專利名稱：一種p2y122穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的建立及其在藥物篩選中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域和醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種P2Y122穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系及其在藥物篩選中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
人類血小板包括三種不同的ADP受體P2Y12、P2Y122和P2X1。Ρ2Χ1是配體門(mén)控離子通道，Ρ2Υ12、2Υ12是與不同的兩種G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)。Ρ2Υ122屬于G蛋白偶聯(lián)受體中的Gi類，其中Ρ2Υ12、2Υ12是ADP作用的受體，也是ADP受體阻滯劑作用靶點(diǎn)。Ρ2ΥΙ2受體與Gi蛋白偶聯(lián)，當(dāng)與其激動(dòng)劑ADP結(jié)合通過(guò)激活Gi信號(hào)傳導(dǎo)抑制腺昔酸環(huán)化酶(AC)，使細(xì)胞內(nèi)ATP不能有效地轉(zhuǎn)化為的cAMP，從而使血小板內(nèi)的cAMP升高的幅度下降，在P2Y12受體的協(xié)同作用下，傳導(dǎo)信號(hào)被放大，促進(jìn)血小極分泌大量ADP，形成正反饋加速血小板聚 集。此外，通過(guò)ADP激動(dòng)該受體，易化了纖維蛋白原綁定糖蛋白(GP) IIbIIIa受體，最終導(dǎo)致部分可逆的血小板初次聚集與不可逆的血小板再次聚集。P2Y122是ADP誘導(dǎo)血小板聚集反應(yīng)中的主要受體，也是噻氯吡啶、氯吡格雷等藥物的作用靶點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種P2Y122穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的制備方法。本發(fā)明提供的P2Y122穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的制備方法，包括以下步驟I)將P2Y122基因的編碼序列插入到真核表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)，得到重組表達(dá)載體；2)將步驟I得到的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，篩選得到穩(wěn)定表達(dá)P2Y122的細(xì)胞系。上述真核表達(dá)載體具體可為pTagLite-Snap、pEGFP_N3等。為了便于對(duì)表達(dá)的P2Y122進(jìn)行細(xì)胞定位，可在真核表達(dá)載體上加入能于宿主中表達(dá)并產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因，如SNAP、GFP、YFP等。上述宿主細(xì)胞可為Hela細(xì)胞、MDA_MB_231細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞等。利用上述方法制備的P2Y122穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種篩選預(yù)防和/或治療缺血性腦卒中、心肌梗死等藥物的細(xì)胞模型。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的P2Y122穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株對(duì)P2Y122阻斷劑和P2Y122抗體敏感，作用顯著。本發(fā)明的P2Y122穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系為深入探索P2Y122在血栓形成的作用提供實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺(tái)，可用于篩選預(yù)防和/或治療缺血性腦卒中、心肌梗死等藥物。


圖I為重組表達(dá)載體pTagLite-Snap_P2Y122的構(gòu)建流程圖
圖2為各穩(wěn)定表達(dá)P2Y122細(xì)胞系的P2Y122表達(dá)量實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖3為P2Y122穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系對(duì)P2Y122抑制劑的敏感性分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，實(shí)施例僅為解釋性的，絕不意味著以任何方式限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的P2Y122穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的具體構(gòu)建流程如圖I所示。實(shí)施例I.重組真核表達(dá)載體pTagLite-Snap_P2Y122的構(gòu)建下述實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所用的DNA引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。
根據(jù)P2Y122蛋白編碼框的cDNA序列，設(shè)計(jì)PCR引物如下正向引物5，-ACTGATATCAGAAATGCAAGCCGTCGACAACCTC-3，(下劃線處為限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn))；反向引物5' -AACGAGCTCCATTGGAGTCTCTTCATTTGGGTCA-3 '(下劃線處為限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn))。取人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC并提取總RNA，將其反轉(zhuǎn)成cDNA，以該cDNA為模板，利用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳純化和回收，用限制性內(nèi)切酶EcoRV和Xho I對(duì)純化回收后的產(chǎn)物進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物再次進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳純化和回收，得到P2Y122蛋白編碼框的cDNA序列。同時(shí)，將真核表達(dá)載體pTagLite-Snap (購(gòu)自Cisbio公司)也用EcoR V和Xho I進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳純化和回收。用DNA連接酶連接上述擴(kuò)增得到的P2Y122蛋白編碼框的cDNA序列和真核表達(dá)載體pTagLite-Snap酶切后的產(chǎn)物,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E. coli Top 10)感受態(tài)細(xì)胞,并涂布于含有氨芐青霉素的LB平板上，挑取單克隆進(jìn)行PCR檢測(cè)。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，以檢測(cè)陽(yáng)性克隆中插入序列的正確。測(cè)序結(jié)果表明，插入的1026bp的P2Y122蛋白編碼框的cDNA序列與 GenBank Accession Number NM 022788.3 的自 5'端第 245 位-第 1270 位的序列一致。將得到的重組表達(dá)載體命名為pTagLite-Snap-P2Y122。實(shí)施例2.P2Y122穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的建立將上述步驟一得到的重組大腸桿菌利用Wizard Plus SV Minipreps (購(gòu)自Promega)提取質(zhì)粒,得到高純度的重組表達(dá)載體pTagLite_Snap-P2Y122,將重組表達(dá)載體pTagLite_Snap-P2Y122 利用 Lipofectamine 2000(購(gòu)自 Invitrogen)轉(zhuǎn)染 HeLa 細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的HeLa細(xì)胞24小時(shí)以上。用G418 (濃度為I μ g/ml)對(duì)重組HeLa細(xì)胞進(jìn)行篩選，經(jīng)多次篩選后，得到P2Y122的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。將各株P(guān)2Y122穩(wěn)定表達(dá)的Hela細(xì)胞株保存于液氮中。選取四個(gè)P2Y122穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，利用抗P2Y122的抗體(購(gòu)自AbCam公司)進(jìn)行蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖2所示。其中，A-D分別表示不同的ET2的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的P2Y122表達(dá)量,Blank為轉(zhuǎn)入真核表達(dá)載體pTagLite-Snap的空白對(duì)照細(xì)胞,anti-Tubulin表示參照。結(jié)果表明，各P2Y122的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株均有不用程度的P2Y122表達(dá)。實(shí)施例3.
P2Y122穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系對(duì)P2Y122抑制劑(Clopidogrel)的敏感性分析選用上述實(shí)施例2的P2Y122穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞、轉(zhuǎn)入真核表達(dá)載體pTagLite-Snap的細(xì)胞進(jìn)行P2Y122抑制劑敏感性試驗(yàn)。將P2Y122穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞、轉(zhuǎn)入真核表達(dá)載體pTagLite-Snap的細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM+10%胎牛血清的培養(yǎng)基里，將處于旺盛生長(zhǎng)期的細(xì)胞(一般在傳代后20小時(shí)左右)經(jīng)膜蛋白酶消化重懸后，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以每孔IO3到IO4個(gè)細(xì)胞的量接種于96孔板中進(jìn)行擴(kuò)增，且每孔細(xì)胞數(shù)目均勻。24小時(shí)后，分別加入P2Y122抑制劑(Clopidogrel)。抑制劑(Clopidogrel)的濃度分別為10、20、30、40和50nM。而后按照ET cell-based Assay Kit(購(gòu)自Cisbio)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行HTRF(均相時(shí)間分辨突光)實(shí) 驗(yàn)，在加入抑制劑后的細(xì)胞孔板中加入標(biāo)記的一抗和二抗，孵育30min后在sunrise酶標(biāo)儀(TECAN公司產(chǎn)品)上于665和620nm波長(zhǎng)處讀取吸光值，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，具體結(jié)果如圖3所
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權(quán)利要求
1.一種P2Y12穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的制備方法,包括以下步驟 1)將P2Y12的編碼基因插入真核表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)，得到重組表達(dá)載體； 2)將步驟I得到的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，篩選得到穩(wěn)定表達(dá)P2Y12的細(xì)胞系。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述真核表達(dá)載體為pTagLite-Snap或PEGFP-N3。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述宿主細(xì)胞為HeLa細(xì)胞、MDA-MB-231細(xì)胞或MCF-7細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法制備的P2Y12穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的P2Y12穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系，其特征在于，所述P2Y12穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系為SNAP-P2Y12穩(wěn)定表達(dá)的HeLa細(xì)胞系。
6.權(quán)利要求4-5中任一項(xiàng)所述的P2Y12穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系在篩選預(yù)防和/或治療針對(duì)此靶點(diǎn)藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供的P2Y122穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的制備方法，從而提供一種篩選預(yù)防和/或治療高血壓、缺血性心臟病的藥物的細(xì)胞模型。本發(fā)明提供的P2Y122穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的制備方法，包括以下步驟1)將P2Y122基因的編碼序列插入到真核表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)，得到重組表達(dá)載體；2)將步驟1得到的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，篩選得到穩(wěn)定表達(dá)P2Y122的細(xì)胞系。
文檔編號(hào)C12N5/10GK102827869SQ20111016085
公開(kāi)日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2011年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月16日
發(fā)明者譚初兵, 付剛, 徐為人 申請(qǐng)人:天津藥物研究院