照處理的GH3基因的表達量進行比較；比較的結果來進行待檢測的稗草對二氯喹啉酸的抗藥性評價。優(yōu)選的，檢測對照稗草所使用的引物為序列SED INN0:33和SED INNO 34。更優(yōu)選的，其中，檢測待檢測的稗草所使用的引物為序列SED IN NO :31禾口 SED IN NO :32。另一方面，本發(fā)明提供一種檢測稗草對二氯喹啉酸抗藥性的方法，包括在待檢測的稗草和對照稗草上取樣產生樣本；在待檢測的稗草和對照稗草上用二氯喹啉酸處理后在不同時間取樣產生樣本；檢測稗草樣本的GH3基因在轉錄水平的表達量；把GH3基因的表達量與對照處理的GH3基因的表達量進行比較；比較的結果來進行待檢測的稗草對二氯喹啉酸的抗藥性評價。
優(yōu)選的，以稗草actin為對照，待檢測的稗草GH3基因在轉錄水平的相對表達量大于100的為抗二氯喹啉酸類型。更優(yōu)選的，其中，當使用常規(guī)用量的二氯喹啉酸在用藥窗口期處理稗草后，在1小時內待檢測的稗草體內GH3的表達量升高幅度小于1. 5倍，在2小時至5天內其體內GH3的表達量升高幅度為0. 2 1倍；在第6天其體內的GH3的表達量升高幅度為2 3倍的為抗二氯喹啉酸類型。優(yōu)選的，其中，以稗草actin為對照，待檢測的稗草GH3基因在轉錄水平的相對表達量小于50的為感二氯喹啉酸品種。優(yōu)選的，其中，使用常規(guī)用量的二氯喹啉酸在用藥窗口期處理稗草后，在1小時內待檢測的稗草體內GH3的表達量升高幅度大于4. 5倍，在2小時至3天內其體內GH3的表達量升高幅度為0. 3 1. 5倍；在第4和第6天其體內GH3的表達量升高幅度在2 3倍，在第5天其體內二氯喹啉酸的表達量升高幅度大于16倍的為感二氯喹啉酸類型。優(yōu)選的，其中，以稗草actin為對照，待檢測的稗草GH3基因在轉錄水平的相對表達量介于50 100為二氯喹啉酸敏感和抗性的中間類型。優(yōu)選的，其中，使用常規(guī)用量的二氯喹啉酸在用藥窗口期處理稗草后，在1小時內待檢測的稗草體內GH3的表達量升高幅度介于于1. 5 4. 5倍的為二氯喹啉酸敏感和抗性的中間類型。在以上所有的實施方式中，所述的稗草的GH3為SED IN NO :29，以及依此序列設計的引物。優(yōu)選的，其中，檢測所述待檢測稗草GH3基因表達的方法為Real-Time PCR，引物為序列SED IN N0:31和SED IN NO :32。更優(yōu)選的，其中，檢測所述對照稗草GH3基因表達的方法為Real-Time PCR，引物為序列SED IN NO 33和SED IN NO :34。另外，該方法還包括以下特征(一)、具有如下特征的稗草屬于對二氯喹啉酸有抗藥性的稗草(1)以稗草 actin (Ct)為內參，稗草ecGH31基因在轉錄水平的相對表達量大于100。(2)使用常規(guī)用量的二氯喹啉酸在用藥窗口期處理稗草后，在1小時內其體內ecGH31的表達量升高幅度小于 1. 5倍，在2小時至5天內其體內ecGH31的表達量升高幅度為0. 2 1倍。在第6天其體內的ecGH31的表達量升高幅度為2 3倍?；?，(二)、具有如下特征的稗草屬于對二氯喹啉酸敏感的稗草(a)以稗草 actin(Ct)為內參，稗草ecGH31基因在轉錄水平的相對表達量小于50。(b)使用常規(guī)用量的二氯喹啉酸在用藥窗口期處理稗草后，在1小時內其體內ecGH31的表達量升高幅度大于 4. 5倍，在2小時至3天內其體內ecGH31的表達量升高幅度為0. 3 1. 5倍。在第4和第 6天其體內ecGH31的表達量升高幅度在2 3倍，在第5天其體內二氯喹啉酸的表達量升高幅度大于16倍?；颍?三)、具有如下特征的稗草屬于對二氯喹啉酸敏感和抗性的中間類型⑴以稗草actin (Ct)為內參，稗草ecGH31基因在轉錄水平的相對表達量介于50 100。(2)使用常規(guī)用量的二氯喹啉酸在用藥窗口期處理稗草后，在1小時內其體內ecGH31的表達量升高幅度介于于1. 5 4. 5倍。或者，以上三個方面的組合或同時滿足以上三個條件的檢測方法。


圖1為本發(fā)明的一個實施方式中稗草總RNA電泳驗證圖2為本發(fā)明的一個實施方式中稗草中間片斷RT-PCR電泳驗證圖；圖3為本發(fā)明的一個實施方式中ecGH35RACE_PCR產物(約1800bp)電泳圖；圖4為本發(fā)明的一個實施方式中ecGH35RACE菌落PCR電泳結果圖；圖5為本發(fā)明的一個實施方式中ecGH313RACE_PCR產物(約IlOObp)電泳圖；圖6為本發(fā)明的一個實施方式中ecGH313RACE菌落PCR電泳結果圖；圖7為本發(fā)明的一個實施方式中三個片段位置關系及其引物位置示意；圖8為本發(fā)明的一個實施方式中驗證ecGH31全長的三個內nest PCR電泳結果圖；圖9為本發(fā)明的一個實施方式中ecGH31與擬南芥的GH3家族成員的親緣關系圖；圖10為本發(fā)明的一個實施方式中ec-GH3-R基因擴增曲線分析圖；圖11為本發(fā)明的一個實施方式中ec-GH3-R基因熔點曲線分析(Tm = 80. 5°C ) 圖；圖12為本發(fā)明的一個實施方式中ec-GH3-S基因擴增曲線分析圖；圖13為本發(fā)明的一個實施方式中ec-GH3_S基因熔點曲線分析(Tm = 80. 5°C ) 圖；圖14為本發(fā)明的一個實施方式中ec-GH3基因擴增效率分析圖；圖15為本發(fā)明的一個實施方式中ec-actin-R基因擴增曲線分析圖；圖16為本發(fā)明的一個實施方式中ec-actin-R基因熔點曲線分析(Tm = 84°C ) 圖；圖17為本發(fā)明的一個實施方式中ec-actin-S基因擴增曲線分析圖；圖18為本發(fā)明的一個實施方式中ec-actin-S基因熔點曲線分析(Tm = 84°C ) 圖；圖19為本發(fā)明的一個實施方式中ec-actin基因擴增效率分析圖。 實施例為了進一步對本發(fā)明進行詳細的說明，現(xiàn)在以具體實施例子進行說明，這些說明僅僅是本發(fā)明的具體方式的有限的列絕，并不對本發(fā)明做任何的限制。實施例1 :ecGH31基因的克隆材料準備選取經過溫室整株植物鑒定法(參見Moss，S. R. (1995) Techniques for determining herbicide resistance.Proceedings of the Brighton Crop Protection Conference-Weeds, 547-556.)鑒定的抗二氯喹啉酸稗草種子，25°C下置于濕潤濾紙上催芽 3-5天，選取發(fā)芽整齊的稗草幼苗移栽于人工土壤中，培養(yǎng)至3-5葉期，備用。用50%殺稗王(江蘇新沂中凱農用化工有限公司)配成0.5g/L濃度(有效成分)，均勻噴霧，0. 5小時摘取葉片迅速浸入液氮保存。實施例1. 1中間片斷的克隆簡并引物設計與合成在NCBI中找出擬南芥、水稻、玉米、煙草、葡萄的GH3的同源基因DNA序列，在DDBJ 網站在線比對，設計簡并引物并合成(上海生工生物工程技術服務有限公司合成)簡并引物序列為SED IN NO 1 和 SED IN NO :2。組織總RNA提取按TransZOL總RNA提取試劑盒說明進行(北京全式金生物技術有限公司)。用 DEPC處理水溶解RNA，并進行濃度和純度的測定，用12g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。1.稗草總RNA的提取提取、純化的稗草葉片總RNA，用12g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳結果見圖1。可看到^S rRNA和18S rRNA兩條帶，二者含量比值大約為2 1，說明所提的RNA完整，無降解(圖1)。RNA的含量和純度可滿足下一步試驗要求。逆轉錄合成cDNA第一條鏈按cDNA 第一條鏈合成試劑試劑盒(TransScript II First-Strand cDNA Synthesis SuperMix)(北京全式金生物技術有限公司，產品批號#D11030)說明進行反轉錄合成 cDNA 第一條鏈，其中以 Anchored Olig(dT)2(1Primer (引物序列為SED IN NO :39) 為引物。PCR擴增中間片斷以逆轉錄合成cDNA的第一條鏈作模板和設計的簡并引物(SED IN NO :1和SED IN NO 2)進行 RT-PCR(primerSTAR HS(premix)，Takara), PCR 條件為；35 個循環(huán)，條件為98°C，IOsec ；57°C,5sec ；72°C，48seC。結果進行1 %瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒fesyPure Quick Gel Extraction Kit (北京全式金生物技術有限公司；產品批號 #E20205)回收600bp大小片斷。連接與轉化與藍白斑篩選用含pEASY-Blunt Cloning Vector的試劑盒(北京全式金生物技術有限公司) 把目的片斷(經過RT-PCR擴增后的600bp大小)連接并轉化Trans-Tl (DH5 α )感受態(tài)細胞(北京全式金生物技術有限公司，產品批號#Ε200331)，通過藍白斑(藍白斑篩選的主要內容是pEASY-Blunt Cloning Vector的試劑盒中的載體和Trans-Tl (DH5 α )感受態(tài)細胞) 篩選轉化子。測序通用引物M13F，M13R(SED IN NO 3SED IN NO 4)進行測序(上海生工生物工程技術服務有限公司合成)結果1(一)ecGHW基因的克隆2.稗草中間片斷的獲取。經RT-PCR擴增獲得大小為600bp的目的片段(圖2)。3.稗草中間片斷DNA序列經過藍白斑篩選和測序得到ecGH31基因的中間片段序歹Ij (SED IN NO 5)(I)RACE (Rapid Amplification ofcDNAEnds，快速擴增 cDNA末端法)法5‘和 3' 片斷克隆5' RACE 和 3' RACE 模板采用 GeneRacer Kit (維特金(Invitrogen)，產品批號 L1500-01)進行合成。試劑盒所提供接頭引物引物序分別為5'維特金外部引物(GeneRacer outer primer) :SED IN NO :353'維特金外部引物(GeneRacer Outer Primer) :SED IN NO :365'維特金內部引物(GeneRacer Innerprimer) :SED IN NO :37
3'維特金內部引物(GeneRacer Inner Primer) :SED IN NO :38根據(jù)中間片斷DNA(600bp)序列用ft~imer5軟件設計基因特異引物(SED IN NO 6，SED IN NO 7 ；SED IN NO :9，SED IN NO 10)5' RACE 引物為 SED IN NO :6，SED IN NO :7。5' RACE PCR 的條件第一輪94"C 2min5cycles :98°C IOsec 72°C Imin5cycles :98°C IOsec 70°C Imin25cycles :98°C IOsec 66°C 30sec 68°C Imin第二輪94°C 2min25cycles :98°C IOsec 66°C 30sec 68°C Imin電泳驗證后，PCR產物經加尾，連接pUCm-T載體(上海生物工程有限公司)，然后轉化感受態(tài)細胞JM109 (上海生物工程有限公司)，采用M13F和M13R進行菌落PCR擴增，選擇大小約ISOObp左右的菌落進行測序(英濰捷基(上海)貿易有限公司)結果24. ecGH31 基因的 5' RACE 序列ecGH31基因5' RACE擴增產物的電泳結果表明，獲得一條1800bp的cDNA片段 (圖幻。PCR產物經加polyA尾，連接pUCm-T載體，然后轉化感受態(tài)細胞JM109 (上海生物工程有限公司)，采用M13F和M13R進行菌落PCR擴增，電泳結果如圖4。選擇大小約1800bp左右的菌落進行測序，結果見SED IN NO 8 3' RACE 引物SED IN NO :9，SED IN NO 103 ‘ RACE PCR 條件第一輪94"C 2min5cycles :98°C IOsec 72°C Imin5cycles :98°C IOsec 70°C Imin25cycles :98°C IOsec 66°C 30sec 68°C Imin第二輪94°C 2min25cycles :98°C IOsec 66°C 30sec 68°C IminPCR產物經加尾，連接pUCm-T載體(上海生物工程有限公司)，然后轉化感受態(tài)細胞JM109 (上海生物工程有限公司)，采用M13F和M13R進行菌落PCR擴增，選擇大小約 IlOObp左右的菌落進行測序(英濰捷基(上海)貿易有限公司)。結果3ecGH31 基因的 3' RACE 序列ecGH31基因3' RACE擴增產物的電泳結果表明，獲得一條大小約IlOObp的cDNA 片段(圖5)。
PCR產物經加POlyA尾，連接pUCm-Τ載體，然后轉化感受態(tài)細胞JM109，采用M13F 和M13R進行菌落PCR擴增，電泳結果如圖6。選擇大小約IlOObp左右的菌落進行測序，結果如下(SED IN NO 11)。6. ecGH31基因的全長序列理論拼接后完整序列見(SED IN NO 24)序列全長2574bp，編碼區(qū)668-2143 = 1475bp理論拼接的DNA序列所推導的氨基酸序列見(SED IN N0:2O，491aa。(2) ecGH31全長片斷的驗證(1)三段法驗證全長ecGH31基因策略，見圖7用DANMar軟件把5端RACE片斷、中間片斷和3端RACE片斷進行拼接成全長的理論片斷(SED IN NO 對)，以此理論片斷為模板，分成三段，分別用I^rimer primer5軟件， 設計三對巢式(nest)引物，進行PCR，把內PCR產物連接到pUCm-T載體上(上海生物工程有限公司)，經過藍白斑篩選，用M13F和M13R引物(SED IN NO 3SED IN NO 4)進行測序 (上海生工)。驗證所用的引物第一部分驗證所用的引物SED IN NO :12(143-164)；SED IN NO :13(1034-1057)第一輪大小915bpSED IN NO 14' (166-189)SED IN NO :15(862-886)第二輪大小721bp第二部分驗證所用的引物SED IN NO :16(665-689)SED IN NO :17(1410-1433)第一輪大小759bpSED IN NO :18(747-767)SED IN NO :19(1384-1409)第二輪大小663bp第三部分驗證所用的引物SED IN NO :201317-1341)SED IN NO :21 (2209-2237)第一輪大小921bpSED IN NO :22(1381-1401)SED IN NO :23(2006-2031)第二輪大小651bpPCR反應條件如下(兩輪PCR的反應條件是一樣的。不同的是反應物和產物，但是條件是一樣的。第一輪反應結果是擴增的三個較大的外部片斷，第二輪擴增的是以第一輪產物為模板擴增的較小的內部片斷)第一輪PCR反應
9
權利要求
1.一種用來檢測稗草對二氯喹啉酸抗藥性的基因序列，其中該序列為SED IN N0:29。
2.根據(jù)權利要求1所述的基因序列，其中，該基因序列包括依所述的續(xù)列設計的引物。
3.根據(jù)權利要求2所述的基因序列，其中所述的引物序列為INNO 31和SED IN NO 32 ；或 SED IN NO 33 和 SED IN NO :34。
4.根據(jù)權利要求2所述的基因序列，其中所述的檢測為檢測該基因序列在轉錄水平的表達量。
5.根據(jù)權利要求2所述的基因序列，其中檢測的方法為Real-TimePCR方法。
6.根據(jù)權利要求5所述的基因序列，其中，所述的檢測包括以下步驟在待檢測的稗草和對照稗草上處理二氯喹啉酸；檢測稗草GH3基因在轉錄水平的表達量；把GH3基因的表達量與對照處理的GH3基因的表達量進行比較；比較的結果來進行待檢測的稗草對二氯喹啉酸的抗藥性評價。
7.根據(jù)權利要求5所述的基因序列，其中，檢測對照稗草所使用的引物為序列SEDIN NO 33 和 SED IN NO :34。
8.根據(jù)權利要求5所述的基因序列，其中，檢測待檢測的稗草所使用的引物為序列SED IN NO 31 和 SED IN NO :32。
全文摘要
本發(fā)明提供一種新的檢測稗草對二氯喹啉酸抗藥性的基因片段以及引物以及利用這些基因片段和引物進行檢測的方法。利用這些方法能夠準確檢測出稗草是否對二氯喹啉酸具有抗藥性。
文檔編號C12Q1/68GK102230005SQ20111015416
公開日2011年11月2日 申請日期2011年6月9日 優(yōu)先權日2011年6月9日
發(fā)明者任海英, 俞瑞鮮, 吳聲敢, 吳長興, 李崗, 王強, 蒼濤, 趙學平, 陳麗萍 申請人:浙江省農業(yè)科學院