專利名稱：一種農(nóng)桿菌介導的縱切幼苗上胚軸頂端轉(zhuǎn)化大豆的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種農(nóng)桿菌介導的利用縱切幼苗上胚軸頂端轉(zhuǎn)化大豆的方法。
背景技術(shù)：
大豆是重要的的食用和油料作物。大豆含豐富的植物蛋白，營養(yǎng)價值極高。大豆油中不飽和脂肪酸和維生素E含量豐富，是世界上最重要的植物油。隨著世界人口的增長及人們生活水平的提高，人們對大豆的需求量越來越大。常規(guī)育種已不能滿足人們對大豆品種和品質(zhì)的要求。隨著現(xiàn)代分子生物學的發(fā)展和進步，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育大豆新品種已經(jīng)成為一種趨勢。將人工分離和修飾過的基因?qū)氲缴矬w基因組中，由于導入基因的表達，引起生物體的性狀的可遺傳的修飾，這一技術(shù)稱之為轉(zhuǎn)基因技術(shù)。目前用于大豆育種的轉(zhuǎn)基因技術(shù)主要包括兩大類，第一類是不需要經(jīng)過組織培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，目前研究比較多的是花粉管通道法；另一類是需要經(jīng)過組織培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，比較常用的有基因槍法和農(nóng)桿菌介導法。(一)花粉管通道法
花粉管通道法是在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在開花、受精過程中形成的花粉管通道，將外源DNA導入受精卵細胞，并進一步地被整合到受體細胞的基因組中，隨著受精卵的發(fā)育而成為攜帶轉(zhuǎn)基因的新個體?；ǚ酃芡ǖ婪ú恍枰M織培養(yǎng)和儀器轉(zhuǎn)化設(shè)備，簡便易行，但需要育種工作者摸索具體的外源DNA導入時間與方法。(二)基因槍法
基因槍法是將直徑很小的鎢粉或金粉粒子微粒浸泡在供體DNA中，使外源基因吸附在表面，然后用基因槍以很高的速度將金屬微粒射入受體植物細胞內(nèi)實施轉(zhuǎn)化。該方法的主要優(yōu)點是不受受體植物范圍的限制，其載體質(zhì)粒的構(gòu)建也相對簡單，因此也是目前轉(zhuǎn)基因研究中應(yīng)用較為廣泛的一種方法。但是基因槍法需要經(jīng)過組織培養(yǎng)階段，受到組織培養(yǎng)條件的限制，轉(zhuǎn)基因周期長，成本比較高。另一方面由于基因槍法的隨機性，外源基因進入宿主基因組的整合位點相對不固定，拷貝數(shù)往往較多，這樣轉(zhuǎn)基因后代容易出現(xiàn)突變、外源基因容易丟失，容易引起基因沉默等現(xiàn)象的發(fā)生，不利于外源基因在宿主植物的穩(wěn)定表達。 而且基因槍價格昂貴、運轉(zhuǎn)費用高。這些都限制了基因槍作為產(chǎn)業(yè)化轉(zhuǎn)基因技術(shù)的廣泛使用。(三)農(nóng)桿菌介導法
農(nóng)桿菌介導法是現(xiàn)代轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域廣泛使用的一種技術(shù)，其優(yōu)點是手段相對簡單，可靠性強，效率高。但在只有外植體能再生的雙子葉植物中才能采用。目前，農(nóng)桿菌介導法應(yīng)用于大豆轉(zhuǎn)化主要是以大豆的子葉、子葉節(jié)等為外植體，利用農(nóng)桿菌侵染，然后經(jīng)過組織培養(yǎng)再生器官，獲得轉(zhuǎn)基因苗。大豆轉(zhuǎn)化的效率受到農(nóng)桿菌菌株感染轉(zhuǎn)化能力、大豆基因型、 組織培養(yǎng)條件、T - DNA的轉(zhuǎn)移效率和轉(zhuǎn)化后的篩選模式的影響，很難大面積推廣。本發(fā)明提供了一種全新的、無需經(jīng)過組織培養(yǎng)階段的農(nóng)桿菌介導的大豆轉(zhuǎn)化方法，具有比較高的實際應(yīng)用價值和推廣前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種農(nóng)桿菌介導的縱切幼苗上胚軸頂端轉(zhuǎn)化大豆的轉(zhuǎn)基因方法，包括以下步驟
(a)、浸泡大豆，光照保濕條件下培養(yǎng)至下胚軸長2 3cm。(b)、將含有目的基因的農(nóng)桿菌用滲透培養(yǎng)基懸浮，所述滲透培養(yǎng)基含有細胞分裂素KT、植物生長素2，4-D、抗氧化劑DTT和L-Cysteine。(C)、在滲透培養(yǎng)基中，用薄刀刃在大豆的上胚軸頂端縱切，制造傷口。(d)、致傷處理后的大豆幼苗浸沒在滲透培養(yǎng)基中培養(yǎng)。(e)、農(nóng)桿菌侵染后的大豆幼苗在吸水紙上吸干水分，種入土中。使用縱切幼苗上胚軸頂端轉(zhuǎn)化大豆時，會導致大部分植株發(fā)生褐變腐爛死亡的現(xiàn)象，嚴重影響了植株生長及結(jié)實率與轉(zhuǎn)化率。這種外植體的褐化可能是植物對受傷和病原體侵害的一種防御反應(yīng)。我們在滲透培養(yǎng)基里添加了 DTT和L-Cysteine，這兩種抗氧化劑可以有效的減少外植體的褐化現(xiàn)象，提高農(nóng)桿菌的感染率。本發(fā)明還首次在滲透培養(yǎng)基里添加了生長素2，4-D和激動素(KT)，這兩種添加劑能夠顯著提高大豆的轉(zhuǎn)化效率。本發(fā)明中，上述滲透培養(yǎng)基中2，4-D的最佳濃度為0. 5_5mg/L、KT的最佳濃度為 0. l-4mg/L, DTT 的最佳濃度為 0. 5_5mM/L、L-Cysteine 的最佳濃度為 100 400mg/L。本發(fā)明中用薄刀刃在大豆的上胚軸頂端縱切，制造傷口，具體為順大豆兩子葉夾縫，劃傷上胚軸頂端外側(cè)，使夾縫向胚軸方向延長，優(yōu)選延長4 6mm。致傷后的大豆在滲透培養(yǎng)基中^°C、24hr黑暗、130 170rpm培養(yǎng)15 30min。本發(fā)明含有目的基因的農(nóng)桿菌的獲得，是將目的基因插入表達載體，再將該載體導入農(nóng)桿菌中。常用的表達載體包括但不限于=PBin系列載體、pBI系列在、Gateway系列載體、pCAMBIA系列載體；常用的農(nóng)桿菌菌株包括但不限于AGL0、AGLU GV3101、EHA105、 LBA4404 等。本發(fā)明的方法與其它大豆轉(zhuǎn)基因方法的顯著區(qū)別在于采用大豆上胚軸頂端作為農(nóng)桿菌介導的外植體，而不是胚性愈傷或懸浮細胞，避免了組織培養(yǎng)和植株再生的過程，克服了由于大豆基因型對轉(zhuǎn)化后植株再生的局限，同時極大簡化了大豆轉(zhuǎn)基因操作的流程， 具有比較高的實際應(yīng)用價值和推廣前景。下面結(jié)合具體實施例進一步闡述本發(fā)明，而不構(gòu)成對發(fā)明范圍的限制。


圖1為TO代轉(zhuǎn)基因大豆草胺磷涂抹實驗篩選結(jié)果示圖，其中A圖為野生型，B圖為轉(zhuǎn)基因陽性植株。紅色圓圈為草胺磷涂抹的葉片部位。圖2為Tl代轉(zhuǎn)基因大豆草胺磷噴灑實驗篩選結(jié)果示圖，其中A圖為野生型，B圖為轉(zhuǎn)基因陽性植株。圖3為Tl代轉(zhuǎn)基因大豆的PCR檢測結(jié)果，其中泳道M為marker，+是以質(zhì)粒為模板的正對照，-為野生型負對照，1 10為檢測的10個轉(zhuǎn)基因大豆。圖4為Tl代轉(zhuǎn)基因大豆的southern檢測結(jié)果，其中泳道1 5為轉(zhuǎn)基因大豆，+為質(zhì)粒的正對照。
具體實施例方式下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見 《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》 (Sambrook， J. ， Russell, David W.， Molecular Cloning: A Laboratory Manual，3rd edition,2001,NY,Cold Spring Harbor)。 所用引物及DNA序列均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。實施例一、縱切上胚軸頂端轉(zhuǎn)化大豆 1.實驗材料
質(zhì)粒含有bar基因，帶有潮霉素篩選標記基因的pCambial300-bar載體，具有抗草銨磷除草劑。PCR擴增bar基因連接到pcambial300 (購自hvitrogen公司)載體上得到 pcambial300-bar i^f 本。農(nóng)桿菌菌株AGL0。供轉(zhuǎn)化的大豆品種黑農(nóng)37號，華疆4號。2.農(nóng)桿菌的培養(yǎng)
挑取甘油凍存的含有目的基因的農(nóng)桿菌，于YEB平板上畫線，黑暗培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 天。挑取單菌落接種于40ml抗性YEB液體培養(yǎng)基中黑暗搖床200rpm搖過夜，至 OD600 1。吸取上述培養(yǎng)物250 300 μ 1涂布于平板直徑為15cm的YEB固體培養(yǎng)基上， 黑暗培養(yǎng)箱培養(yǎng)2天后，此備用的新鮮平板當天使用，約20°C室溫黑暗待用，不要繼續(xù)存留于黑暗培養(yǎng)箱或轉(zhuǎn)存于4°C冰箱。3.滲透培養(yǎng)基的制備
首先按照下述配方配制AA培養(yǎng)基。AA培養(yǎng)基配制(IL) MgSO40. 12209g KCl 2.95g NaH2PO4 · 2H20 0. 15g 肌醇 0. Ig 谷氨酸 0.876g 天門冬氨酸 0. 266g 精氨酸 0. 174g 酪蛋白水解物 0. 3g 蔗糖 20g
鐵鹽溶液5ml ① EDTA-2Na 7. 46g/L 調(diào) pH=8. 0
②再加4. 5ml/L 5M NaCl
③FeSO4 · 7H20 5. 56g/L
CaCl2 溶液 4. 5ml25.06g/L
VB1 溶液10mllg/L
VB6 溶液Imllg/L
煙酸溶液Iml0. lg/L4微量
MnSO4 · H9O
7. 58g/L 2. Og/L
ZnSO4 · 7H90
H3BO3 KI
3. Og/L
Na2MoO4 · 2H20 CuSO4 · 5H20 CoCl9 · 6H90
0. 75g/L 0. 25g/L 0.025g/L 0.025g/L
在IL AA培養(yǎng)基中添加下列成分
As (100 200 μ M )； KT (0. 2mg)； 2，4_D (Img)5DTT (ImM )； L-Cysteine (200 400mg) ；silwet-L77 (100 400 μ 1)。
將培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌用上述滲透培養(yǎng)基懸浮，使懸浮菌液的0D_值為0. 4 0. 7，pH至 5. 0 5. 5，轉(zhuǎn)化滲透培養(yǎng)液制備完畢。4.大豆種子培養(yǎng)
浸泡大豆種子使之吸水飽和，在25 °C光照保濕條件下萌發(fā)3 4天，至胚軸長2 3cm。大豆種子每天早晚各清洗一次。5.農(nóng)桿菌菌液浸染大豆下胚軸頂端
1)將薄刀刃浸泡在上述制備好的轉(zhuǎn)化滲透培養(yǎng)基中，順大豆兩子葉夾縫，劃傷上胚軸頂端外側(cè)，注意不要劃透胚軸，使夾縫向胚軸方向延長4 6mm ；
2)將處理好的大豆幼苗浸沒在轉(zhuǎn)化滲透培養(yǎng)液中黑暗130 170rpm培養(yǎng) 15 30min ；
3)轉(zhuǎn)化后的大豆幼苗在吸水紙上空干，隨后種入濕潤的蛭石/營養(yǎng)土(2/1)混合土中，覆薄土，25 黑暗培養(yǎng)2天；
4)每孔單株種入50孔穴盤，標記左上角1孔種入2株野生型植株作為對照，大棚正
常培養(yǎng)。實施例二、大豆轉(zhuǎn)基因陽性植株的檢測以及獲得 1、TO代轉(zhuǎn)基因陽性苗的篩選以及獲得
用農(nóng)桿菌介導的縱切上胚軸頂端的方法轉(zhuǎn)化大豆得到的TO代轉(zhuǎn)基因植株為嵌合體， 植株的部分器官含有目的表達，具有目標表型。因載體含有目的基因bar，如果轉(zhuǎn)基因成功，bar插入大豆基因組，使轉(zhuǎn)基因陽性植株的部分器官具有草銨磷抗性。所以，我們通過草胺磷檢測實施例一中的轉(zhuǎn)基因大豆的葉片來篩選TO代陽性轉(zhuǎn)基因植株。大豆的葉片為三生復(fù)葉，選取復(fù)葉的中間小葉片，用Mark筆標記一個圓圈，用移液器滴加2μ 1草銨磷溶液(Basta 100mg/L + silwet_L77 200 μ 1/L)在圓圈中間，5-6天后不具抗性的植株表現(xiàn)萎蔫、枯黃等明顯的藥害反應(yīng)。用上述方法涂抹大豆的第一片直到第五片復(fù)葉。五片復(fù)葉均表現(xiàn)草銨磷藥害反應(yīng)的，認定為轉(zhuǎn)基因陰性植株，有一片及以上葉片表現(xiàn)草胺磷抗性的，認定為轉(zhuǎn)基因陽性植株(圖1)。我們利用涂抹法篩選得到220株TO代陽性植株。得到的將陽性植株移栽入土壤中，在大棚條件下培養(yǎng)，直至種子成熟收獲Tl代種子。2、Tl代轉(zhuǎn)基因植株的篩選
我們用草胺磷對Tl代轉(zhuǎn)基因株系進行了進一步的篩選。將收獲的T1代種子播種適于土壤中(播種量達36Kg/畝，1/10面積作管理控制用)，待第一片復(fù)生葉完全展開，噴灑草銨磷溶液(Basta 100mg/L + silwet_L77 200 μ 1/L，除草劑噴灑量達到90L/畝)，7-10天后藥害反應(yīng)穩(wěn)定，對草銨磷表現(xiàn)抗性的植株為轉(zhuǎn)基因陽性植株(圖2)。3、Tl代轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測
對Tl代草胺磷篩選的抗性植株，進行PCR檢測實驗進一步驗證轉(zhuǎn)基因是否成功。轉(zhuǎn)基因陽性植株因成功轉(zhuǎn)化bar基因而表現(xiàn)草胺磷抗性。根據(jù)bar基因的序列，設(shè)計PCR擴增引物，進一步驗證轉(zhuǎn)基因株系的陽性。每株取一片新展開的葉片，CTAB法提取植物基因組 DNA。取IOpg的基因組DNA進行PCR反應(yīng)。根據(jù)bar基因的序列，PCR擴增引物序列如下 引物 1 (上游)5' TCATCAGATTTCGGTGACGG 3' 引物 2 (下游)5' TCAACTTCCGTACCGAGCCG 3'
分別利用引物1和引物2，以抗性植株基因組DNA模板，擴增bar基因片段。擴增體系和程序為
10X Buffer 2ul ；IOmM dNTP 0. 5ul ；IOuM引物1 0. 5ul ；IOuM引物2 0. 5ul ；genomic DNA IOpg ；Taq DNA Polymerase(5U/ul):0. 4ulddH20 補足20ul。PCR反應(yīng)條件為 預(yù)變性95°C， 5min ； 變性 94°C， 20sec ； 退火 55°C, 30sec ； 延伸 72°C， Imin ； 30個循環(huán)；
再延伸72°C，IOmin0反應(yīng)結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可以檢測到450bp的目的片段(結(jié)果見圖3)。我們對10個株系進行了 PCR實驗，結(jié)果全部呈陽性。這進一步證明了我們獲得的抗性植株為轉(zhuǎn)基因陽性株系。4. Tl代陽性植株的Southern blot檢測
為了確定目標bar基因確實整合到了大豆基因組上，以及整合的拷貝數(shù)，我們進一步進行Southern blot檢測。根據(jù)bar基因的序列，設(shè)計Southern blot的探針模板引物如下
引物 3 (上游)5' TCATCAGATTTCGGTGACG 3' 弓丨物 4 (下游)5' ATGAGCCCAGAACGACGC 3'
取大豆復(fù)葉的中間葉片，CTAB法提取植物基因組DNA。利用引物3和引物4擴增得到的片段制作bar探針，PCR擴增反應(yīng)條件同上。Southern檢測為本領(lǐng)域常規(guī)做法。我們得到了 5個株系的單拷貝轉(zhuǎn)基因陽性植株，檢測結(jié)果如圖4示。以上實驗證明，我們利用農(nóng)桿菌介導的大豆縱切上胚軸頂端轉(zhuǎn)化法成功得到了基因大豆，該方法操作簡便、成本高、轉(zhuǎn)化效率相對較高，具有比較大的實用性和產(chǎn)業(yè)推廣價值。
權(quán)利要求
1.一種農(nóng)桿菌介導的縱切幼苗上胚軸頂端轉(zhuǎn)化大豆的轉(zhuǎn)基因方法，包括以下步驟(a)浸泡大豆，光照保濕條件下培養(yǎng)至下胚軸長2 3cm；(b)將含有目的基因的農(nóng)桿菌用滲透培養(yǎng)基懸浮，所述滲透培養(yǎng)基含有細胞分裂素KT、 植物生長素2，4-D、抗氧化劑DTT和L-Cysteine ；(c)在滲透培養(yǎng)基中，用薄刀刃在大豆的上胚軸頂端縱切，制造傷口；(d)致傷處理后的大豆幼苗浸沒在滲透培養(yǎng)基中培養(yǎng)；(e)農(nóng)桿菌侵染后的大豆幼苗在吸水紙上吸干水分，種入土中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大豆轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于所述滲透培養(yǎng)基中植物生長素2，4-D的優(yōu)選用量為0. 5-5mg/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大豆轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于所述滲透培養(yǎng)基中細胞分裂素KT的優(yōu)選用量為0. l"4mg/L0
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大豆轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于所述滲透培養(yǎng)基抗氧化劑DTT 的優(yōu)選用量為0. 5-5mM/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大豆轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于所述滲透培養(yǎng)基L-Cysteine 的優(yōu)選用量為100 400mg/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大豆轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于所述含有目的基因的農(nóng)桿菌是將目的基因插入表達載體，再將該載體導入農(nóng)桿菌中。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的大豆轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于所述表達載體為植物表達載體，優(yōu)選PBin系列載體、pBI系列在、Gateway系列載體、pCAMBIA系列載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的農(nóng)桿菌菌株，為可轉(zhuǎn)染植物的農(nóng)桿菌菌株，優(yōu)選AGLO、AGLU GV3101、EHA105、LBA4404。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大豆轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于步驟(c)所述的在大豆的上胚軸頂端縱切為順大豆兩子葉夾縫，劃傷上胚軸頂端外側(cè)，使夾縫向胚軸方向延長，優(yōu)選延長 4 6mm0
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大豆轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于步驟(d)所述的在滲透培養(yǎng)基中的培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為^°C、24hr黑暗、130 170rpm處理15 30min。
11.根據(jù)權(quán)利要求廣10任一權(quán)利要求所述的大豆轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于，所述大豆為栽培或野生大豆品種、品系、育種材料或中間材料。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種農(nóng)桿菌介導的縱切幼苗上胚軸頂端轉(zhuǎn)化大豆的轉(zhuǎn)基因方法，包括(a)浸泡大豆，光照保濕條件下培養(yǎng)至下胚軸長2～3cm；(b)將含有目的基因的農(nóng)桿菌用滲透培養(yǎng)基懸浮，所述滲透培養(yǎng)基含有細胞分裂素KT、植物生長素2,4-D、抗氧化劑DTT和L-Cysteine；(c)在滲透培養(yǎng)基中，用薄刀刃在大豆的上胚軸頂端縱切，制造傷口；(d)致傷處理后的大豆幼苗浸沒在滲透培養(yǎng)基中培養(yǎng)；(e)農(nóng)桿菌侵染后的大豆幼苗在吸水紙上吸干水分，種入土中。該方法是一種無需經(jīng)過組織培養(yǎng)階段的農(nóng)桿菌介導的大豆轉(zhuǎn)化方法，具有比較高的實際應(yīng)用價值和推廣前景。
文檔編號C12N15/82GK102329816SQ20111016020
公開日2012年1月25日 申請日期2011年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月15日
發(fā)明者何峰, 夏勉, 孔祥鳳, 張會新, 張斌, 鄭辰 申請人:北京未名凱拓作物設(shè)計中心有限公司