專(zhuān)利名稱(chēng)：一種四聯(lián)菌片的菌種的活菌數(shù)檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)方法，尤其是一種四聯(lián)菌片的菌種的活菌數(shù)檢測(cè)方法。屬于保健食品領(lǐng)域，具體涉及四聯(lián)菌片中長(zhǎng)雙歧桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌等益生菌的選擇性計(jì)數(shù)檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
健康有益的益生菌如嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌、干酪乳桿菌、嗜熱鏈球菌等被越來(lái)越多地添加到保健食品中，通過(guò)其中活菌的作用可以改善胃功能、調(diào)整腸道菌群、抑制病原菌的生長(zhǎng)、提高蛋白質(zhì)和維生素的代謝、防止便秘、緩解乳糖不耐癥、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫系統(tǒng)、 降低膽固醇等，從而促進(jìn)身體健康。為了確保此類(lèi)益生菌能在體內(nèi)發(fā)揮正常的生理保健功能，一些世界性的食品組織已經(jīng)提出標(biāo)準(zhǔn)，要求在食品中雙歧桿菌等益生菌的最低值為 IO6 107CFU/g。因此，研究簡(jiǎn)便易行的選擇性計(jì)數(shù)方法，加強(qiáng)此類(lèi)產(chǎn)品的監(jiān)控，對(duì)于提高產(chǎn)品質(zhì)量，保護(hù)消費(fèi)者的利益及健康，都具有極其重要的意義。如果產(chǎn)品中只有單一的菌株， 易于計(jì)數(shù)，至于兩株及兩株以上的益生菌混合在保健產(chǎn)品中時(shí)分別計(jì)出活菌數(shù)比較困難， 需要通過(guò)了解不同菌株的生理特性來(lái)選擇鑒別培養(yǎng)基再進(jìn)行計(jì)數(shù)。國(guó)內(nèi)外關(guān)于微生物選擇性計(jì)數(shù)的研究主要集中在培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)上，即利用選擇性培養(yǎng)基，使益生菌表現(xiàn)出易于鑒別特征，便于區(qū)分計(jì)數(shù)。這些選擇性鑒別培養(yǎng)基抑制其它菌的生長(zhǎng)或者通過(guò)在此培養(yǎng)基上形成菌落的形態(tài)、大小及顏色易與其他菌區(qū)別，從而可單獨(dú)的計(jì)數(shù)出目標(biāo)菌株的活菌數(shù)。細(xì)菌計(jì)數(shù)常規(guī)用的方法主要有涂布法和傾注法，應(yīng)用于乳酸菌計(jì)數(shù)，二者結(jié)果無(wú)差異，但涂布法由于菌落生長(zhǎng)在平板表面，易于從形態(tài)上辨認(rèn)和挑取菌落進(jìn)行進(jìn)一步分離和鑒定，提高計(jì)數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確度，更真實(shí)反映樣品中的乳酸菌數(shù)量。目前已有一些關(guān)于混合菌乳制品的選擇性計(jì)數(shù)方法。1978年Teraguch i等將新霉素-巴龍霉素-萘啶酮酸-氯化鋰培養(yǎng)基(NNLP培養(yǎng)基)用于雙歧桿菌的選擇計(jì)數(shù)，該培養(yǎng)基在后來(lái)雙歧桿菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的發(fā)展中一直作為一種參考培養(yǎng)基。Lap ierre等的LP 培養(yǎng)基，Chevalier等的改良MRS培養(yǎng)基均用于雙歧桿菌的選擇性計(jì)數(shù)；呂嘉櫪等人研究的 MRS-柳醇瓊脂或MRS-山梨醇瓊脂、添加麥芽糖的MRS-IM培養(yǎng)基，MRS-氯潔霉素用于嗜酸乳桿菌的選擇性計(jì)數(shù)；MRS-萬(wàn)古霉素、LC培養(yǎng)基選擇性計(jì)數(shù)干酪乳桿菌；ST培養(yǎng)基、M17培養(yǎng)基選擇性計(jì)數(shù)嗜熱鏈球菌。這些培養(yǎng)基雖然可以選擇性計(jì)數(shù)混合益生菌，但由于菌種的差異性，這些培養(yǎng)基不一定適合于所有的菌株的選擇性計(jì)數(shù)，而且有些培養(yǎng)基不具有很好的鑒別性，有些培養(yǎng)基配制繁瑣成本高，所以有待于更簡(jiǎn)便的選擇性計(jì)數(shù)培養(yǎng)基可以準(zhǔn)確的計(jì)數(shù)這些益生菌。本發(fā)明為了對(duì)四聯(lián)菌片等保健食品中的不同益生菌包括長(zhǎng)雙歧桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌等分別進(jìn)行可靠計(jì)數(shù)，研制和開(kāi)發(fā)出簡(jiǎn)便、成本低、計(jì)數(shù)效果顯著的鑒別性培養(yǎng)基。技術(shù)方案本發(fā)明的目的在于提供四聯(lián)菌片中長(zhǎng)雙歧桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈
4球菌等益生菌的選擇性計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法本發(fā)明是采用三種不同培養(yǎng)基對(duì)四聯(lián)菌片中的不同的四株益生菌(長(zhǎng)雙歧桿菌、 干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌)進(jìn)行計(jì)數(shù)。長(zhǎng)雙歧桿菌活菌數(shù)的檢測(cè)是通過(guò)在培養(yǎng)基中添加抗生素或其他試劑，使得培養(yǎng)基對(duì)其他益生菌有一定程度的抑制作用，而對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌抑制作用很小或沒(méi)有抑制作用。干酪乳桿菌和嗜酸乳桿菌的活菌數(shù)檢測(cè)采用了 MRS 培養(yǎng)基，需氧培養(yǎng)。在此培養(yǎng)基上需氧條件下培養(yǎng)42-50h只有干酪乳桿菌和嗜酸乳桿菌生長(zhǎng)，且可以通過(guò)菌落形態(tài)的不同，能分辨出這兩株菌。本發(fā)明是提供了四聯(lián)菌片的選擇性計(jì)數(shù)檢測(cè)方法，其特點(diǎn)在于培養(yǎng)基中添加抗生素抑制其它菌或通過(guò)菌落形態(tài)分辨出目標(biāo)菌株。其中檢測(cè)培養(yǎng)基有雙歧桿菌檢測(cè)培養(yǎng)基、 干酪乳桿菌和嗜酸乳桿菌檢測(cè)培養(yǎng)基、嗜熱鏈球菌檢測(cè)培養(yǎng)基。本發(fā)明的一種四聯(lián)菌片的菌種的活菌數(shù)檢測(cè)方法，其中，分別用雙歧桿菌篩選培養(yǎng)基、干酪乳桿菌和嗜酸乳桿菌篩選培養(yǎng)基、嗜熱鏈球菌篩選培養(yǎng)基對(duì)處理過(guò)的四聯(lián)菌片進(jìn)行培養(yǎng)，并進(jìn)行計(jì)數(shù)；其中，雙歧桿菌篩選培養(yǎng)基中添加抗菌素；雙歧桿菌篩選培養(yǎng)基在厭氧條件下使用；干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌和嗜熱鏈球菌篩選培養(yǎng)基需在需氧條件下使用。其中，利用培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)的四聯(lián)菌片包括均具有菌種活性的四聯(lián)菌片和非定向檢測(cè)的菌失活的四聯(lián)菌片。上述的抗菌素為濃度為0. 1-0. 3mg/mL的牛膽鹽溶液和濃度為12-18 μ g/mL的硫酸慶大霉素。其中雙歧桿菌檢測(cè)培養(yǎng)基的配方為
其中培養(yǎng)基的配方組份的重量份為
蛋白胨6. 0-12. Og,
胰胨6. 0-12. Og,
大豆胨2. 0-5. Og,
酵母粉1. 0-3. Og,
牛肉粉2. 0-5. Og,
牛肝粉2. 0-5. Og,
葡萄糖5-20g，
可溶性淀粉0. 2-0. 8g,
磷酸氫二鉀0. 5-2g，
磷酸二氫鉀0. 5-2g，
硫酸鎂0. 1-0. 3g,
硫酸亞鐵0. 01-0. 03g,
L-半胱氨酸0. 2-0. 6g,
硫酸錳0. 001-0. 002g,
吐溫800. 5-2. Og,
瓊脂15.0-20g。
添加抗菌素牛膽鹽和硫酸慶大霉素大霉素終濃度12-18 μ g/mL，培養(yǎng)基的處理方法和使用條件為滅菌114-116°C，15-20min，
pH7. 2-7. 4士0. 1。其中士0. 1為可接受的誤差范圍。 干酪乳桿菌和嗜酸乳桿菌篩選培養(yǎng)基組份的重量份為
蛋白胨牛肉粉酵母粉葡萄糖吐溫80
5-20g， 4_8g， 4_8g， 10-30g, 0. 5-1. 5mL,
K2HPO3
7H20(即，磷酸氫二鉀(7H20)) CH3COONa · 3H20(即，乙酸鈉(3H20))
檸檬酸三銨
MgSO4 · 7H20(即，硫酸鎂(7H20)) MnSO4 · 4H20(即，硫酸錳(4H20))
1.0-3. 0g,
2.0-6. 0g, 1. 0-3. 0g,
0. 1-0. 3g, 0. 03-0. 06g,
瓊脂
15. 0-20g,
蒸餾水1000mL。
上述的培養(yǎng)基的處理方法和使用條件為滅菌120-122°C，15-17min ；pH6. 4-6. 6，
考慮到誤差，可將pH 6. 4-6. 6表示為pH 6. 4-6. 6士0. 1。士0. 1為誤差。
嗜熱鏈球菌培養(yǎng)基培養(yǎng)基的配方組份的重量份為
大豆蛋白胨
牛肉粉
酵母粉
葡萄糖
乳糖
碳酸鈣
瓊脂
中性紅
蒸餾水
3-6g 2-5g 2-5g
10-30g
10-3 Og
5-15g
15-20g
0.04-0.06g
IOOOmL0上述的培養(yǎng)基的處理方法和使用條件為滅菌120-122 °C，15-17min ρΗ6· 2-6. 4 士 0· 2。本發(fā)明所述方法詳述如下1、主要設(shè)備恒溫培養(yǎng)箱36 °C 士 1 °C恒溫水浴鍋46 °C 士 1 °C
厭氧培養(yǎng)裝置厭氧罐電子天平感量0. OOlg無(wú)菌錐形瓶500mL無(wú)菌平皿直徑90mm無(wú)菌試管(含塞子)15mmX 150mm移液槍(含滅菌槍頭)100 μ L，ImL濾菌器直徑0.45 μ m微型旋渦混勻器、搖床等。2、培養(yǎng)基和試劑雙歧桿菌檢測(cè)培養(yǎng)基；干酪乳桿菌和嗜酸乳桿菌檢測(cè)培養(yǎng)基嗜熱鏈球菌檢測(cè)培養(yǎng)基；PBS溶液。3、抗菌素牛膽鹽溶液終濃度為0. 1-0. 3mg/mL硫酸慶大霉素終濃度為12-18 μ g/mL。4、按GB/T 4789. ；35-2008食品中乳酸菌檢驗(yàn)、GB/T 4789. ；34_2008雙歧桿菌檢驗(yàn)的操作步驟和菌種鑒定方法進(jìn)行檢測(cè)。5、三種培養(yǎng)基對(duì)四聯(lián)菌片的選擇性計(jì)數(shù)結(jié)果表明，雙歧桿菌檢測(cè)培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)條件下只能選擇性計(jì)數(shù)雙歧桿菌，其它三株菌都被抑制，對(duì)于雙歧桿菌生長(zhǎng)幾乎沒(méi)有抑制作用。在干酪乳桿菌和嗜酸乳桿菌培養(yǎng)基需氧培養(yǎng)條件下有干酪乳桿菌和嗜酸乳桿菌生長(zhǎng)，因此這兩株菌的菌落形態(tài)差異較顯著，所以通過(guò)菌落形態(tài)易于分辨。嗜熱鏈球菌培養(yǎng)基需氧培養(yǎng)條件下抑制其它三株菌，只有嗜熱鏈球菌生長(zhǎng)。本發(fā)明所述的四聯(lián)菌片的選擇性計(jì)數(shù)方法，具有很好的鑒別性。能夠完成四聯(lián)菌片中長(zhǎng)雙歧桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌等益生菌的選擇性計(jì)數(shù)；方法簡(jiǎn)便， 結(jié)果準(zhǔn)確可靠，這些培養(yǎng)基相對(duì)于MRS-NNLP培養(yǎng)基、M17培養(yǎng)基成本低，配置簡(jiǎn)便，不僅節(jié)約成本而且大大降低了工作量。例如，測(cè)嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌活菌數(shù)時(shí)，其中，嗜酸乳桿菌(NM)和干酪乳桿菌(LC)在檢測(cè)培養(yǎng)基上35-38°C需氧培養(yǎng)42-50h后的菌落形態(tài)不同。對(duì)于嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌在混合菌中的計(jì)數(shù)使用MRS培養(yǎng)基，并在有氧的條件下進(jìn)行培養(yǎng)42-50h，通過(guò)菌落形態(tài)來(lái)進(jìn)行分辨這兩株菌。嗜酸乳桿菌在檢測(cè)培養(yǎng)基上形成不規(guī)則形狀，不凸起，不濕潤(rùn)，白色或者透明色小菌落；干酪乳桿菌在檢測(cè)培養(yǎng)基上形成有規(guī)則的圓形，隆起，濕潤(rùn)，光滑的乳白色大菌落。又例如，雙歧桿菌活菌數(shù)的檢測(cè)，其中，雙歧桿菌在雙歧桿菌檢測(cè)培養(yǎng)基上 35-38°C厭氧培養(yǎng)7 后的菌落形態(tài)為，在雙歧桿菌檢測(cè)培養(yǎng)基上厭氧培養(yǎng)48-7池，長(zhǎng)雙歧桿菌生長(zhǎng)。長(zhǎng)雙歧桿菌在雙歧桿菌檢測(cè)培養(yǎng)基上形成乳白色圓的隆起的小菌落。又例如，嗜熱鏈球菌活菌數(shù)檢測(cè)，其中，在嗜熱鏈球菌培養(yǎng)基上需氧培養(yǎng)18-2他， 有嗜熱鏈球菌生長(zhǎng)。在培養(yǎng)基上清晰可見(jiàn)紅色圓形小菌落為嗜熱鏈球菌。干酪乳桿菌在此培養(yǎng)基上也生長(zhǎng)，但是很難看清，將平皿傾斜才能看見(jiàn)透明狀，模糊的小菌落，所以干酪乳桿菌在嗜熱鏈球菌培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)對(duì)于嗜熱鏈球菌的計(jì)數(shù)毫無(wú)影響。本發(fā)明檢測(cè)方法中涉及菌種的分類(lèi)學(xué)特征和其他形態(tài)學(xué)特征公開(kāi)如下
7
長(zhǎng)雙歧桿菌(BB20071001)，為分離自?xún)?nèi)蒙古地區(qū)健康人體腸道，篩選出適合人體之菌株，該長(zhǎng)雙歧桿菌已于2010年12月14日在國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定專(zhuān)利微生物保藏中心保藏，保藏號(hào)為CGMCC No. 4470。樣品的采集與保存內(nèi)蒙古錫盟西烏珠穆沁旗12名健康兒童，男女各6名，年齡 3 5歲，均無(wú)胃腸病史，采樣前兩周內(nèi)未服用任何抗菌類(lèi)藥物。用無(wú)菌玻璃棒挑取自然排出的新鮮糞便5 10g，置入無(wú)菌平皿中，迅速放入?yún)捬豕拗?，帶回?shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離。菌株篩選1、菌株的分離純化與保存取厭氧凍存的樣品3g加入有玻璃珠的三角瓶中，加入30mLPBS稀釋液搖床振蕩 (250rpm) 15min，然后吸取ImL便液加入一支裝有9mLPBS稀釋液的試管中，漩渦混勻，作為 ΙΟ"2稀釋液，同樣方法稀釋至10_4。取厭氧罐中充分預(yù)厭氧的TPY固體平板，將糞便原液、10_2稀釋液、10_3稀釋液、 10_4稀釋液各取0. lmL，均勻涂布平板，置厭氧罐中37°C厭氧培養(yǎng)Mh。在選擇性TPY培養(yǎng)基上，雙歧桿菌的菌落特征較為典型，易與其它菌落區(qū)分開(kāi)來(lái)。 雙歧桿菌的菌落一般為光滑，凸圓，邊緣完整，顏色呈乳褐色或乳白色，直徑2-5mm，具有這些形態(tài)特征的菌落被認(rèn)為是雙歧桿菌可疑菌落，進(jìn)一步分離純化得到雙岐桿菌純菌株。將雙歧桿菌純菌株擴(kuò)培后用PBS離心洗滌兩遍后，懸于保護(hù)劑(12%脫脂乳 +0.1%谷氨酸鈉)中，真空冷凍干燥，-18°c保存。2、雙歧桿菌的人工胃液耐受性篩選試驗(yàn)結(jié)果將供試菌株接入pH 2. 0、pH 2. 5、pH 3. 0人工胃液中，37°C厭氧培養(yǎng)汕對(duì)其進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，并計(jì)算存活率。結(jié)果看出，不同菌株在不同pH的人工胃液中耐受性有顯著差異 (P < 0. 01)。菌株對(duì)人工胃液耐受性隨pH降低而降低，其中長(zhǎng)雙歧桿菌對(duì)人工胃液耐受性最強(qiáng)，在pH2. 0人工胃液中37°C厭氧保溫池后存活率達(dá)到92. 4%，而其它10株菌在此條件下的存活率均小于31. 25%，說(shuō)明這10株菌對(duì)模擬胃液特別敏感，沒(méi)有進(jìn)一步篩選的價(jià)值，所以?xún)H選擇具有良好耐酸特性的長(zhǎng)雙歧桿菌作為進(jìn)一步試驗(yàn)的對(duì)象。3、長(zhǎng)雙歧桿菌對(duì)pH 8. 0人工腸液的耐受結(jié)果將具有良好耐酸特性的長(zhǎng)雙歧桿菌在pH2.0的人工胃液中厭氧消化池后，接入 PH8. 0的人工腸液中繼續(xù)37°C厭氧保溫消化，分別在不同時(shí)間取樣計(jì)數(shù)并計(jì)算其存活率， 結(jié)果可以看出，長(zhǎng)雙歧桿菌在PH8.0的人工腸液中37°C厭氧保溫他后，活菌數(shù)與存活率均無(wú)明顯差異(P < 0. 05)，該菌株具有良好的耐受腸液特性。分離至兒童糞便中的雙歧桿菌的鑒定結(jié)果1、形態(tài)及菌落特征G+，菌體長(zhǎng)而彎曲，棍棒狀，膨脹或啞鈴形的桿菌可分叉，菌落一般為光滑，凸圓， 邊緣完整，顏色呈乳褐色或乳白色，直徑2-5mm。2、生理生化學(xué)特性，見(jiàn)表1表1雙歧桿菌的生理生化鑒定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種四聯(lián)菌片的菌種的活菌數(shù)檢測(cè)方法，其特征在于分別用雙歧桿菌篩選培養(yǎng)基、干酪乳桿菌和嗜酸乳桿菌篩選培養(yǎng)基、嗜熱鏈球菌篩選培養(yǎng)基對(duì)處理過(guò)的四聯(lián)菌片進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)行計(jì)數(shù)； 其中，雙歧桿菌篩選培養(yǎng)基中添加抗菌素； 雙歧桿菌篩選培養(yǎng)基在厭氧條件下使用；干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌和嗜熱鏈球菌篩選培養(yǎng)基均需在需氧條件下使用。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于利用培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)的四聯(lián)菌片包括均具有菌種活性的四聯(lián)菌片和非定向檢測(cè)的菌失活的四聯(lián)菌片。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的抗菌素濃度為0.1-0. 3mg/mL的牛膽鹽溶液和濃度為12-18 μ g/mL的硫酸慶大霉素。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的雙歧桿菌篩選培養(yǎng)基組份的重量份的比例為，蛋白胨胰胨大豆胨酵母粉牛肉粉牛肝粉葡萄糖可溶性淀粉磷酸氫二鉀磷酸二氫鉀硫酸鎂硫酸亞鐵L-半胱氨酸硫酸錳吐溫6. 0-12. Og, 6. 0-12. Og, 2. 0-5. Og,1.0-3. Og,2.0-5. Og, 2. 0-5. Og,5-20g， 0. 2-0. 8g, 0. 5-2g， 0. 5-2g， 0. 1-0. 3g, 0. 01-0. 03g, 0. 2-0. 6g, 0. 001-0. 002g, 800. 5-2. Og, 15.0-20g。瓊脂
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述的培養(yǎng)基的處理方法和使用條件為，滅菌 114-116°C, 15-20min, pH 7. 2-7. 4。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的干酪乳桿菌和嗜酸乳桿菌篩選培養(yǎng)基組份的重量份為，蛋白胨牛肉粉酵母粉葡萄糖吐溫80K2HPO37H20CH3COONa3H905-20g， 4-8g, 4-8g, 10-30g, 0. 5-1. 5mL,1.0-3. Og,2.0-6. Og,
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述的培養(yǎng)基的處理方法和使用條件為，滅菌 120-122°C, 15-17min ；pH 6. 4-6. 6。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的嗜熱鏈球菌篩選培養(yǎng)基組份的重量份為，
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述的培養(yǎng)基的處理方法和使用條件為，滅菌 120-122°C, 15-17min ；pH 6. 2-6. 4。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)方法，尤其是一種四聯(lián)菌片的菌種的活菌數(shù)檢測(cè)方法，屬于保健食品領(lǐng)域；本發(fā)明的四聯(lián)菌片的菌種的活菌數(shù)檢測(cè)方法，其中，分別用雙歧桿菌篩選培養(yǎng)基、干酪乳桿菌和嗜酸乳桿菌篩選培養(yǎng)基、嗜熱鏈球菌篩選培養(yǎng)基對(duì)處理過(guò)的四聯(lián)菌片進(jìn)行培養(yǎng)，并進(jìn)行計(jì)數(shù)；雙歧桿菌篩選培養(yǎng)基中添加抗菌素；雙歧桿菌篩選培養(yǎng)基在厭氧條件下使用；干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌和嗜熱鏈球菌篩選培養(yǎng)基均需在需氧條件下使用；本發(fā)明所述的四聯(lián)菌片的選擇性計(jì)數(shù)方法，具有很好的鑒別性；能夠完成四聯(lián)菌片中長(zhǎng)雙歧桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌等益生菌的選擇性計(jì)數(shù)；方法簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
文檔編號(hào)C12Q1/06GK102242184SQ20111016135
公開(kāi)日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2011年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月16日
發(fā)明者劉偉學(xué), 孫潔宇, 張昊敏, 李巖巖, 梁春梅, 米蘭, 高杰, 高鵬飛 申請(qǐng)人:高杰