專(zhuān)利名稱(chēng)：：用于核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的微芯片、制造其的方法和核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用于核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)(等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)，isothermalnucleic-acidamplificationreaction)的微芯片(microchip)、一禾中用于制造該微芯片的方法、以及一種核酸等溫?cái)U(kuò)增方法。更具體地，本發(fā)明涉及一種用于核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的微芯片，該微芯片被構(gòu)造成精確地控制核酸擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間等。
背景技術(shù)：
：迄今，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法已經(jīng)被用作一種核酸擴(kuò)增方法。在PCR方法中，用作模板的核酸通過(guò)重復(fù)包括以下三個(gè)步驟的溫度循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增(1)熱變性；(2)退火；以及(3)伸長(zhǎng)反應(yīng)(elongationreaction)。步驟(1)中的熱變性是將模板核酸鏈從雙鏈離解成單鏈的步驟。熱變性期間的反應(yīng)溫度通常為約94°C。步驟(中的退火是將寡核苷酸引物結(jié)合至各自已被離解成單鏈的模板核苷酸鏈的步驟。退火期間的反應(yīng)溫度通常為約50°C60°C。步驟(3)中的伸長(zhǎng)反應(yīng)是利用DNA聚合酶合成與相應(yīng)單鏈互補(bǔ)的DNA分子的步驟，該合成從已結(jié)合寡核苷酸引物的部分開(kāi)始。伸長(zhǎng)反應(yīng)期間的反應(yīng)溫度通常為約72°C。近來(lái)，一種稱(chēng)為等溫?cái)U(kuò)增法的方法，其是一種不需要重復(fù)溫度循環(huán)的更簡(jiǎn)單的方法，已被用作核酸擴(kuò)增方法。例如，在環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)方法中，通過(guò)混合模板核酸鏈與試劑如寡核苷酸引物、鏈置換DNA聚合酶和核酸單體，并在恒定溫度(約65°C)下維持所得混合物而完成反應(yīng)。因此，根據(jù)這種LAMP方法，能夠在一個(gè)步驟中擴(kuò)增核酸。與本發(fā)明相關(guān)的，近來(lái)，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了核酸擴(kuò)增裝置(例如實(shí)時(shí)PCR裝置)，其中核酸擴(kuò)增反應(yīng)在微芯片的孔中實(shí)施，并且擴(kuò)增的核酸鏈進(jìn)行光學(xué)檢測(cè)或定量。日本未審查專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)No.2007-43998披露了一種微流體芯片，其中將寡核酸引物、底物、酶和核酸擴(kuò)增反應(yīng)所需的其他試劑以固體狀態(tài)置于通道(channel)中。在這種微流體芯片中，當(dāng)反應(yīng)所需的其他試劑以液體狀態(tài)送到通道時(shí)，液體狀態(tài)的試劑和固體狀態(tài)的試劑彼此接觸并且固體狀態(tài)的試劑溶解，由此開(kāi)始該反應(yīng)。
發(fā)明內(nèi)容在PCR方法中，采用一種稱(chēng)為“熱啟動(dòng)法(hot-startmethod)”的方法以便嚴(yán)格控制反應(yīng)時(shí)間。該熱啟動(dòng)法是這樣的一種方法，其中防止了由于寡核苷酸引物的誤退火(misarmealing)導(dǎo)致的非特異性擴(kuò)增反應(yīng)，并獲得期望的擴(kuò)增產(chǎn)物的方法。通過(guò)將包含靶核酸鏈和不同于DNA聚合酶的試劑的混合液體加熱至寡核苷酸引物的變性溫度(denaturationtemperature)、在該變性溫度下加入酶、然后實(shí)施溫度循環(huán)來(lái)實(shí)現(xiàn)該熱啟動(dòng)法。相反，在等溫?cái)U(kuò)增方法中，由于反應(yīng)在恒溫下在一個(gè)步驟中執(zhí)行，所以不會(huì)使用熱啟動(dòng)法。因此，反應(yīng)在試劑和模板核酸鏈進(jìn)行混合時(shí)的時(shí)間逐步進(jìn)行，并因此很難嚴(yán)格控制反應(yīng)時(shí)間。迄今，在微芯片型核酸擴(kuò)增裝置中，采用了這樣的方法，其中試劑和模板核酸鏈預(yù)先混合，然后將所得混合液體引入到微芯片的孔中而執(zhí)行反應(yīng)。因此，反應(yīng)可以在制備混合液體期間或?qū)⒒旌弦后w引入到孔中的期間在混合液體中進(jìn)行。因此，很難嚴(yán)格控制反應(yīng)時(shí)間，導(dǎo)致產(chǎn)生在擴(kuò)增的核酸鏈的定量方面的問(wèn)題。期望提供一種用于在等溫?cái)U(kuò)增方法中精確控制反應(yīng)時(shí)間的技術(shù)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，提供了一種用于核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的微芯片，其中對(duì)于核酸的等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)所需的物質(zhì)中的至少一種(或至少一部分)存在于充當(dāng)反應(yīng)的反應(yīng)場(chǎng)所的反應(yīng)區(qū)中，該物質(zhì)中的至少一種利用在高于室溫(常溫，roomtemperature)且低于反應(yīng)的反應(yīng)溫度的溫度下發(fā)生熔化的薄膜覆蓋。在用于核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的微芯片中，反應(yīng)所需的其他物質(zhì)(remainingsubstance)中的至少一種優(yōu)選固定在覆蓋反應(yīng)所需的物質(zhì)中的至少一種的薄膜上。在用于核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的微芯片中，在反應(yīng)區(qū)中存在的物質(zhì)中的至少一種可以是選自寡核苷酸引物、酶和核酸單體中的至少一種。在用于核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的這種微芯片中，在包含其他物質(zhì)和靶核酸鏈的樣品溶液供應(yīng)到反應(yīng)區(qū)之后，通過(guò)加熱覆蓋預(yù)先置于反應(yīng)區(qū)中的物質(zhì)中的至少一種的薄膜而熔化該薄膜，反應(yīng)能夠在任意定時(shí)(timing，時(shí)刻)下開(kāi)始。在用于核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的微芯片中，寡核苷酸引物優(yōu)選固定在覆蓋酶的薄膜上。在用于核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的微芯片中，薄膜優(yōu)選通過(guò)蒸著(蒸鍍，evaporation)硬脂酸或固體石蠟而形成。用于核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的微芯片優(yōu)選包括將液體從外部引入到其內(nèi)的進(jìn)口、多個(gè)反應(yīng)區(qū)、以及構(gòu)造成將從進(jìn)口引入的液體供應(yīng)到(各個(gè))反應(yīng)區(qū)的通道。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式，提供了一種制造用于核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的微芯片的方法，該方法包括利用在高于室溫且低于反應(yīng)的反應(yīng)溫度的溫度下發(fā)生熔化的薄膜覆蓋對(duì)于核酸的等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)所需的物質(zhì)中的至少一種，該物質(zhì)中的至少一種被置于充當(dāng)反應(yīng)的反應(yīng)場(chǎng)所的反應(yīng)區(qū)中。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式，提供了一種核酸等溫?cái)U(kuò)增方法，包括，在存在對(duì)于核酸的等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)所需的物質(zhì)中的至少一種的反應(yīng)區(qū)中，該物質(zhì)中的至少一種利用在高于室溫且低于反應(yīng)的反應(yīng)溫度的溫度下發(fā)生熔化的薄膜覆蓋，引入對(duì)于反應(yīng)所需的其他物質(zhì)；以及將溫度升高至反應(yīng)溫度。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，“核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)”包括不涉及溫度循環(huán)的各種擴(kuò)增反應(yīng)。等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的實(shí)例包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)方法、Smart擴(kuò)增過(guò)程(SMAP)、基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)方法、等溫的且嵌合引物引發(fā)的核酸擴(kuò)增(ICAN)方法(注冊(cè)商標(biāo))、轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄協(xié)同(TRC)方法、鏈置換擴(kuò)增(SDA)方法、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增(TMA)方法、以及滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)方法。另外，“核酸擴(kuò)增反應(yīng)”廣泛包括用于核酸擴(kuò)增目的的在恒溫下的核酸擴(kuò)增反應(yīng)。除了核酸鏈的擴(kuò)增外，這些核酸擴(kuò)增反應(yīng)還包括涉及擴(kuò)增的核酸鏈的定量確定的反應(yīng)，例如實(shí)時(shí)(RT)-LAMP方法。“對(duì)于反應(yīng)所需的物質(zhì)”是指對(duì)于在核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)中獲得擴(kuò)增的核酸鏈所需的物質(zhì)。這些物質(zhì)的具體實(shí)例包括各自具有與靶核苷酸鏈互補(bǔ)的堿基序列的寡核苷酸引物、核酸單體(脫氧核苷-三磷酸(dNTP))、酶以及反應(yīng)緩沖液的溶質(zhì)(溶解物，solute)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，提供了一種用于在等溫?cái)U(kuò)增方法中精確控制反應(yīng)時(shí)間的技術(shù)。圖1是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的一種微芯片的示意性俯視圖；圖2是微芯片的示意性剖視圖(即，沿圖1的線(xiàn)II-II截取的剖視圖)；圖3A3C是示出了對(duì)于反應(yīng)所需的物質(zhì)的示意圖，這些物質(zhì)存在于微芯片的孔中；圖4是示出了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的一種制造用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的微芯片的方法的流程圖；圖5A5C是示出了對(duì)于反應(yīng)所需的物質(zhì)的示意圖，這些物質(zhì)存在于根據(jù)一種變形的微芯片的孔中；圖6是示出了根據(jù)一種變形的制造用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的微芯片的方法的流程圖；圖7是示出了在引物通過(guò)利用硬脂酸或固體石蠟覆蓋而被固定的反應(yīng)系統(tǒng)中的LAMP反應(yīng)的結(jié)果(實(shí)施例2)的圖示；以及圖8是示出了在酶通過(guò)用硬脂酸或固體石蠟覆蓋而被固定的反應(yīng)系統(tǒng)中的LAMP反應(yīng)的結(jié)果(實(shí)施例2)的圖示。具體實(shí)施例方式現(xiàn)在將參考附圖描述實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的實(shí)施方式。以下描述的實(shí)施方式僅舉例說(shuō)明了本發(fā)明的典型實(shí)施方式的實(shí)例，而本發(fā)明的范圍不由這些實(shí)施方式狹窄地進(jìn)行解釋。1、用于核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的微芯片和核酸等溫?cái)U(kuò)增方法[用于核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的微芯片]圖1是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的用于核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的微芯片(下文中，也簡(jiǎn)稱(chēng)為“微芯片”)的示意性俯視圖，而圖2是該微芯片的示意性剖視圖。圖2對(duì)應(yīng)于沿圖1中的線(xiàn)II-II截取的剖面。微芯片A包括從外部向其內(nèi)引入液體(樣品溶液)的進(jìn)口1、充當(dāng)核酸擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)場(chǎng)所的多個(gè)孔(反應(yīng)區(qū))、一端與進(jìn)口1聯(lián)通的主通道2、以及從主通道2分支的支通道3。主通道2的另一端充當(dāng)將樣品溶液排放到外部的出口5。支通道3在主通道2的與進(jìn)口1聯(lián)通的部分和與出口5聯(lián)通的部分之間的位置處從主通道2分支，并且各自連接至相應(yīng)的孔。樣品溶液能夠包含在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中用作模板核酸鏈的DNA、基因組RNA、mRNA寸。在這個(gè)實(shí)施方式中，共9個(gè)孔以三排和三列的均勻間隔布置在微芯片A中。這9個(gè)孔分成三組。在圖1上排中的三個(gè)孔用標(biāo)號(hào)41指示，在圖1的中排中的三個(gè)孔用標(biāo)號(hào)42指示，而在圖1下排中的三個(gè)孔用標(biāo)號(hào)43指示。從進(jìn)口1引入的樣品溶液經(jīng)過(guò)主通道2傳送到出口5并在溶液傳送方向上從上游順序地供應(yīng)到支通道3和孔中。在微芯片A中，可以不提供出口5。具體地，微芯片A可以構(gòu)造成從進(jìn)口1引入的樣品溶液不排放到外部。5通過(guò)將襯底層結(jié)合到其中形成有進(jìn)口1、主通道2、支通道3、孔41、42和43、以及出口5的襯底層而制造微芯片A。襯底層和的材料可以是玻璃或塑料如聚丙烯、聚碳酸酯、環(huán)烯烴聚合物、或聚二甲基硅氧烷(PDMS)。當(dāng)通過(guò)光學(xué)方法實(shí)施在孔41、42和43中擴(kuò)增的核酸鏈的檢測(cè)或定量確定時(shí)，襯底層％和％的材料優(yōu)選地選自具有光學(xué)透明性和低光學(xué)誤差的材料，因?yàn)檫@樣的材料具有低自身熒光和小波長(zhǎng)色散。對(duì)于反應(yīng)所需的物質(zhì)中的至少一種存在于孔41、42和43中，該物質(zhì)中的至少一種利用具有熱熔化性能的薄膜覆蓋。圖3A3C示出了置于孔中的物質(zhì)。圖3A示出了置于孔41中的物質(zhì)，圖:3B示出了置于孔42中的物質(zhì)，而圖3C示出了置于孔43中的物質(zhì)。存在于孔中的物質(zhì)是對(duì)于在核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)中獲得擴(kuò)增的核酸鏈所需的物質(zhì)。具體地，該物質(zhì)選自具有與靶核酸鏈互補(bǔ)的堿基序列的寡核苷酸引物、核酸單體(dNTP)、酶、反應(yīng)緩沖液的溶質(zhì)等。這些物質(zhì)的一種或多種可以存在于這些孔的每一個(gè)中。而且，對(duì)于檢測(cè)和定量地確定擴(kuò)增的核酸鏈所需的試劑，例如，熒光試劑(熒光染料)或磷光試劑(磷光染料)，可以可選地置于孔中，盡管這樣的試劑對(duì)于獲得擴(kuò)增的核酸鏈不是必需使用的。圖3A3C示出了其中寡核苷酸引物(下文中，也簡(jiǎn)稱(chēng)為“引物)P。P2和P3分別置于孔41、42和43中的情形。弓丨物P1,P2和P3可以是具有相同堿基序列的引物。然而，當(dāng)在微芯片A中擴(kuò)增多個(gè)靶核酸鏈時(shí)，具有不同堿基序列的引物被用作引物PpP2和p3。例如，當(dāng)利用微芯片A來(lái)確定基因型時(shí)，具有根據(jù)各個(gè)基因型的堿基序列而不同的堿基序列的引物分別置于孔41、42和43中。類(lèi)似地，當(dāng)接觸傳染原(contagium)利用微芯片A確定時(shí)，具有根據(jù)各種病毒或微生物的基因序列而不同的堿基序列的引物分別置于這些孔中。在這些孔中的引物P1I2和P3各自利用在高于室溫且低于核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)溫度的溫度下進(jìn)行加熱而發(fā)生熔化的薄膜6覆蓋。薄膜6由在低于熔化溫度的溫度(包括室溫)下喪失流動(dòng)性并進(jìn)入固體狀態(tài)，而在等于或高于熔化溫度的溫度下發(fā)生熔化或流化并進(jìn)入液體狀態(tài)或凝膠狀態(tài)的材料形成。在低于熔化溫度的溫度下，用薄膜6覆蓋的引物PpP2和P3各自存在于相應(yīng)固體薄膜6內(nèi)而與外部隔離。在等于或高于熔化溫度的溫度下，引物PpP2和P3各自從被流化或坍塌的相應(yīng)薄膜6釋放，并且能夠與外部接觸。核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)溫度通常在50°C75°C的范圍內(nèi)。確定薄膜6的熔化溫度或流化溫度以高于約25°C的室溫，并且低于50°C75°C的反應(yīng)溫度。通過(guò)設(shè)計(jì)在這個(gè)范圍內(nèi)的薄膜6的熔化溫度等，引物PpP2和P3在低于熔化溫度的溫度下能夠可靠地與外部隔離，并且在等于或高于熔化溫度的溫度下能夠快速地釋放。為了使引物PpP2和P3在低于熔化溫度的溫度下可靠地與外部隔離，薄膜6優(yōu)選具有拒水性(waterr印ellency)。通過(guò)對(duì)薄膜6賦予拒水性，可以防止薄膜6在低于熔化溫度的溫度下被引入孔中的樣品溶液溶解。對(duì)薄膜6的材料沒(méi)有特別限制，只要該材料具有以上所述的熔化溫度等并且優(yōu)選具有拒水性。薄膜6的材料的實(shí)例包括脂肪酸如硬脂酸、棕櫚酸和肉豆蔻酸(myristicacid)、山俞醇(behenylalcohol)、瓊脂糖、固體石蠟、微晶石蠟和明膠。關(guān)于這些材料的熔點(diǎn)，硬脂酸具有69°C的熔點(diǎn)，棕櫚酸具有63°C的熔點(diǎn)，肉豆蔻酸的熔點(diǎn)，山俞醇具有65°C73°C的熔點(diǎn)，瓊脂糖具有65°C的熔點(diǎn)，固體石蠟具有40°C70°C的熔點(diǎn)，微晶石蠟具有60V90°C的熔點(diǎn)，而明膠具有40°C50°C的熔點(diǎn)。薄膜6的材料的實(shí)例還包括天然材料如從棕櫚科植物的葉子的分泌物獲得的且包含大量(30%35%)的羥基烴酸酯(hydroxyacidester)的卡那巴蠟(carnaiAawax)、從在北非南部的干燥區(qū)域中生長(zhǎng)的植物獲得的且具有高比例(40%50%)的烴的堪地里拉蠟(candelillawax)、從日本蠟樹(shù)的堅(jiān)果獲得的且包含甘油酯作為主要成分的植物蠟(vegetablewax)、以及其他植物氫化脂肪和油。關(guān)于這些材料的熔點(diǎn)，卡那巴蠟具有800C860C的熔點(diǎn)，堪地里拉蠟具有66°C71°C的熔點(diǎn)，植物蠟具有50°C56°C的熔點(diǎn)，而植物氫化脂肪和油通常具有48°C70°C的熔點(diǎn)。此外，作為薄膜6的材料，以下化合物也具有上述的熔化溫度等。其實(shí)例進(jìn)一步包括Nb(NtC5H11)[N(CH3)J3(熔點(diǎn):47°C)；三(乙基環(huán)戊二烯基)鐠(PrtCp)3)(熔點(diǎn)70°C73°C)，其是一種環(huán)戊二烯基(Cp)復(fù)合物；Ta(NtC5H11)[N(CH3)J3(熔點(diǎn)36°C)，其被用作用于形成TaN阻隔膜的材料；三乙二醇-二[3-(3-叔丁基-5-甲基-4-羥苯基)丙酸酯(熔點(diǎn)76°C79°C)，其是一種用于苯乙烯樹(shù)脂的抗氧化物；2，2_硫代-二乙烯二[3-(3，5-二叔丁基-4-羥苯基)丙酸酯(熔點(diǎn)63°C或更高)和十八烷基-3-(3，5-二叔丁基-4-羥苯基)丙酸酯(熔點(diǎn)50°C53°C)，其被用作抗氧化物；焙蘇打(熔點(diǎn)70°C)；以及1-乙基-3-甲基咪唑鐺二氟化物(熔點(diǎn)51°C)，其是一種離子液體。關(guān)于薄膜6的材料，優(yōu)選選取當(dāng)該材料熔化并混合在樣品溶液中時(shí)不會(huì)抑制核酸擴(kuò)增反應(yīng)的材料。如以下實(shí)施例中描述的，例如，硬脂酸和固體石蠟不具有反應(yīng)抑制性能?？商鎿Q地，期望將薄膜6的厚度減小至當(dāng)薄膜6熔化并混合在樣品溶液中時(shí)反應(yīng)抑制可忽略的程度。薄膜6的厚度優(yōu)選被控制在為例如IOOOnm(體積lnL)以下。在這種情況下，當(dāng)薄膜6熔化時(shí)，樣品溶液中材料的濃度能夠降低至約0.1%，并因此能夠防止反應(yīng)抑制。薄膜6的厚度能夠通過(guò)蒸著以上材料來(lái)形成薄膜6而被控制在IOOOnmIOnm范圍內(nèi)的任何期望值。[核酸等溫?cái)U(kuò)增方法]接下來(lái)，將描述利用微芯片A的核酸等溫?cái)U(kuò)增方法。首先，將包含靶核酸鏈和對(duì)于反應(yīng)所需的物質(zhì)(如酶、dNTP和緩沖液溶質(zhì))的樣品溶液從進(jìn)口1供應(yīng)到每個(gè)孔中，其中這些物質(zhì)不同于預(yù)先置于孔中且然后用薄膜6覆蓋的引物。這時(shí)，樣品溶液維持在室溫下，并因此各自用薄膜6覆蓋的引物與該樣品溶液隔離。因此，通過(guò)混合引物和樣品溶液引起的反應(yīng)不會(huì)進(jìn)行。在將樣品溶液供應(yīng)到各個(gè)孔之后，將樣品溶液的溫度升高至反應(yīng)溫度。作為結(jié)果，薄膜6被流化和坍塌而使得各種引物被釋放并與樣品溶液混合。因此，開(kāi)始反應(yīng)。如上所述，在微芯片A中，通過(guò)將樣品溶液供應(yīng)到各個(gè)孔中然后將樣品溶液的溫度升高至反應(yīng)溫度而開(kāi)始反應(yīng)。因此，反應(yīng)時(shí)間能夠在微芯片A中被嚴(yán)格控制。在這個(gè)實(shí)施方式中，作為實(shí)例描述了這樣的情形，其中作為對(duì)于反應(yīng)所需的物質(zhì)，用薄膜6覆蓋的引物預(yù)先置于孔中?？商鎿Q地，置于孔中的物質(zhì)可以是酶、dNTP或緩沖液溶質(zhì)。可替換地，兩種以上的物質(zhì)，例如，引物和酶、引物和dNTP、或引物、酶和dNTP可以組合地置于孔中。在根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的微芯片中，對(duì)于反應(yīng)所需的物質(zhì)預(yù)先置于孔中，該物質(zhì)利用具有熱熔化性能的薄膜覆蓋，包含其他物質(zhì)和靶核酸鏈的樣品溶液供應(yīng)到這些孔，然后將溫度升高至反應(yīng)溫度。因此，反應(yīng)能夠在任何期望的計(jì)時(shí)下開(kāi)始。根據(jù)這種微芯片，反應(yīng)時(shí)間能夠被嚴(yán)格控制并且擴(kuò)增的核酸鏈能夠以高精確性定量地確定。在根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的微芯片中，孔的數(shù)量和孔的布置位置沒(méi)有限制，并且孔的形狀也不限于附圖中所示的圓柱狀。用于將引入到進(jìn)口1中的樣品溶液供應(yīng)到各個(gè)孔的通道的結(jié)構(gòu)也不限于圖1中所示的主通道2和支通道3的結(jié)構(gòu)。此外，在這個(gè)實(shí)施方式中，描述了其中進(jìn)口1和其他部件形成在襯底層中的情形。可替換地，這些部件中的一些可以形成在襯底層％中，而其他部件可以形成在襯底層％中。構(gòu)成微芯片的襯底層的數(shù)量可以為2個(gè)以上。2、制造用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的微芯片的方法現(xiàn)在將參考圖4中所示的流程圖描述用于制造根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的微芯片的方法。通過(guò)將上述微芯片A作為實(shí)例進(jìn)行描述。(2-1)襯底層的形成在圖4中，符號(hào)S1示出了形成襯底層的步驟。在這個(gè)步驟中，進(jìn)口1、主通道2、支通道3、孔41、42和43、以及出口5形成在襯底層中。進(jìn)口1和其他部件能夠通過(guò)例如濕蝕刻或干蝕刻玻璃襯底層，或納米壓印(nanoimprinting)、注塑成型或機(jī)加工塑料襯底層而形成在襯底層中。(2-2)物質(zhì)放入到孔中符號(hào)&示出了將對(duì)于反應(yīng)所需的物質(zhì)放入到孔中的步驟。在這個(gè)步驟中，將引物PpP2和P3的溶液分別滴入到孔41,42和43中，并干燥，由此將引物置于孔中。如上所述，置于孔中的物質(zhì)不限于寡核苷酸引物?？商鎿Q地，例如，可以將dNTP、酶或緩沖液溶質(zhì)置于孔中。滴入的引物溶液優(yōu)選通過(guò)空氣干燥、真空干燥、冷凍干燥等緩慢干燥。當(dāng)置于孔中的物質(zhì)是酶時(shí)，滴入的酶溶液優(yōu)選通過(guò)臨界點(diǎn)干燥進(jìn)行干燥以防止酶活性降低或失活。(2-3)用薄膜覆蓋符號(hào)&示出了用薄膜6覆蓋放入到孔中的物質(zhì)的步驟。薄膜6能夠通過(guò)將薄膜6的材料的溶液滴到置于孔中的每種引物上，并干燥該溶液而形成。為了防止引物溶解或變性，薄膜6的材料的溶液優(yōu)選在它一接觸引物時(shí)就發(fā)生硬化。可替換地，薄膜6優(yōu)選通過(guò)在真空蒸著室中放置具有其內(nèi)包含引物的孔的襯底層％，并蒸著薄膜6的材料而形成。在實(shí)施薄膜6的蒸著中，依據(jù)薄膜6的材料確定恰當(dāng)條件，并利用常規(guī)目的的真空蒸著設(shè)備沉積薄膜6。當(dāng)將酶置于孔中時(shí)，優(yōu)選使用具有構(gòu)造成將襯底的溫度控制為30°C以下的機(jī)構(gòu)的設(shè)備以防止酶失活。(2-4)襯底層和的表面的活化和結(jié)合(粘合，bonding)符號(hào)、示出了活化襯底層和的表面。符號(hào)&示出了襯底層和之間結(jié)合的步驟。襯底層和之間的結(jié)合能夠通過(guò)例如氧等離子體處理或真空紫外光處理而活化這些襯底層的表面，然后將表面彼此結(jié)合而實(shí)施。塑料如聚二甲基硅氧烷具有與玻璃的高親和力。當(dāng)這些材料的表面經(jīng)過(guò)活化處理并使其彼此接觸時(shí)，懸空鍵(danglingbond)彼此反應(yīng)而形成Si-O-Si硅烷醇鍵，其是強(qiáng)共價(jià)鍵。因此，能夠?qū)崿F(xiàn)具有足夠強(qiáng)度的接合。在實(shí)施氧等離子體處理或真空紫外光處理中，依據(jù)襯底層的材料確定恰當(dāng)條件。在這種情況下，當(dāng)襯底層的表面通過(guò)氧等離子體處理或真空紫外光處理被活化時(shí)，薄膜6保護(hù)引物，并因此可以防止由照射等離子體或紫外光等引起的引物降解和變性。尤其是，當(dāng)預(yù)先置于孔中的物質(zhì)是酶時(shí)，薄膜6的存在能夠有效地防止由照射等離子體或紫外光等引起的酶活性降低或失活。3、制造用于根據(jù)這個(gè)實(shí)施方式的變形的核酸擴(kuò)增反應(yīng)的微芯片的方法接下來(lái)，將描述根據(jù)上述實(shí)施方式的變形的用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的微芯片、以及制造該微芯片的方法。在這種變形中，對(duì)具有與以上實(shí)施方式基本上相同功能和結(jié)構(gòu)的部件分配相同標(biāo)號(hào)和符號(hào)，并省略重復(fù)描述。[用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的微芯片]根據(jù)這種變形的微芯片A2(未示出)包括進(jìn)口1、主通道2、支通道3、孔41、42和43、出口5、以及薄膜6，它們都具有與根據(jù)上述實(shí)施方式的微芯片A的那些相同的功能和結(jié)構(gòu)。微芯片A2與根據(jù)上述實(shí)施方式的微芯片A基本上相同，只是對(duì)于反應(yīng)所需的物質(zhì)中的至少一種固定在覆蓋對(duì)于參與反應(yīng)所需的至少一種其他物質(zhì)的薄膜上。這里，將僅描述以下特征，即在孔中，對(duì)于反應(yīng)所需的物質(zhì)中的至少一種固定在覆蓋對(duì)于反應(yīng)所需的至少一種其他物質(zhì)的薄膜上。在孔中存在的物質(zhì)之中，對(duì)于用薄膜6覆蓋的物質(zhì)以及哪種物質(zhì)固定在薄膜6上沒(méi)有特別限制?，F(xiàn)在將其中引物固定在覆蓋酶的薄膜6上的情形作為實(shí)例進(jìn)行描述。圖5A5C示出了置于各個(gè)孔中的物質(zhì)。圖5A示出了置于孔41中的物質(zhì)，圖5B示出了置于孔42中的物質(zhì)，而圖5C示出了置于孔43中的物質(zhì)。這些圖示出了其中酶E置于孔41,42和43中，并且引物Pn、P12和P13各自固定在覆蓋酶E的薄膜6上的情形。在低于熔化溫度的溫度下，用薄膜6覆蓋的酶E存在于固體薄膜6內(nèi)以便與外部隔離。在等于或高于熔化溫度的溫度下，酶E從被流化并坍塌的薄膜6釋放，并且能夠與外部接觸。引物P11,P12和P13各自固定在相應(yīng)的薄膜6上，并通過(guò)將樣品溶液供應(yīng)到孔中而被再溶解(redissolved)。如同上述引物P1I2和P3—樣，引物Pn、P12和P13可以是具有相同堿基序列的引物。可替換地，當(dāng)多個(gè)靶核苷酸鏈在微芯片A2中進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，具有不同堿基序列的引物用作引物Pu、P12和P13。[核酸等溫?cái)U(kuò)增方法]利用根據(jù)這種變形的芯片A2的核酸等溫?cái)U(kuò)增方法與根據(jù)以上實(shí)施方式的核酸等溫?cái)U(kuò)增方法基本上相同，只是對(duì)于反應(yīng)所需的物質(zhì)中的至少一種固定在覆蓋對(duì)于反應(yīng)所需的至少一種其他物質(zhì)的薄膜上。具體地，在根據(jù)這種變形的芯片A2中，首先，酶用薄膜6覆蓋，并將引物固定在薄膜6上。接下來(lái)，將包含不同于置于每個(gè)孔中的酶和引物的物質(zhì)(如dNTP和緩沖液溶質(zhì))(對(duì)于反應(yīng)所需的物質(zhì))的室溫下的樣品溶液從進(jìn)口1供應(yīng)到孔。在將樣品溶液供應(yīng)到孔之后，如在根據(jù)以上實(shí)施方式的核酸等溫?cái)U(kuò)增方法中一樣，實(shí)施核酸等溫?cái)U(kuò)增方法。更具體地，首先，將包含靶核酸鏈和對(duì)于反應(yīng)所需的物質(zhì)(如dNTP和緩沖液溶質(zhì))(這些物質(zhì)不同于預(yù)先置于孔中然后用薄膜6覆蓋的引物和酶)的樣品溶液從進(jìn)口1供應(yīng)到每個(gè)孔。作為結(jié)果，引物通過(guò)樣品溶液再溶解。這時(shí)，樣品溶液被維持在室溫下，并因此用薄膜6覆蓋的酶與樣品溶液隔離。因此，通過(guò)混合酶和樣品溶液引起的反應(yīng)不會(huì)進(jìn)行。在將樣品溶液供應(yīng)到每個(gè)孔之后，將樣品溶液的溫度升高到反應(yīng)溫度。作為結(jié)果，薄膜6被流化并坍塌使得酶被釋放并與樣品溶液混合。因此，反應(yīng)開(kāi)始。如上所述，在微芯片A2中，通過(guò)將樣品溶液供應(yīng)到每個(gè)孔然后將樣品溶液的溫度升高到反應(yīng)溫度而開(kāi)始反應(yīng)。因此，在微芯片A2中能夠嚴(yán)格控制反應(yīng)時(shí)間。此外，在根據(jù)這種變形的核酸等溫?cái)U(kuò)增方法中，在酶用薄膜覆蓋并將引物固定在該薄膜上之后進(jìn)行反應(yīng)。因此，在其中酶和不同類(lèi)型的引物置于多個(gè)孔中的情形中，接觸污染原的確定能夠容易地進(jìn)行，同時(shí)精確地控制反應(yīng)時(shí)間。[制造用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的微芯片的方法]現(xiàn)在將參考圖6中所示的流程圖描述制造根據(jù)這種變形的微芯片的方法。將上述微芯片A2作為實(shí)例進(jìn)行描述。然而，由符號(hào)SpS3,S4和&所示的步驟與制造根據(jù)以上實(shí)施方式的用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的微芯片A的方法基本上相同。因此，這里將僅描述由符號(hào)&和S7所示的步驟。在圖6中，符號(hào)&示出了將對(duì)于反應(yīng)所需的物質(zhì)置于孔中的步驟。在這個(gè)步驟中，將酶E的溶液滴入到孔41、42和43中并干燥，由此將酶E置于孔中。如上所述，置于孔中的物質(zhì)不限于酶。可替換地，例如，dNTP、引物或緩沖液溶質(zhì)可以置于孔中。如在這種變形中描述的，當(dāng)置于孔中的物質(zhì)是酶時(shí)，滴入的酶溶液優(yōu)選通過(guò)臨界點(diǎn)干燥(critical-pointdrying)進(jìn)行干燥以防止酶活性的降低或失活。符號(hào)S7示出了將對(duì)于反應(yīng)所需的物質(zhì)固定在薄膜6上的步驟。在這個(gè)步驟中，引物Pu、P12和P13的溶液滴到相應(yīng)的薄膜6上并干燥，由此將引物置于孔中。同樣在這個(gè)步驟中，如上所述，置于孔中的物質(zhì)不限于引物?？商鎿Q地，該物質(zhì)可以是dNTP、酶或緩沖液溶質(zhì)，即，該物質(zhì)不同于用薄膜6覆蓋的物質(zhì)，該物質(zhì)對(duì)于反應(yīng)是所需的。滴入的引物溶液優(yōu)選通過(guò)真空干燥、冷凍干燥等緩慢干燥。實(shí)施例實(shí)施例11、用于核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的微芯片的制備(1)引物的固定對(duì)于模板核酸鏈，設(shè)計(jì)了表1中所示的用于LAMP的六種引物。接下來(lái)，將0.5yL的引物溶液滴入到設(shè)置在PDMS襯底中的孔中。這些引物通過(guò)真空干燥(室溫，0.lPa,5min)固定在孔中。表權(quán)利要求1.一種用于核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的微芯片，其中，對(duì)于核酸的等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)所需的物質(zhì)中的至少一種存在于充當(dāng)所述反應(yīng)的反應(yīng)場(chǎng)所的反應(yīng)區(qū)中，所述物質(zhì)中的至少一種利用在高于室溫且低于所述反應(yīng)的反應(yīng)溫度的溫度下發(fā)生熔化的薄膜覆蓋。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微芯片，其中，所述反應(yīng)所需的其他物質(zhì)中的至少一種固定在覆蓋所述反應(yīng)所需的物質(zhì)中的至少一種的所述薄膜上。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微芯片，其中，所述薄膜通過(guò)蒸著硬脂酸或固體石蠟而形成。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的微芯片，其中，所述反應(yīng)區(qū)中存在的所述物質(zhì)中的至少一種是選自寡核苷酸引物、酶和核酸單體中的至少一種。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的微芯片，其中，寡核酸引物被固定在覆蓋酶的所述薄膜上。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微芯片，其中，所述微芯片包括從外部向其內(nèi)引入液體的進(jìn)口；多個(gè)所述反應(yīng)區(qū)；以及構(gòu)造成將從所述進(jìn)口引入的所述液體供應(yīng)到所述反應(yīng)區(qū)的通道。7.—種制造用于核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的微芯片的方法，包括利用在高于室溫且低于核酸的等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)溫度的溫度下發(fā)生熔化的薄膜覆蓋對(duì)于所述反應(yīng)所需的物質(zhì)中的至少一種，所述物質(zhì)中的至少一種被放置在充當(dāng)所述反應(yīng)的反應(yīng)場(chǎng)所的反應(yīng)區(qū)中。8.—種核酸等溫?cái)U(kuò)增方法，包括向存在對(duì)于核酸的等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)所需的物質(zhì)中的至少一種的反應(yīng)區(qū)中引入所述反應(yīng)所需的其他物質(zhì)，所述物質(zhì)中的至少一種利用在高于室溫且低于所述反應(yīng)的反應(yīng)溫度的溫度下發(fā)生熔化的薄膜覆蓋；以及將所述溫度升高至所述反應(yīng)溫度。全文摘要本發(fā)明涉及用于核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的微芯片、制造其的方法以及核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)方法。更具體地，本發(fā)明提供一種用于核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的微芯片，其中對(duì)于核酸的等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)所需的物質(zhì)中的至少一種存在于充當(dāng)該反應(yīng)的反應(yīng)場(chǎng)所的反應(yīng)區(qū)中，該物質(zhì)中的至少一種利用在高于室溫且低于該反應(yīng)的反應(yīng)溫度的溫度下發(fā)生熔化的薄膜覆蓋。本發(fā)明提供了一種用于在等溫?cái)U(kuò)增方法中準(zhǔn)確控制反應(yīng)時(shí)間的技術(shù)。文檔編號(hào)C12M1/00GK102296023SQ201110161010公開(kāi)日2011年12月28日申請(qǐng)日期2011年6月15日優(yōu)先權(quán)日2010年6月22日發(fā)明者世取山翼,中村友彥,小島健介,渡邊英俊,瀨川雄司申請(qǐng)人:索尼公司