專利名稱：Sam1基因在增強植物抗高鹽耐受中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程領域，具體地，涉及一種擬南芥基因SAMl的應用，尤其涉及 SAMl在植物抗高鹽脅迫中的應用，同時還涉及SAMl基因在培育抗高鹽脅迫轉(zhuǎn)基因植物品種方面的應用。
背景技術：
植物在生長發(fā)育過程中要受到許多外界環(huán)境條件和內(nèi)部生理狀況的影響，包括許多脅迫條件如高鹽等。高鹽脅迫是我國農(nóng)作物生產(chǎn)面臨的重大問題之一。高鹽脅迫在細胞以及個體水平上擾亂了水電勢平衡以及離子分布，導致細胞內(nèi)的分子受損，從而導致植物生長停滯以至于死亡。鹽脅迫所導致的農(nóng)作物產(chǎn)量的降低成為制約我國農(nóng)業(yè)發(fā)展的一個重要因素。乙烯是一個關鍵的脅迫信號分子，許多逆境生態(tài)，包括洪水，干旱，高溫或低溫，金屬和鹽等非生物逆境及病蟲害侵染等，都能誘發(fā)乙烯的大量增加，脅迫一旦解除，隨即恢復正常水平，因此乙烯常被稱為脅迫激素。植物體在脅迫條件下自身能通過相應特定基因的表達來適應這種脅迫條件。并且植物激素如乙烯等參與了這些基因的表達調(diào)控。同樣植物激素乙烯處理亦可誘導以上基因表達，從而促進植物對環(huán)境的適應。幾乎所有的植物組織都能產(chǎn)生乙烯，但大多數(shù)情況下濃度都很低。Yang和 Hoffman通過一系列精巧的實驗闡明了乙烯的合成途徑。乙烯衍生自甲硫氨酸，它的產(chǎn)生過程分為以下幾個步驟(1)甲硫氨酸在S-腺苷甲硫氨酸合成酶(Mdometsynthetase， SAMS)催化下變成S-腺苷甲硫氨酸(SAM)。SAM是植物體內(nèi)主要的甲基供體，用做許多生化合成途徑的底物，例如乙烯合成途徑和精胺/亞精胺合成途徑等。0)SAM在ACC合酶(ACC synthase, ACS)白勺/[崔化下產(chǎn)生M基環(huán)丙(1-aminocyclopropane-l-carboxylic acid, ACC)和5’ -甲硫腺苷(MTA)。ACC合酶是整個乙烯合成途徑中的關鍵酶和限速酶。ACC用于產(chǎn)生乙烯；MTA則通過甲硫氨酸循環(huán)變回甲硫氨酸。(3)ACC在ACC氧化酶(ACC oxidase, AC0)催化下產(chǎn)生乙烯。早在上世紀80年代，就有研究發(fā)現(xiàn)外源施加IOmM ACC (1-Aminocyclopropane-l-Carboxylic Acid，乙烯合成前體)能夠減輕IOOmM NaCl對萵苣種子萌發(fā)的抑制作用。我們研究發(fā)現(xiàn)乙烯生物合成的一個上游基因S-ADENOSYLMETHIONINE SYNTHETASE-1 (SAM1, AT1G02500)在增強植物對高鹽的耐受性中具有重要作用。通過農(nóng)桿菌介導的方法構建的誘導性過表達SAMl的轉(zhuǎn)基因植物(SAMlOE)對高鹽脅迫具有很強的耐受性。與野生型相比， 表現(xiàn)為在高鹽OOOmM NaCl)培養(yǎng)基上具有高的萌發(fā)率(約25% )與存活率(約80% )。 另外，誘導性過表達SAMl不影響植物的正常生長發(fā)育。此項研究進一步闡述了乙烯在增強植物抗鹽脅迫中的重要作用以及通過轉(zhuǎn)基因增強乙烯的合成從而培育新的作物品種提供了新思路。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種擬南芥(Arabidopsis thaliana)基因SAMl在增強植物對高鹽耐受性方面的應用，以拓寬基因SAMl的應用范圍。本發(fā)明的目的還在于提供一種擬南芥基因SAMl在培育抗高鹽脅迫轉(zhuǎn)基因植物方面的應用。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案采用了一種誘導性超表達擬南芥基因SAMl 在植物抗高鹽脅迫方面的應用。所述的基因為SAM1，其核苷酸序列如kq ID No:l。在GenBank中的編號為 AT1G02500，⑶S的長度為1 182bp。把SAMl的全長⑶S克隆到一個誘導性植物表達載體上， 獲得了轉(zhuǎn)基因植物。并且分析了轉(zhuǎn)基因植物對高鹽脅迫的耐受性，實驗表明，過表達SAMl 的植株大大增強了對高鹽脅迫的耐受性。與野生型相比，表現(xiàn)為在高鹽OOOmM NaCl)培養(yǎng)基上具有高的萌發(fā)率(約25%)與存活率(約80%)。另外，誘導性過表達SAMl不影響植物的正常生長發(fā)育。SAMl功能的分析為獲得高鹽耐受性的植物新品種提供了理論和方法的 ■石出。本發(fā)明過表達SAMl基因能夠增強植物對高鹽脅迫的耐受性，因此能夠作為外源基因參與培育具有高鹽脅迫耐受性的轉(zhuǎn)基因植物，具有潛在的應用價值，適于推廣應用。本發(fā)明為通過基因工程手段增強作物對高鹽脅迫的抗性以及培育抗鹽性提高的植物品種提供了新的思路。


圖1為PER8載體圖譜。該載體融合了一個誘導性啟動子，外源施加β-雌激素 (β-estradiol)可以誘導基因表達。具有多個限制性酶切位點XhoI、AscI、ApaI、PacI和 Spel。在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中具有壯觀霉素抗性，而在植物中具有潮霉素抗性。圖2為挑選的陽性克隆經(jīng)測序鑒定的結果(部分序列)，與SAMl的⑶S—致。圖3為Col-O野生型以及SAMl轉(zhuǎn)基因植物不同的植株(#4、#9和#10)分別在添加β-雌激素以及添加/不添加200mM NaCl的培養(yǎng)基上培養(yǎng)4天的結果。轉(zhuǎn)基因植株大大提高了對高鹽脅迫的耐受性，表現(xiàn)為轉(zhuǎn)基因植株仍為綠色。圖4為Col-O野生型以及SAMl轉(zhuǎn)基因植物不同的植株(#4、#9和#10)分別在添加β -雌激素以及添加/不添加200mM NaCl的培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天、6天及7天后的存活率。 過表達SAMl顯著提高了植物在高鹽脅迫情況下的存活率。圖5為Col-O野生型以及SAMl轉(zhuǎn)基因植物不同的植株(#1、#4、#6、#9和#10)分
別在添加β-雌激素以及200mM NaCl的培養(yǎng)基上培養(yǎng)10天后的萌發(fā)率。過表達SAMl顯著提高了植物在高鹽脅迫情況下的萌發(fā)率。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。以下實施例中使用的各種突變體均購自ABRC，各種藥品試劑，如無特殊說明均購自Sigma公司。實施例1構建誘導性過表達SAMl的克隆以野生型擬南芥Col-O的cDNA為模板，通過RT-PCR的方法擴增得到SAMl的 CDS。弓丨物為正向弓丨物 F :5，-eg CTCGAGATGGAGACTTTTCTATTCAC-3', R :5，-gc GGGCCCTTAAGCTTGAGGTTTGTCCC-3',下劃線分別為XhoI和ApaI限制性內(nèi)切酶位點，eg和gc 為保護堿基。PCR引物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定大小，然后膠回收。把回收產(chǎn)物和pRE8載體 (圖1)分別用》ιοΙ和ApaI雙酶切，然后經(jīng)膠回收。用T4連接酶在16°C連接過夜，連接產(chǎn)物經(jīng)70°C 15分鐘滅活后通過熱激的方法轉(zhuǎn)到大腸桿菌，在壯觀霉素的LB培養(yǎng)基上篩選陽性克隆，并經(jīng)過測序鑒定(圖2)。實施例2過表達SAMl增強了植物對高鹽的耐受性構建β-雌激素誘導表達SAMl的克隆，轉(zhuǎn)化到野生型擬南芥Col-O中。將轉(zhuǎn)基因純合體種子播種在MS培養(yǎng)基上，放置在人工培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)(溫度為22°C，濕度為60%，16 小時光照/8小時黑暗的長日照)，在光(用白熾燈作為光源進行光照，連續(xù)作用光強度為 200 μ mol .Hi-2S-1)下生長5天后轉(zhuǎn)移幼苗到添加了 β -雌激素(10 μ Μ)的MS培養(yǎng)基以及 β -雌激素(10 μ Μ)和200mM NaCl的MS培養(yǎng)基上，光下培養(yǎng)5天后觀察表型，并在第5、6、 7天統(tǒng)計存活率。在添加β -雌激素誘導但培養(yǎng)在MS培養(yǎng)基上的植株生長狀態(tài)良好；而培養(yǎng)在添加了 β -雌激素并且含有200mM NaCl培養(yǎng)基上的植株，與野生型Col-O相比，誘導 SAMl基因表達的植物存活率高(圖4)并大部分為綠色(圖3)。以上結果說明過表達SAMl 可以增強植株對高鹽的耐受性。 構建轉(zhuǎn)基因植物pER8 SAMl的方法為1.PCR擴增目標片段SAMl基因編碼區(qū)，通過核酸內(nèi)切酶酶切目標片段和質(zhì)粒 pER8(Jianru Zuo 等，An estrogen receptor-based transactivator XVE mediates highly inducible gene expression in transgenic plants, The Plant Journal,2000, 由中國科學院遺傳所左建儒實驗室惠贈)產(chǎn)生黏性末端，將片段和質(zhì)粒用連接酶連接，通過測序鑒定得到質(zhì)粒PER8 SAMl。2.取2 μ 1質(zhì)粒加入100 μ 1農(nóng)桿菌C58中，2200V電擊后迅速加入500-800 μ 1 LB 培養(yǎng)基，280C 220rpm培養(yǎng)1. 5h,均勻涂在40 μ g/ml壯觀霉素LB培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng) 1-2 天；3.接種單個菌落于5ml LB培養(yǎng)基(利福平50 μ g/ml+壯觀霉素40 μ g/ml ；也可以只加轉(zhuǎn)基因抗性)，220rpm培養(yǎng)過夜；4.以1 100擴大培養(yǎng)于400mL(根據(jù)植物數(shù)量調(diào)整)含適當抗生素的LB中，繼續(xù)搖培5- 左右至生長密度為OD6tltl值1. 0-1. 2 ；5.室溫，4000g，離心lOmin，收集菌體；6.用轉(zhuǎn)化介質(zhì)(5%蔗糖，2. 033g/L MgCl2)懸浮菌體；Silwet L-77 (200 μ L/L)對菌液有傷害，應在轉(zhuǎn)化植物前加入；7.將含有農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化介質(zhì)倒入燒杯中，將剛剛開花的擬南芥倒置其上，使得整個花序都浸入轉(zhuǎn)化介質(zhì)中(蓮座基部的花序可用槍澆淋)，30s 120s ；8.取出擬南芥，將其側(cè)臥放在干凈的塑料托盤上，并用薄膜覆蓋避光保濕Mh ；9.將擬南芥扶起，光下培養(yǎng)，約3-4周后長角果完全枯黃、欲開裂時，即可收獲種子；10.用50 μ g/ml潮霉素的MS培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)基因植物。實施例3過表達SAMl提高了植株在高鹽培養(yǎng)基上的萌發(fā)率
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把pER8-SAMl轉(zhuǎn)基因植株(#1、#4、#6、#9和#10)播種在含有10 μ M β -雌激素和200mM NaCl的MS培養(yǎng)基上，在4°C暗處放置4天，讓所有的種子充分吸漲以便萌發(fā)一致。 然后在22°C光下培養(yǎng)5天，觀察萌發(fā)率。結果如圖5所示，野生型對照Col-O幾乎都沒有萌發(fā)，而轉(zhuǎn)基因植株的不同植株#1、#4、#6、#9、#10萌發(fā)率都在25%以上。表明過表達SAMl 大大增強了植株在高鹽培養(yǎng)基上的萌發(fā)率。綜上所述，在模式植物擬南芥中的研究表明，過表達基因SAMl能增強植物對高鹽脅迫的耐受性，這為通過基因工程手段增強作物對高鹽脅迫的抗性提供了新的思路。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
權利要求
1.基因SAMl在增強植物對高鹽耐受中的應用。
2.如權利要求1所述的應用，其特征在于，基因SAMl序列如SEQID NO=I所示。
3.如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述植物為擬南芥。
4.如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的高鹽耐受是植物生長發(fā)育過程的對外界條件鹽度在200mM NaCl耐受。
5.一種培育耐鹽性轉(zhuǎn)基因植物品種的方法，其特征在于，將SAMl基因插入真核細胞表達載體，得到重組表達載體，將該重組表達載體轉(zhuǎn)化到目的植物的細胞中，外源誘導劑誘導基因表達，篩選得到對高鹽耐受增強的植株。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述的真核表達載體為pER8。
7.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述的轉(zhuǎn)化方法為農(nóng)桿菌介導法。
8.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述的外源誘導劑為β-雌激素。
9.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述目的植物為擬南芥。
全文摘要
本發(fā)明提供了擬南芥基因SAM1在增強植物對高鹽耐受中的應用，其是通過基因工程的方法在植物中過表達基因SAM1。通過對基因SAM1在模式植物擬南芥中分子生物學機理的研究，發(fā)現(xiàn)過表達基因SAM1的植株對高鹽具有強的耐受性，在高鹽培養(yǎng)基具有高的萌發(fā)率以及存活率。通過轉(zhuǎn)基因的手段把該基因?qū)朕r(nóng)作物勢必會增強其在逆境中的抗性，進而提高作物產(chǎn)量及品質(zhì)。
文檔編號C12N15/82GK102250927SQ20111015881
公開日2011年11月23日 申請日期2011年6月14日 優(yōu)先權日2011年6月14日
發(fā)明者彭金英, 李中海, 郭紅衛(wèi) 申請人:北京大學