專利名稱：臨床及實驗用無異種蛋白干細胞培養(yǎng)基添加物及用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種臨床及實驗用高效無異種蛋白干細胞培養(yǎng)基添加物及其用途，具體來說，本發(fā)明公開一種可用于體外擴增培養(yǎng)人臍帶或骨髓造血干/祖細胞的培養(yǎng)基添加物，培養(yǎng)基添加物由人臍帶或胎盤提取液和體積百分比為10%的人臍帶血漿組成，所述人臍帶或胎盤提取液的終濃度為0. 10-0. 45mg/ml。該培養(yǎng)基添加物還能用于體外擴增人臍帶或骨髓間充質干細胞。
背景技術：
干細胞是生物體內(nèi)存在的一種具有自我更新能力和多系分化潛能的原始細胞群體，人體所有的組織器官細胞均由干細胞分化而來。隨著對干細胞研究的不斷深入，其臨床應用價值也越來越受到重視。因其具有組織修復，細胞再生，免疫調節(jié)和免疫重建等功能， 使其廣泛應用于神經(jīng)、骨關節(jié)、腎病、糖尿病、移植及腫瘤治療等各個領域。但干細胞不論源于自體還是異體，數(shù)量很少，不能滿足臨床應用要求，多需要從體外培養(yǎng)擴增。因此培養(yǎng)基必須滿足干細胞對營養(yǎng)成分、促生長因子、激素、滲透壓、PH等諸多方面的要求。因此，干細胞培養(yǎng)要求較高，其中，臍帶血干細胞的培養(yǎng)條件更為苛刻，也更難控制，易凋亡、分化。目前市面上昂貴的工業(yè)化生產(chǎn)的無血清培養(yǎng)基也無法為臍帶血干細胞生長提供必需的營養(yǎng)物質和最佳的細胞因子比例，干細胞擴增受限且易于凋亡。臍帶造血干細胞具有多能分化特性，臨床應用潛力極大，特別是白血病等癌癥放化療后的造血干細胞移植，但因其造血干/祖細胞數(shù)量少，無法滿足臨床應用。長期以來各國學者竭力研究其培養(yǎng)條件以利大量擴增供臨床應用(Piacibello W，Sanavio F， Garetto L. et al. Extensive amplification and self renewal of human primitive hematopoietic stem cells from cord blood. Blood，89 :2644-2653)。美國已有以臍帶血清作為培養(yǎng)基添加劑的專利(US7060494)，但它仍需加入多種昂貴的細胞因子，而且擴增所需時間長，且易分化。我們做了大量的實驗進行比較，它比現(xiàn)有的無血清和常規(guī)的含有胎牛血清(FBQ培養(yǎng)基都好。但它們的共同問題仍是細胞分化和部分造血祖細胞喪失，超過 3周后，培養(yǎng)的臍帶血有核細胞同樣發(fā)生分化或凋亡，同時紅系集落形成在10天后完全消失，所以仍然無法滿足臍帶造血干細胞移植所需的細胞量。我們也測試了 ^vitrogen公司新近開發(fā)的基質干細胞無血清培養(yǎng)基，主要用于臍帶間充質干細胞(MSC)或來源于成人骨髓間充質(MSC)干細胞的培養(yǎng)。它也可以擴增臍帶血有核細胞9倍左右，但沒有臨床應用價值，因為培養(yǎng)10天后就喪失了紅系集落形成能力。迄今為止，雖然大多數(shù)培養(yǎng)基都可以擴增臍帶血有核細胞，但都無法在短時間內(nèi)有效地擴增臍帶造血干/祖細胞，特別是紅系造血干細胞/前體細胞，所以臨床臍帶血移植治療成人白血病和其他惡性腫瘤結果不十分滿意。

發(fā)明內(nèi)容
基于目前干細胞培養(yǎng)基的缺陷及臨床應用和基礎研究的需求，我們利用廢棄的人類臍帶、胎盤以及臍帶血漿做干細胞培養(yǎng)基添加劑，發(fā)明了這種高效、無異種蛋白培養(yǎng)基， 適用于各種干細胞培養(yǎng)，也可直接用于臨床；而且取材方便，價格低廉，對于干細胞培養(yǎng)和臨床應用有著深遠的意義。本發(fā)明用臍帶血漿和臍帶及胎盤提取液做干細胞培養(yǎng)基添加物，并非單純血清，所以保存了所有的干細胞生長所需的營養(yǎng)成分和細胞因子，另外各種物質的比例處于完全自然的干細胞生長狀態(tài)，在國內(nèi)、外尚未報道。本發(fā)明的一個目的在于提供臨床及實驗用無異種蛋白干細胞培養(yǎng)基添加物，包括人臍帶或胎盤提取液和體積百分比為10%的人臍帶血漿，所述人臍帶或胎盤提取液的終濃度為0. 10-0. 45mg/ml。作為更為優(yōu)選的實施方案，臍帶或胎盤提取液的終濃度為0. 25,0. 3 或 0. 45mg/mL·本發(fā)明具體提供一種臍帶或胎盤提取物的制備方法，其具體步驟為用生理鹽水、 抗生素、生理鹽水依次清洗胎盤和臍帶，在冰槽內(nèi)將其切成l-2cm大小的組織塊，在冰凍狀態(tài)將組織粉碎，按anl/g的比例加入RPMI 1640，4°C離心，保存上清液，速凍沉淀部分，重復粉碎、離心步驟，混合上清液。進一步，本發(fā)明提供的干細胞培養(yǎng)基添加物可應用于制備人臍帶造血干/祖細胞的體外培養(yǎng)基。采用本發(fā)明的干細胞培養(yǎng)基添加物，可短時間擴增無分化臍帶造血干細胞，本發(fā)明可以大量地擴增臍帶造血干細胞，2周即可擴增16. 18至52倍；每份臍帶血如果能分離出4. OX IO8至5X IO8有核細胞，2周時間內(nèi)至少可以獲得4. OX IO8X 16. 18 = 6. 47X IO9個有核細胞。而國際骨髓移植公認的標準是，骨髓移植臍帶血有核細胞數(shù)量為 4. 4X IO7Ag0因此，兩周體外擴增的臍帶血已足夠體重為70kg的兩個成人骨髓移植使用。另一方面，本發(fā)明提供的干細胞培養(yǎng)基添加物還可應用于制備人骨髓干/祖細胞、臍帶間充質干細胞的體外培養(yǎng)基。本發(fā)明的干細胞培養(yǎng)基添加物可以在2周的時間內(nèi)擴增大量的造血干/祖細胞，其結果與臍帶造血干/祖細胞擴增相似；本發(fā)明可以大量地擴增成人無分化骨髓間充質干細胞，擴增量可達109_1(1倍；本發(fā)明可以大量地擴增無分化臍帶間充質干細胞，擴增量可達IO9,倍。以上概括的描述了本發(fā)明，可通過參照本文提供的某些具體實施例進一步理解本發(fā)明，這些實施例僅是為了說明而不是限制本發(fā)明。


圖1 不同組成的培養(yǎng)基添加劑對臍帶血有核細胞擴增倍數(shù)的影響情況對比G 周培養(yǎng))?？v軸數(shù)字X10代表有核細胞的擴增倍數(shù)；橫軸各字母分別代表不同的培養(yǎng)基，a :10%臍帶血漿；b 臍帶血漿+0. 15mg/ml臍帶或胎盤提取液；c 臍帶血漿+0. 30mg/ml臍帶或胎盤提取液；d :0. 30mg/ml臍帶或胎盤提取液；e 10 %自體血清 +0. 30mg/ml臍帶胎盤提取液；f 常規(guī)10%胎牛血清；g =Invitrogen無血清培養(yǎng)基；圖2 不同組成的培養(yǎng)基添加劑對臍帶血有核細胞擴增倍數(shù)的影響情況對比O 周培養(yǎng))?？v軸數(shù)字X10代表有核細胞的擴增倍數(shù)；橫軸各字母分別代表不同的培養(yǎng)基，a :10%臍帶血漿；b 臍帶血漿+0. 15mg/ml臍帶或胎盤提取液；c 臍帶血漿+0. 30mg/ml臍帶或胎盤提取液；d :0. 30mg/ml臍帶或胎盤提取液；e 10 %自體血清 +0. 30mg/ml臍帶胎盤提取液；f 常規(guī)10%胎牛血清；g =Invitrogen無血清培養(yǎng)基。
具體實施例方式實施例1.材料準備及干細胞培養(yǎng)基添加劑的制備過程收集小于妊娠9個月分娩的臍帶、胎盤(不可使用過期妊娠胎盤)，_80°C保存。保留臍帶血，同時分離臍帶血有核細胞、血漿；在分裝血漿前，離心去除血小板，分裝，-80°保存。臍帶血有核細胞按常規(guī)細胞分離、凍存方法進行保存。實驗中所需要使用的材料1.培養(yǎng)液等抗生素(青霉素、鏈霉素、紅霉素、慶大霉素)，01^1，1^1，1 ^1-1640， 生理鹽水，PBS,臨床級別DMS0，臨床級別胰酶-EDTA。2.培養(yǎng)干細胞消耗品人血白蛋白(臨床應用品，用于細胞凍存)；SCF IOyg/ ml, G-CSFlOy g/ml, TPO 10yg/ml。3.流式細胞儀檢測所需的針對如下抗原的抗體⑶13、⑶29、⑶59 ；⑶11、⑶14、 CD31、CD34、CD38、CD45、CD80、CD86、CDl 17。干細胞培養(yǎng)基添加劑中的人臍帶血漿和人臍帶或胎盤提取液的具體制備流程如下1)從臍帶靜脈取臍帶血，20_25U/ml肝素抗凝(助產(chǎn)士在產(chǎn)房內(nèi)無菌取)；2)離心，分離血漿和細胞；3)離心去除血小板，560C，30分鐘滅活補體，分裝于凍存管，_80°C保存；4)常規(guī)分離有核細胞，凍存于RPMI-1640培養(yǎng)液，7% DMS0，20%人類白蛋白；5)用生理鹽水反復清洗胎盤和臍帶，去除所有血污，雜質，必須在冰槽內(nèi)進行，至少5次；6)慶大霉素、紅霉素生理鹽水洗兩次(慶大霉素32萬單位/升，紅霉素0. 25g/ 升)；7)再用生理鹽水反復清洗兩次去除抗菌素；8)用機器將其切成l-2cm大小的組織塊(必須在冰槽內(nèi)進行)；9)組織粉碎機將冰凍狀態(tài)組織粉碎，按aiil/g的比例加入RPMI 1640 (0°C )，再加工直至無可見的組織塊或成糊狀；10)按每克組織加2_3ml培養(yǎng)液再加入RPMI 1640培養(yǎng)液；11)超聲進一步粉碎1-aiiin (必須在冰水中進行)；12) 4°C離心，保存上清液于-80°C ；凍存沉淀部分；13)速凍沉淀部分，再用粉碎機粉碎，然后重復11-13步驟；14)離心，保留上清液并與第13步獲得的上清液混合。測蛋白含量，調節(jié)到15mg/ ml ο實施例2.人骨髓間充質、臍帶間充質干細胞的體外培養(yǎng)擴增實驗中所需要使用的材料DMEM (臨床應用級別)；胰蛋白酶-EDTA消化液 0. 125%胰蛋白酶-0.01% EDTA(臨床級另Ij )；3. 1制備擴增骨髓、臍帶間充質干細胞培養(yǎng)基添加劑(共7管，以測試何種組合最佳)a) 10%臍帶血漿；b) 10%臍帶血漿+0. 15mg/ml臍帶或胎盤提取液；
c) 10%臍帶血漿+0. 30mg/ml臍帶或胎盤提取液；d) 0. 30mg/ml臍帶或胎盤提取液； e) 10 %自體血清+0. 30mg/ml臍帶或胎盤提取液；f)對照1 常規(guī)10%胎牛血清；g)對照2 =Invitrogen無血清培養(yǎng)基；3. 2骨髓間充質干細胞(BMSC)的分離和培養(yǎng)1)人骨髓的抽取所用器械預先用肝素潤濕，IOml注射器吸入Iml肝素化 PBS(200U/ml)；2)骨髓間充質干細胞(BMSC)分離采用密度梯度離心法；3)骨髓間充質干細胞(BMSC)原代培養(yǎng)原代細胞接種后2 5天換液，原代細胞一般于7 9天達到80%融合，傳代培養(yǎng)；4)骨髓間充質干細胞(BMSC)消化傳代加入0. 25%胰蛋白酶-EDTA消化、計數(shù)， 以5 XioVml繼續(xù)培養(yǎng)。骨髓間充質干細胞在上述培養(yǎng)基中生長情況骨髓間充質干細胞在上述各種培養(yǎng)條件下，增殖狀態(tài)相似，細胞均勻一致，而且增殖快，倍增時間約30小時，維持時間最長，可以傳20代左右，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的細胞形態(tài)改變和分化跡象。流式細胞儀檢測細胞的表面標記仍然是均一的間充質干細胞，取10代和20代的培養(yǎng)細胞，流式細胞儀檢測示，細胞表達 CD73、CD90、CD105、CD13、CD29、CD59,而不表達 CD11、CD14、CD31、CD34、CD38、CD45、CD80、 ⑶86、⑶117，表明它是間充質干細胞而不是造血干細胞。細胞的表面標記顯示擴增的是骨髓間充質干細胞且純度應為95%以上，成活率98%以上，可視為克隆來源的骨髓間充質干細胞。培養(yǎng)的細胞20代以前生長良好，擴增達IO9倍，22代以后細胞生長明顯變慢，光鏡下形態(tài)變大、形狀變?yōu)椴灰?guī)則，胞漿內(nèi)及培養(yǎng)液中可見較多顆粒，折光性差。3. 3人類臍帶間充質干細胞的體外培養(yǎng)擴增臍帶間充質干細胞(MSC)的分離采用本領域常用膠原酶IV消化法進行分離，臍帶間充質干細胞與骨髓間充質干細胞相似，使用上述各種培養(yǎng)基，體外培養(yǎng)可以達5個月，傳 20代以上，擴增101°倍，細胞形態(tài)沒有明顯改變，流式細胞儀檢測也證實95%以上仍為間充質干細胞。免疫表型測定分別對第5、10、20代臍帶MSC進行流式細胞儀檢測，結果表明各代間免疫表型無明顯差異，均強表達⑶13、⑶四、⑶105、⑶44，弱表達⑶106，不表達⑶14、 CD34、CDlU CD31、CD45。第5、10、20代臍帶間充質干細胞(MSC)培養(yǎng)潛伏期12 24h，2d 后進入對數(shù)生長期，對數(shù)增殖期持續(xù)4 5d，7 8d后長滿瓶底，生長停止。第5、10、20代臍帶間充質干細胞(MSC)倍增時間分別為30. 1、31. l、32.2h。第5、10、20代臍帶間充質干細胞(MSC)克隆形成率分別為22. 5%,20. 18%、18. 17%。實施例3.臍帶血干細胞/祖細胞的體外培養(yǎng)擴增常規(guī)Percoll分離有核細胞，使用PRMI-1640培養(yǎng)基進行人臍帶血單個核細胞 (MNC)培養(yǎng)，分別加入實施例3中所述的7種組合的培養(yǎng)基，每種再加lOOng/ml TPO, IOOng/ ml CSF和lOOng/ml GM-CSF細胞因子，培養(yǎng)第1、2、3、4周分別進行單個核細胞計數(shù)和造血干細胞集落培養(yǎng)及計數(shù)。臍帶血干細胞/祖細胞在上述培養(yǎng)基中生長情況(1)臍帶血有核細胞擴增倍數(shù)在6孔板上加5X IO5/孔，培養(yǎng)4周，b、c組臍帶血有核細胞擴增倍數(shù)最高可達98. 7倍，細胞活力在95 %以上；培養(yǎng)基組a和e相似，有50. 5、 41. 7倍的擴增；d組也有22. 0倍的擴增；而常規(guī)FBS培養(yǎng)組僅增加了 3. 02倍，Invitrogen 無血清培養(yǎng)基組增加了 9. 1倍，參見圖1。用b和c組培養(yǎng)基，培養(yǎng)2周的臍帶血有核細胞擴增倍數(shù)約為16. 18倍，對照培養(yǎng)基f和g組的擴增倍數(shù)僅是1. 87和2. 91倍，參見圖2，表 1。表1.臍帶血有核細胞培養(yǎng)2周后⑶34+細胞擴增
培養(yǎng)前CD34%培養(yǎng)后CD34+%培養(yǎng)后CD34+擴增倍數(shù)Invitrogen無血.清培養(yǎng)基1.0 ±0.250.51 ±0.022.51 ±0.7910%臍帶血漿+0.3mg/ml 臍帶或胎盤提取液1.0 ±0.252.71 ±0.51106.08±20.29(2)培養(yǎng)臍帶血有核細胞1 X IO5,培養(yǎng)1，2，3，4周后，分別取1 X IO4有核細胞，在 0. 3%瓊脂，30% FBS，10% BSA，5X 10_5mOl/L巰基乙醇，DMEM培養(yǎng)基基礎上分別加入加入實施例3中所述的7種組合的培養(yǎng)基添加劑作為干細胞培養(yǎng)基。培養(yǎng)14天計數(shù)CFC (Colony Forming Cell), CFU-GM(colony forming unit granulocyte and macrophage), CFU-E (colony forming unit erythroid),CFU-MK (colony forming unit megakaryocyte) 和BFU-MK (burst forming unit megakaryocyte)。以c培養(yǎng)基為例，造血祖細胞集落計數(shù)顯示第3周達高峰，第4周逐漸下降，而且這些培養(yǎng)基組擴增集落形成細胞(CFC)的能力明顯高于無血清培養(yǎng)組。而紅系在培養(yǎng)2周后開始下降，參見表2-5。集落培養(yǎng)結果表明隨培養(yǎng)時間的延長，擴增細胞中所含造血祖細胞增殖分化能力呈下降趨勢，表現(xiàn)為所生成集落變小，這也反映了擴增細胞質量方面的變化。因此，在擴增技術時，應根據(jù)不同的應用目的，選擇相宜的擴增時間。有效擴增紅系細胞不宜超過2 周，有效擴增髓系和CD34+細胞最佳擴增時間為也為2-3周，需要造血干/祖細胞具有最強的增殖分化能力，則培養(yǎng)時間也在2周左右為宜，所以體外擴增的臍帶血干細胞用于移植， 培養(yǎng)擴增時間不宜超過2周。臍帶血漿和胎盤提取物可以有效促進臍帶血造血干細胞體外增殖，雖然臍帶有核細胞的培養(yǎng)擴增，在培養(yǎng)4周以后可以接近100倍，但在臨床應用中避免超過3周的體外培養(yǎng)擴增，以防止細胞發(fā)生分化和凋亡，影響擴增質量。如果從一份臍帶血中能夠得到4. OX IO8至5. OX IO8有核細胞，本發(fā)明可以在短短的2周時間內(nèi)至少可以獲得4. OX IO8 X 16. 18 = 6. 47 X IO9造血前體細胞(根據(jù)最低的紅系擴增倍數(shù)計算。按成人骨髓移植所需的造血前體細胞數(shù)4. 4X107/kg計算，70kg的成人骨髓移植需要3. 08父109個造血祖細胞。所以兩周的培養(yǎng)擴增一份臍帶血已足夠兩個成人骨髓移植使用。除此之外，我們還對骨髓造血干/祖細胞進行體外培養(yǎng)擴增，發(fā)現(xiàn)應用臍帶血漿臍帶或胎盤提取液擴增骨髓造血干/祖細胞的結果與上述臍帶造血干細胞擴增結果完全相似。
表2.臍帶血干/祖細胞體外擴增集落形成細胞的能力(Colony Forming Cell, CFC)XIO權利要求
1.一種臨床及實驗用無異種蛋白干細胞培養(yǎng)基添加物，包括人臍帶或胎盤提取液和體積百分比為10%的人臍帶血漿，所述人臍帶或胎盤提取液的終濃度為0. 10-0. 45mg/ml。
2.根據(jù)權利要求2的干細胞培養(yǎng)基添加物，所述臍帶或胎盤提取液的終濃度為0.3mg/ml ο
3.根據(jù)權利要求1-2中所述干細胞培養(yǎng)基添加物，所述臍帶或胎盤提取液的制備方法為用生理鹽水、抗生素、生理鹽水依次清洗胎盤和臍帶，在冰槽內(nèi)將其切成l-2cm大小的組織塊，在冰凍狀態(tài)將組織粉碎，按anl/g的比例加入RPMI 1640，4°C離心，保存上清液，速凍沉淀部分，重復粉碎、離心步驟，混合上清液。
4.權利要求1所述的干細胞培養(yǎng)基添加物在制備哺乳動物臍帶或骨髓造血干/祖細胞體外培養(yǎng)基的應用。
5.權利要求1所述的干細胞培養(yǎng)基添加物在哺乳動物臍帶或骨髓間充質干細胞體外培養(yǎng)的應用。
6.根據(jù)權利要求4-5的應用，所述哺乳動物是人。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種臨床及實驗用高效無異種蛋白干細胞培養(yǎng)基添加物及其用途，具體來說，本發(fā)明公開一種可用于體外擴增培養(yǎng)人臍帶或骨髓造血干/祖細胞的培養(yǎng)基添加物，培養(yǎng)基添加物由人臍帶或胎盤提取液和體積百分比為10％的人臍帶血漿組成，所述人臍帶或胎盤提取液的終濃度為0.10-0.45mg/ml。培養(yǎng)兩周，可以擴增達17倍左右。該培養(yǎng)基添加物還能用于體外擴增人臍帶或骨髓間充質干細胞。本發(fā)明利用廢棄的人類臍帶、胎盤以及臍帶血漿做干細胞培養(yǎng)基添加劑，能夠大量地擴增各種干細胞，包括臍帶、骨髓造血干細胞，而且可以確保擴增的干細胞無分化，此外培養(yǎng)液無異種蛋白，非常適合臨床應用。
文檔編號C12N5/0789GK102250838SQ20111015959
公開日2011年11月23日 申請日期2011年6月4日 優(yōu)先權日2011年6月4日
發(fā)明者云升, 邱英 申請人:內(nèi)蒙古醫(yī)學院