專利名稱：一種用于治療真菌性疾病的長梗木霉裂解酶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種裂解酶的制備方法，具體涉及一種用于治療真菌性疾病的長梗木霉裂解酶的制備方法。
背景技術(shù)：
目前國內(nèi)外有利用溶菌酶作為治療細(xì)菌性疾病藥物的例子，但是還沒有利用長梗木酶的裂解酶作為治療真菌性疾病的研究與文獻(xiàn)報(bào)道，也沒有相關(guān)的關(guān)于其制備方法的文獻(xiàn)的公開。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于治療真菌性疾病的長梗木霉裂解酶的制備方法， 該方法發(fā)酵時(shí)間短、成本低；采用該方法制備的目標(biāo)酶的得率高，目標(biāo)酶表達(dá)量高以及目標(biāo)酶的純度和酶活性高。本發(fā)明的第一個(gè)目的是通過如下技術(shù)手段來實(shí)現(xiàn)的一種用于治療真菌性疾病的長梗木霉裂解酶的制備方法，含以下步驟配制長梗木霉的發(fā)酵培養(yǎng)基，在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入長梗木霉菌種，調(diào)節(jié)溫度為25-30°C，pH值為6. 0-7. 5，溶氧為40%_55%，進(jìn)行發(fā)酵3_6天， 得長梗木霉的發(fā)酵液；將所得的長梗木霉發(fā)酵液進(jìn)行分離純化，獲得長梗木霉的裂解酶。本發(fā)明所述的發(fā)酵培養(yǎng)基含以下重量百分含量的組分蔗糠3-8%、鼓皮 1.0-5. 5%、硫酸銨1.5-4%、磷酸二氫鉀0.5-2%、硫酸鎂0. 5-2. 5%、瓊脂1. 0-3. 0%、微量元素0. 05-0. 5%、其余為去離子水。本發(fā)明長梗木霉的接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基總體積的5-20%，長梗木霉菌種的菌濃度為 15-25%。本發(fā)明長梗木霉發(fā)酵液的分離純化包括以下具體步驟
(1)將長梗木霉發(fā)酵液離心除去懸浮菌體，采用超濾膜進(jìn)行過濾，收集粗酶液；
(2)調(diào)節(jié)粗酶液溫度為-6-10°C，加入冰乙醇，混勻，靜置后，離心得沉淀物，在沉淀物中加入醋酸緩沖液溶解得到濃縮粗酶液，備用；
(3)將濃縮粗酶液采用SartobindQ離子交換膜上樣，并用平衡緩沖液和含有NaCl 的醋酸緩沖液按線性梯度從0到100%進(jìn)行洗脫，分別收集洗脫峰，對(duì)各洗脫液進(jìn)行活性檢測(cè)；
(4)將各洗脫液采用kphacrylS-200HR凝膠過濾柱上樣，用含有NaCl的醋酸緩沖液洗脫，收集各組分，采用HPLC檢測(cè)各收集組分的純度，收集純度大于85%的組分，即為長梗木霉裂解酶。在上述長梗木酶發(fā)酵液的分離純化步驟中
步驟(1)中離心時(shí)的溫度為0°c，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為3000 r/min ；超濾膜為中空纖維超濾膜，其截留分子量為lOOOODa。步驟⑵中冰乙醇的加入量為粗酶液總體積的3-3. 5倍，靜置時(shí)的溫度為4士 1°C，醋酸緩沖液的PH為5. 4，濃度為20 mmol. L—1，其加入量為粗酶液總體積的2-2. 5倍。步驟(3)中Sartobind Q離子交換膜上樣前用醋酸緩沖液進(jìn)行平衡，平衡時(shí)采用的醋酸緩沖液的PH為5. 4，濃度為20 mmol. L—1 ；洗脫時(shí)的平衡緩沖液為醋酸緩沖液，其pH 為5. 8，濃度為20 mmol化―1 ；洗脫時(shí)的含有NaCl的醋酸緩沖液中NaCl的濃度為1 mol · Λ 醋酸緩沖液的PH為5. 4，濃度為20 mmol · L—1，平衡緩沖液和含有NaCl的醋酸緩沖液的體積比為1:1。步驟(4)中kphacryl S-200HR凝膠過濾柱上樣用醋酸緩沖液進(jìn)行平衡，平衡時(shí)采用的醋酸緩沖液的PH為5. 4，濃度為20 mmol. L—1 ；洗脫時(shí)的含有NaCl的醋酸緩沖液中 NaCl的濃度為1 mol · L—1，醋酸緩沖液的ρΗ為5. 4，濃度為20 mmol. L-1。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)
(1)菌體得率高，達(dá)1(Γ75克菌體濕重/L發(fā)酵液；
(2)目標(biāo)酶表達(dá)量高(包括相對(duì)含量和絕對(duì)含量)，其表達(dá)量可達(dá)到10000單位/升到 18000單位/升；
(3)發(fā)酵時(shí)間短；
(4)發(fā)酵成本低；
(5)分離工藝精密，獲得產(chǎn)物純度高，獲得酶活高。


圖1是粗酶液經(jīng)Sartobind Q離子交換的洗脫液各組分的洗脫峰洗脫順序圖； 圖2是濃縮粗酶液經(jīng)kphacryl S-200HR分離獲得長梗木霉裂解酶的洗脫峰E2 ； 圖3是經(jīng)分離純化后裂解酶的HPLC圖4是長梗木霉裂解酶的最適PH圖； 圖5是長梗木霉裂解酶的最適溫度圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例 1
A、用于培養(yǎng)長梗木霉以產(chǎn)生長梗木霉裂解酶的發(fā)酵培養(yǎng)基的配方如下 蔗糠 3%、鼓皮1.0%、硫酸銨1.5%、磷酸二氫鉀0.5%、硫酸鎂0.5%、瓊脂 1.0% 、微量元素0.05%、其余為去離子水，以重量百分比計(jì)。B、利用上述發(fā)酵培養(yǎng)基制備長梗木霉裂解酶的方法如下
按上述配方配制20L發(fā)酵液(用去離子水)于發(fā)酵罐中，取長梗木霉菌種，其中長梗木酶菌種購自廣東省微生物研究所，為長梗木霉(Trichoderma Longibrachiatum Rifai) 958-11菌株進(jìn)行選育獲得，經(jīng)滅菌后接種菌種，菌種的接種量按發(fā)酵液體積的5%，菌濃為 15%，菌濃是指菌液離心后計(jì)算固體菌絲占整個(gè)菌液的體積比例，同時(shí)設(shè)定溶氧水平為50%， 用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)節(jié)PH值為7.0，其中ρΗ值可以采用酸堿自動(dòng)平衡調(diào)節(jié)，開始進(jìn)行培養(yǎng)， 保持溫度沈士 1 °C，發(fā)酵時(shí)間為3天。發(fā)酵完畢，經(jīng)分離純化，分離純化的具體步驟為
(1)將長梗木霉的發(fā)酵液于0°c，3000 r/min離心去除懸浮菌體，采用截留分子量為 10000的中空纖維超濾膜，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行超濾收集粗酶液；(2)取粗酶液，在-6°C的條件下，按體積1:3的比例加入冰乙醇，攪拌混勻于4°C靜置， 離心得沉淀物，加入50 mL20 mmol.L—1醋酸緩沖液(pH 5.4)溶解得到濃縮粗酶液，備用；
(3)采用SartobindQ離子交換膜，上樣前用20 mmol -L"1的醋酸緩沖液(pH 5.4)進(jìn)行平衡后，取上述粗酶液上樣，用體積比為1:1的平衡緩沖液(PH為5. 4，濃度為20 mmol. L-1的醋酸緩沖液)和含有1 mol · L-1 NaCl的20 mmol · L-1醋酸緩沖液(pH 5. 4)，按線性梯度從0到100%進(jìn)行洗脫，分別收集洗脫峰，對(duì)各組分進(jìn)行活性檢測(cè)，如附圖1所示；
(4)采用kphacrylS-200HR凝膠過濾柱，上樣品前用20 mmol化―1的醋酸緩沖液(pH 5. 4)進(jìn)行平衡后，取離子交換層析得到的活性組分上樣，收集各組分；如附圖2所示；
(5)利用HPLC檢測(cè)分級(jí)收集產(chǎn)物純度，收集純度大于85%的組分，即為長梗木霉裂解酶；如附圖3所示；其中HPLC的流動(dòng)相配制為=NaCl 8 g，L-Arg-HCl 42 g,Na2HPO4. 12H20 8g ,H2O 1000ml ；色譜柱GF-450 (agilent 9.4 X 250mm, 6 μ m)；流速1. 5 ml/min ；柱溫 25 0C ；檢測(cè)波長:280nm ；
(6)對(duì)長梗木霉裂解酶進(jìn)行活性測(cè)試，觀察其去除真菌效果，具體可參見下表1。經(jīng)上述分離純化步驟后，長梗木霉裂解酶的菌體的得率為30克菌體濕重/升發(fā)酵液，目標(biāo)酶效價(jià)12000單位/升，純度86. 4%，其最適宜溫度和pH值如附圖4和5所示。實(shí)施例2
A、用于培養(yǎng)長梗木霉以產(chǎn)生長梗木霉裂解酶的發(fā)酵培養(yǎng)基的配方如下 蔗糠5%、鼓皮2. 0%、硫酸銨2. 5%、磷酸二氫鉀1. 5%、硫酸鎂1. 5%、瓊脂2. 0%、微量元素0.3%、其余為去離子水，以重量百分比計(jì)。B、利用上述發(fā)酵培養(yǎng)基制備長梗木霉裂解酶的方法如下
按上述配方配制20L發(fā)酵液(用去離子水)于發(fā)酵罐中，取長梗木霉菌種，其中長梗木酶菌種由廣東省微生物研究所提供，為長梗木霉(Trichoderma Longibrachiatum Rifai) 958-11菌株進(jìn)行選育獲得，經(jīng)滅菌后接種菌種，菌種的接種量按發(fā)酵液體積的10%，菌濃為 20%，菌濃是指菌液離心后計(jì)算固體菌絲占整個(gè)菌液的體積比例，同時(shí)設(shè)定溶氧水平為40%， 用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)節(jié)PH值為7.5，其中pH值可以采用酸堿自動(dòng)平衡調(diào)節(jié)，開始進(jìn)行培養(yǎng)， 保持溫度27 士 1 °C，發(fā)酵時(shí)間為4天。發(fā)酵完畢，經(jīng)分離純化，分離純化的具體步驟為
(1)將長梗木霉的發(fā)酵液于0°c，3000r/min離心去除懸浮菌體，采用截留分子量為 10000的中空纖維超濾膜，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行超濾收集粗酶液；
(2)取粗酶液，在-6°C的條件下，按體積1:3.5的比例加入冰乙醇，攪拌混勻于5°C靜置，離心得沉淀物，加入50 mL20 mmol. Γ1醋酸緩沖液(pH 5.4)溶解得到濃縮粗酶液，備用；
(3)采用SartobindQ離子交換膜，上樣前用20 mmol -L"1的醋酸緩沖液(pH 5.4)進(jìn)行平衡后，取上述粗酶液上樣，用體積比為1:1的平衡緩沖液(PH為5. 4，濃度為20 mmol. L-1的醋酸緩沖液)和含有1 mol · L-1 NaCl的20 mmol · L-1醋酸緩沖液(pH 5. 4)，按線性梯度從0到100%進(jìn)行洗脫，分別收集洗脫峰，對(duì)各組分進(jìn)行活性檢測(cè)，如附圖1所示；
(4)采用kphacrylS-200HR凝膠過濾柱，上樣品前用20 mmol化―1的醋酸緩沖液(pH 5. 4)進(jìn)行平衡后，取離子交換層析得到的活性組分上樣，收集各組分；如附圖2所示；
(5)利用HPLC檢測(cè)分級(jí)收集產(chǎn)物純度，收集純度大于85%的組分，即為長梗木霉裂解酶；如附圖3所示；其中HPLC的流動(dòng)相配制為=NaCl 8 g，L-Arg-HCl 42 g,Na2HPO4. 12H20 8g ,H2O 1000ml ；色譜柱GF-450 (agilent 9.4 X 250mm, 6 μ m)；流速1. 5 ml/min ；柱溫 25 0C ；檢測(cè)波長:280nm ；
(6)對(duì)長梗木霉裂解酶進(jìn)行活性測(cè)試，觀察其去除真菌效果，具體可參見下表1。經(jīng)上述分離純化步驟后，長梗木霉裂解酶的菌體得率為45克菌體濕重/升發(fā)酵液，目標(biāo)酶效價(jià)14500單位/升。純度85. 5%，其最適宜溫度和pH值如附圖4和5所示。實(shí)施例3
A、用于培養(yǎng)長梗木霉以產(chǎn)生長梗木霉裂解酶的發(fā)酵培養(yǎng)基的配方如下 蔗糠 8%、鼓皮5. 5%、硫酸銨4%、磷酸二氫鉀2%、硫酸鎂2. 5%、瓊脂3. 0%、微量元素 0. 5%、其余為去離子水，以重量百分比計(jì)。B、利用上述發(fā)酵培養(yǎng)基制備長梗木霉裂解酶的方法如下
按上述配方配制20L發(fā)酵液(用去離子水)于發(fā)酵罐中，取長梗木霉菌種，其中長梗木酶菌種由廣東省微生物研究所提供，為長梗木霉(Trichoderma Longibrachiatum Rifai) 958-11菌株進(jìn)行選育獲得，經(jīng)滅菌后接種菌種，菌種的接種量按發(fā)酵液體積的15%，菌濃為 25%，菌濃是指菌液離心后計(jì)算固體菌絲占整個(gè)菌液的體積比例，同時(shí)設(shè)定溶氧水平為45%， 用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)節(jié)PH值為6.0，其中pH值可以采用酸堿自動(dòng)平衡調(diào)節(jié)，開始進(jìn)行培養(yǎng)， 保持溫度四士 1 °C，發(fā)酵時(shí)間為6天。發(fā)酵完畢，經(jīng)分離純化，分離純化的具體步驟為
(1)將長梗木霉的發(fā)酵液于0°C，3000r/min離心去除懸浮菌體，采用截留分子量為 10000的中空纖維超濾膜，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行超濾收集粗酶液；
(2)取粗酶液，在-6°C的條件下，按體積1:3的比例加入冰乙醇，攪拌混勻于;TC靜置， 離心得沉淀物，加入50 mL20 mmol.L—1醋酸緩沖液(pH 5.4)溶解得到濃縮粗酶液，備用；
(3)采用SartobindQ離子交換膜，上樣前用20 mmol -L"1的醋酸緩沖液(pH 5.4)進(jìn)行平衡后，取上述粗酶液上樣，用體積比為1:1的平衡緩沖液(PH為5. 4，濃度為20 mmol. L-1的醋酸緩沖液)和含有1 mol · L-1 NaCl的20 mmol · L-1醋酸緩沖液(pH 5. 4)，按線性梯度從0到100%進(jìn)行洗脫，分別收集洗脫峰，對(duì)各組分進(jìn)行活性檢測(cè)，如附圖1所示；
(4)采用kphacrylS-200HR凝膠過濾柱，上樣品前用20 mmol化―1的醋酸緩沖液(pH 5. 4)進(jìn)行平衡后，取離子交換層析得到的活性組分上樣，收集各組分；如附圖2所示；
(5)利用HPLC檢測(cè)分級(jí)收集產(chǎn)物純度，收集純度大于85%的組分，即為長梗木霉裂解酶；如附圖3所示；其中HPLC的流動(dòng)相配制為=NaCl 8 g，L-Arg-HCl 42 g,Na2HPO4. 12H20 8g ,H2O 1000ml ；色譜柱GF-450 (agilent 9.4 X 250mm, 6 μ m)；流速1. 5 ml/min ；柱溫 25 0C ；檢測(cè)波長:280nm ；
(6)對(duì)長梗木霉裂解酶進(jìn)行活性測(cè)試，觀察其去除真菌效果，具體可參見下表1。經(jīng)上述分離純化步驟后，長梗木霉的裂解酶菌體得率為70克菌體濕重/升發(fā)酵液，目標(biāo)酶效價(jià)18700單位/升。純度86. 2% ；其最適宜溫度和pH值如附圖4和5所示。隨機(jī)選擇上述實(shí)施例1-3中制備獲得的長梗木霉裂解酶，對(duì)其進(jìn)行抗菌試驗(yàn)，如下表1所示，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，采用本發(fā)明方法制備獲得的長梗木霉裂解酶具有較強(qiáng)的抗真菌作用，可以作為抗真菌藥物進(jìn)行開發(fā)和利用。
權(quán)利要求
1.一種用于治療真菌性疾病的長梗木霉裂解酶的制備方法，其特征是含以下步驟 配制長梗木霉的發(fā)酵培養(yǎng)基，在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入長梗木霉菌種，調(diào)節(jié)溫度為25-30°C，PH 值為6. 0-7. 5，溶氧為40-55%，進(jìn)行發(fā)酵3-6天，得長梗木霉的發(fā)酵液；將所得的長梗木霉發(fā)酵液進(jìn)行分離純化，獲得長梗木霉的裂解酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于治療真菌性疾病的長梗木霉裂解酶的制備方法，其特征是所述的發(fā)酵培養(yǎng)基含以下重量百分含量的組分蔗糠3-8%、鼓皮1.0-5.5%、硫酸銨 1.5-4%、磷酸二氫鉀0.5-2%、硫酸鎂0.5-2. 5%、瓊脂1. 0-3. 0%、微量元素0. 05-0. 5%、其余為去離子水。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于治療真菌性疾病的長梗木霉裂解酶的制備方法，其特征是長梗木霉的接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基總體積的5-20%，長梗木霉菌種的菌濃度為15-25%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于治療真菌性疾病的長梗木霉裂解酶的制備方法，其特征是長梗木霉發(fā)酵液的分離純化包括以下具體步驟(1)將長梗木霉發(fā)酵液離心除去懸浮菌體，采用超濾膜進(jìn)行過濾，收集粗酶液；(2)調(diào)節(jié)粗酶液溫度為-6-10°C，加入冰乙醇，混勻，靜置后，離心得沉淀物，在沉淀物中加入醋酸緩沖液溶解得到濃縮粗酶液；(3)將濃縮粗酶液采用SartobindQ離子交換膜上樣，并用平衡緩沖液和含有NaCl 的醋酸緩沖液按線性梯度從0到100%進(jìn)行洗脫，分別收集洗脫峰，對(duì)各洗脫液進(jìn)行活性檢測(cè)；(4)將各洗脫液采用kphacrylS-200HR凝膠過濾柱上樣，用含有NaCl的醋酸緩沖液洗脫，收集各組分，采用HPLC檢測(cè)各收集組分的純度，收集純度高于85%的組分，即獲得長梗木霉裂解酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于治療真菌性疾病的長梗木霉裂解酶的制備方法，其特征是步驟(1)中離心時(shí)的溫度為0°c，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為3000 r/min ；超濾膜為中空纖維超濾膜，其截留分子量為lOOOODa。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于治療真菌性疾病的長梗木霉裂解酶的制備方法，其特征是步驟O)中冰乙醇的加入量為粗酶液總體積的3-3.5倍，靜置時(shí)的溫度為4 士 1°C，醋酸緩沖液的PH為5. 4，濃度為20 mmol. L \其加入量為粗酶液總體積的2-2. 5倍。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于治療真菌性疾病的長梗木霉裂解酶的制備方法，其特征是步驟(3)中Sartobind Q離子交換膜上樣前用醋酸緩沖液進(jìn)行平衡，平衡時(shí)采用的醋酸緩沖液的PH為5. 4，濃度為20 mmol. L 1 ；洗脫時(shí)的平衡緩沖液為醋酸緩沖液，其 PH為5. 8，濃度為20 mmol L 1 ；洗脫時(shí)的含有NaCl的醋酸緩沖液中NaCl的濃度為1 mol L S醋酸緩沖液的pH為5. 4，濃度為20 mmol. L \平衡緩沖液和含有NaCl的醋酸緩沖液的體積比為1:1。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于治療真菌性疾病的長梗木霉裂解酶的制備方法，其特征是步驟(4)S-200HR凝膠過濾柱上樣用醋酸緩沖液進(jìn)行平衡，平衡時(shí)采用的醋酸緩沖液的PH為5. 4，濃度為20 mmol. L 1 ；洗脫時(shí)的含有NaCl的醋酸緩沖液中NaCl 的濃度為lmol L \醋酸緩沖液的pH為5. 4，濃度為20 mmol. L ^
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于治療真菌性疾病的長梗木霉裂解酶的制備方法，含以下步驟配制長梗木酶的發(fā)酵培養(yǎng)基，在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入長梗木霉菌種，調(diào)節(jié)溫度為25-30℃，pH值為6.0-7.5，溶氧為40%-55%，進(jìn)行發(fā)酵3-6天，得長梗木霉的發(fā)酵液；將所得的長梗木霉發(fā)酵液進(jìn)行分離純化，獲得長梗木霉的裂解酶。該方法獲得的目標(biāo)酶的菌體得率高、目標(biāo)酶表達(dá)量高，純度和酶活高；并且本發(fā)明方法發(fā)酵時(shí)間短、發(fā)酵成本低、分離工藝精密；并且采用本發(fā)明方法獲得的長梗木霉裂解酶具有較強(qiáng)的抗真菌作用，可以作為抗真菌藥物進(jìn)行開發(fā)和利用。
文檔編號(hào)C12R1/885GK102229921SQ201110155298
公開日2011年11月2日 申請(qǐng)日期2011年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月10日
發(fā)明者安鴻, 尹海濱 申請(qǐng)人:廣州明新醫(yī)藥科技有限公司